단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

요약

단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

초록

우리는 여기에서 대장균에서 생체 내 단백질 복합체의 발현이 기존의 체외 재구성 실험보다 더 편리할 수 있음을 보고합니다. 특히, 동일한 단백질이 α 및 θ 소단위체(각각 DNA 중합효소 활성 및 안정화 ε 특징)와 동시 발현될 때 Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit(3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 특징으로 함)의 낮은 용해도가 크게 개선됨을 보여줍니다. 우리는 또한 E. coli의 단백질 공동 발현이 기능적 단백질 복합체와 결합하기 위해 서로 다른 박테리아 종의 subunit의 능력을 효율적으로 테스트하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 실제로 Deinococcus radiodurans DNA polymerase III의 α subunit이 E. coli의 ε subunit과 in vivo에서 공동 발현될 수 있음을 보여줍니다. 또한, 우리는 대장균의 돌연변이 빈도를 조절하기 위한 단백질 동시 발현의 사용에 대해 보고합니다. araBAD promoter(arabinose-inducible)의 제어 하에 야생형 ε subunit을 발현하고, lac promoter(isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG에 의해 유도가능)의 제어 하에 동일한 단백질의 돌연변이 유발 D12A 변이체를 동시 발현함으로써, 우리는 유도 인자인 arabinose 및 IPTG의 적절한 농도를 사용하여 E. coli 돌연변이 빈도를 변경할 수 있었습니다. 마지막으로, 대장균에서 단백질 공동 발현의 최근 발전과 향후 과제에 대해 논의합니다.

서론

과발현 기술의 도입은 낮은 카피 수 효소의 생화학 적 연구와 약리학 적 활성 단백질 (예를 들면, 인슐린)의 산업 생산를 부스팅. 이러한 기술의 출현 때문에 상당한 진보는 재조합 단백질의 수율 및 품질을 증가시키기 위해 달성되어왔다. 또한, 원핵 및 진핵 ^{3 1,2-} 과발현 시스템은 단백질 공학, 즉, 대장균 "일꾼"유용한 대안을 제공 년에 걸쳐 개발되었다. E. 대안 플랫폼 특히, 가용성 대장균 재조합 펩타이드 또는 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 제조되었다. 그러나, 언급되어야 E. 대장균은 여전히 재조합 단백질 생산을위한 선택의 유기체를 나타냅니다. 이 가장 관련성이있을 수있는 여러 요소 중에서,에 기인고려 : ⅰ) 과발현 시스템 (발현 벡터 및 균주 확실히 다수의 가능 여부)을위한 E. 대장균 ^1,2; E. II의) 짧은 생성 시간 및 높은 수율의 바이오 매스, 풍부하고 합성 다양한 미디어에서 대장균; ⅲ) 생화학에서이 미생물의 유전자 수준에서 어느 손쉬운 조작; ⅳ) ⁴ 독성 단백질의 생산이 가능한 균주의 분리; V) 인구 레벨 ^5,6에 균일 유도를 갖춘 균주의 건설. 또한,....

프로토콜

E. 1. 분리 대장균 공동 형질 전환

1. 해당 E.의 전기 유능한 세포를 준비 대장균 균주를 변환 할 수 있습니다. LB 배지 1 ㎖ (트립 톤, 효모 추출물, (10)에서의 NaCl, 5, 10g / 각각 L,) 선택의 변형의 단일 식민지, 그리고로 전송 180 rpm으로 진탕 조건에서 37 ° C에서 배양한다. 사전 문화 (1) 희석 : 500 신선한 LB 배지 m​​l의 25에서 37 ° C에서 문화를 품다.
2. 로그 상 (0.6 OD)에서 20 분 동안 5,000 XG)에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 원래 문화 볼륨의 절반에 10 %, v / V를 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤 물에 펠렛을 재현 탁. 마다 부유 양을 절반으로,이 단계를 4 회 반복한다. 마지막으로, 글리세롤 / 물에 펠렛을 재현 탁하고 50 ㎕의 분취 액에 세포 현탁액을 나눈다. 6개월에 -80 ° C 최대의 분량을 저장합니다.
3. 0.5 mM의 EDTA 보충 멸균에서 원하는 플라스미드를 녹여. IC에 해동전자 전기 - 반응성 세포의 분취 량과 벡터의 적절한 양 (2.5-5 NG)와 혼합한다. 전기에 적합한 0.1 cm 큐벳에 혼합물을 분배하고, 1.8 kV의 적용.
4. 즉시 SOC 배지 1....

