전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

요약

엑소좀은 생체 유체 내에서 발견되는 미세소포 구조로, 잠재적으로 중요한 질병 차별적 바이오마커를 운반할 수 있습니다. 여기에서는 비균일 전기순환 구형파를 사용하여 엑소좀이 파괴된 후 엑소좀을 특이적으로 추출하고 RNA/단백질 표적 모두에 대한 엑소좀 화물을 신속하게 테스트하기 위한 새로운 방법을 사용합니다.

초록

엑소 좀은 세포 간 의사 소통의 매개 역할을 microvesicular 구조입니다. 그것은 그들이 질병 차별적 인 바이오 마커를 가지고 있는지 확인 엑소 좀의 내부화물을 연구하는 관심입니다. exosomal 분석을 수행하기위한, 그것을 추출하여 내부 콘텐츠를 손상시키지 않고 타겟 biofluids에서 엑소 좀을 분석하기위한 방법을 개발하는 것이 필요하다.

전계 방출 유도 및 측정 (EFIRM)는 구체적 biofluids에서 엑소 좀을 추출 그들의화물을 하역하고, 내부 RNA / 단백질 함량을 테스트하기위한 방법이다. 항 인간 CD63에 특이적인 항체를 사용하여 자성 미립자, 엑소 좀은 제 biofluids으로부터 침전된다. 다음 추출, 저전압 전기 순환 구형파 (CSW)는 기공을 막 중단 및화물 하역의 원인에 적용됩니다. 엑소 좀의 함유량 ...로서 대한 전극 표면에 고정화 DNA 프라이머 또는 혼성화 항체분자 내용의 ntification.

EFIRM 방법은 용해 완충액없이 분석 엑소 좀의 추출 및 언화물 유리하다. 이 방법은 엑소 모두 RNA와 단백질의 특이 표적 바이오 마커 검출을 수행 할 수있다. 크기 기반의 기술과 반대로 EFIRM 특히 그 표면 마커에 기초하여 엑소 좀을 추출한다.

투과 전자 현미경 (TEM) 분석은 엑소 및 캡쳐 및 분석을위한 방법의 기능을 설명한다. EFIRM 방법은 인간 폐암 H640 세포를 주입 구 마우스의 분석 식염수 컨트롤을 수신 (11) 쥐에 대해 자신의 엑소 프로파일을 테스트하기 위해 (엑소 마커 인간 CD63-GFP를 발현하는 형질 감염된 세포주) exosomal 도포 하였다. exosomal 바이오 마커의 상승 된 레벨 (참고 GAPDH 유전자 및 단백질 표면 마커 인간 CD63-GFP)는 H640 모두 혈청 및 타액 샘플 주입을 위해 쥐를 발견 하였다. 또한, SalI로버지니아 및 혈청 샘플은 선형성 (R = 0.79)가 입증되었다. 이러한 결과는 말초 질환의 검출을위한 타액 엑소 바이오 마커의 실행 가능성에 대한 암시이다.

서론

엑소 조사 RNA ^{1, 2} DNA 및 단백질 ^3화물을 운반 지질 마이크로 소포를 검사 조사의 새로운 분야입니다. 엑소 생물학의 이전 조사는 혈액 ^4, 소변 ^5, 모유 ^6, 침 ^7로 biofluids에서 엑소 좀의 식별을 주도했다. 연구는 원격으로 본체 ^(8)의 서로 다른 시스템 간의 통신을 명상, 엑소 좀 다른 세포질 통로에 역할을한다는 것을 증명하고있다. 역할의 엑소 좀은 세포 간 통신에서 재생하기 때문에, 그들이 질병 상태와 상관 생체 분자 표적 (단백질, RNA 및 DNA)를 패키지 가설이 성립된다. 시험관 ³ 및 동물 모델 ⁽⁹⁾ 연구는이 가설을 확증하기 위해 나타납니다. 바이오 마커 발견에 대한 콘텐츠를 조사 exosomal, 그것은 선택적 엑소 biofluids로부터 격리를위한 방법론을 개발하는 것이 필요하다, 유도 expulsi엑소 좀에서화물 및 엑소 생체 분자의 정량에. 이 일의 범위에서, 엑소 좀은 구조가 약 70 ~ 100 nm의 직경을 갖는 표면 마커 CD63을 갖는 것으로 정의한다.