결과

E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 243 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 잔류 187-243 ^(17)을 삭제하지 않는 한, 용성 ^{(17, 18)을} 갖추고 있습니다. 그러나, 우리는 이전에 전체 길이 α, ε, 및 θ 서브 유니트의 공동 발현이 수용성 DNA 폴리머 라제를 촉매 III 코어 (도 1)을 수득 ¹¹ 것을 보여 주었다. ⅰ) α와 ε 소단위의 과발현은 독립적 아라비 노스 및 IPTG 각각 (도 1a)에 의해 제어 될 수있다 : 특히, pBAD-PGOOD 공동 발현 시스템을 사용하여, 우리는 것을 증명 ⅱ) 전체 길이 ε 소단위는 E.로부터 단리 가용성 단백질 추출물에서 검출 될 수있다 대장균 세포는 ε, α의 과발현, 및 θ 및 겔 여과 (도 1b)을 실시. 이 경우, 엑소 뉴 클레아.......

토론

단백질은 그 차 구조 배좌 ^(25)의 제한된 수의 제한되지 않은 영역을 갖춘, 무질서 본질적 일 수있다. 이들 무질서 화 된 단백질은 통상 ²⁵ 응집 경향이며, 그들의 분리 및 특성 규명은 어려운 작업을 나타낼 수도있다. E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 두 가지 영역, 즉 ^{(26, 27)를} 특징 : I) N-터 도메인, θ 서브 유닛을 바인딩에 3'-5 '엑소 뉴 클레아 제 활성을 베어링, 유능한; ⅱ) C-터 도메인, α (중합 효소) 서브 유닛에 결합에 대한 책임. ε의 C-터 도메인은 그것의 응집을 촉진,이 단백질에 대한 난 용성을 부여하는 것으로 알려져있다. 이것은 실제로 ε-186, C-터 도메인이 결여 된 단백질의 절단 된 형태는 수용성이고, 높은 수율 ^17로 정제 할 수 있음을 입증 하였다. 그러나, 양적으로 공부 될 α와 ε의 상호 작용이 때(예 αε 복.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	시그마-알드리치	A1296
암피실린	, 시그마-알드리치,	A9518
클로로포름	, 시그마-알드리치	288306
EDTA	, 시그마-알드리치	, EDS,
글리세롤	, 시그마-알드리치	G5516
INT	시그마-알드리치	I8377
IPTG	시그마-알드리치	I5502
KCl	, 시그마-알드리치	P9541
L-아라비노스	시그마-알드리치	A3256
MgCl2	시그마-알드리치	M2670
NaCl	시그마-알드리치	31434
PMSF	, 시그마-알드리치	P7626
PNP-글루크	시그마-알드리치	N7006
pNP-TMP	시그마-알드리치	T0251
테트라사이클린	시그마-알드리치	87128
트리즈마 베이스	시그마-알드리치	T1503
트립톤	시그마-알드리치	95039
효모 추출물	Fluka	70161
아크릴아미드 용액 30%	BioRad	161-0158	젤 전기영동용
암모늄 퍼솔페이트	BioRad	161-0700	젤 전기영동용
글리신	BioRad	161-0718	젤용 전기영
SDS	BioRad	161-0302	겔 전기영동용
TEMED	BioRad	161-0800	겔 전기영동용
Tris	BioRad	161-0719	겔 전기영
큐벳 0.1 cm	BioRad	1652089	전기천공용
원심분리기 5415R	Eppendorf
원심분리기 Allegra 21R	Beckman
크로마토그래피 장치 GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
초음파 발생기 3000	Misonix

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