연구진은 일반적으로 첫 번째 초 원심 분리 <....

프로토콜

1. 자기 비드 기반 엑소 추출

1. 비드를 재현 탁하는 마이크로 원심 분리 튜브에 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 완충액 495 ㎕를 스트렙 타비 딘으로 코팅 된 자성 미립자의 5 μL의 혼합 된 용액을 피펫. 자기 랙을 사용하여 세 번 세척하고 PBS 500 μL와 구슬을 재현 탁. 랙 샘플 튜브를 마이크로 원심 수납 할 하우징 유닛의 측면에 자석의 배열이다.
   1. 각각의 세척을 위해, 먼저 튜브 1 분 동안 선반에 앉아서 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 뜨는 버퍼를 제거하기 위해 피펫 팁을 사용하자.
   2. 측면에 자석이없는 일반 랙에 튜브를 놓습니다. 튜브에 PBS의 500 μl를 추가하고 함께 해결책과 구슬을 혼합하는 피펫을 사용합니다. 다시 용액으로부터 비드를 분리하는 자기 선반에 다시 넣어 튜브.
   3. PBS의 자화 및 재 부유를 통해 버퍼의이 제거를 수행합니다3 회 총. 이 자성 입자의 초기 세척을 수행한다.
2. 자기 랙의 비자 성 부분 상에 배치 된 튜브, PBS 완충액 490 μL로 비드를 재현 탁. 피펫 구슬의 혼합물에 1.0 ㎎ / ㎖ 농도의 스톡 오티 닐화 마우스 항 인간 CD63 항체 5 μL. 용액에 구슬과 항체를 혼합하는 피펫을 사용합니다.
3. 샘플 회에 구슬과 비오....

결과

TEM을 사용하여 구슬의 엑소 캡처의 검증

항 인간 CD63 자성 비드를 이용하여 타액에서 엑소 좀의 분리는 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 이용하여 추출 프로토콜 다음 검증 하였다. TEM은 엑소 좀의 알려진 프로파일과 일치 바로 인접 (도 3a를 참조하고, 3B) 70 ~ 100 나노 입자와 자성 비드를 보여줍니다. 아니 70 ~ 100 nm의 과립은 이전에 그들에게 결합 항 - 인간 CD63 항체가 (그림 3C 및 3D 참조)하지 않은 타액의 자기 구슬 관찰되지 않았다.

토론

결과가 나타내는 바와 같이, 항 인간 CD63 코팅 된 자성 나노 입자는 특히 70 ~ 100 nm의 범위의 크기를 갖는 작은 입자를 포착 할 수있다. 이 캡처 된 입자는 엑소 좀 이전에 관찰 된 프로파일과 일치한다. 또한, 입자의 캡처 다음 저전압 CSW의 사용은 비드 표면에서 제거화물 릴리스 전통적인 용해 완충액 기반 방법과 동일한 DNA 분해 프로파일을 일으키는 것으로 도시되어있다. 이 데이터는 exosomal화물 릴리스의 워크 플로가 엑소의 지질막의 중단에 대한주기적인 구형파의 응용 프로그램을 통해 간단하게 할 수 있음을 나타냅니다. 상기 간단한 방법은 악영향 엑소화물에 영향을 미칠 수있는 버퍼를 용해시키기위한 필요없이 급속화물 방출을 허용하고, 그 결과 EFIRM 방법은 초 원심 분리 및 분해의 사용 전통적인 방법에 비해 exosomal 콘텐츠 연구 바람직한 방법이 될 것으로 보인다버퍼. EFIRM 방법의 민감도, 특이도, 쉽게는 핵산과 단백질 목표도 내부 콘텐츠를 테스트 신속하게 체액에서 엑소 좀을 추출에 이상적이다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Helios 16채널 리더 시스템(칩 인터페이스 포함)	유전유체학, 미국	RS-1000-16
16x 센서 칩, 베어 골드, 5개 칩 팩	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
비오틴화 항인간 CD63 항체	Ancell, 미국	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, 미국	65601
네오디늄 마그네틱스(1/10" 직경 x 1/32" 두께)	K& J Magnetics, 미국	DH101
초순수 증류수	Life Technologies, 미국	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl 솔루션	Fisher Scientific, 미국	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, 미국	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, 독일	11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, USA	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, 미국	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532