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방법 논문

글리코시다아제 활성의 검출을 위한 인독실-배당체의 합성

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52442

⸱

2015년 5월 27일

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

이 논문에서

요약

인독실 배당체는 효소 스크리닝 및 효소 활성 모니터링을 위해 잘 정립되고 널리 사용되는 도구입니다. 특히 포도당 유형 구조의 경우 이전 합성은 까다롭고 수율이 낮은 것으로 판명되었습니다. 당사의 새로운 접근법은 인독실산 에스테르를 귀중한 중간체로 사용하여 상당한 수의 인독실 배당체를 좋은 수율로 산출합니다.

초록

인독실 배당체는 글리코시다아제 활성을 모니터링하기 위한 가치 있고 다재다능한 도구임이 입증되었습니다. 인독실은 효소 가수분해에 의해 방출되며 예를 들어 대기 산소에 의해 인디고 유형 염료로 빠르게 산화됩니다. 이 반응을 통해 효소의 분리 또는 정제 없이 in vivo에서 빠르고 쉽게 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라 한천 플레이트 또는 용액(예: 청백색 스크리닝, 마이크로 웰)에 대한 신속한 테스트가 가능하며 생화학, 조직화학, 세균학 및 분자 생물학에 사용됩니다. 불행히도 이러한 기질의 합성은 다양한 부반응과 인독실 하이드록실 기능의 낮은 반응성으로 인해 어려운 것으로 판명되었습니다. 특히 포도당 유형 구조의 경우 낮은 수율이 관찰되었습니다. 당사의 새로운 접근법은 인독실산 에스테르를 주요 중간체로 사용합니다. 다양한 치환 패턴을 가진 인독실산 에스테르는 확장 가능한 경로에서 준비되었습니다. 이러한 수용체 및 과아세틸화 글리코실 할라이드를 사용한 상 전달 당화는 높은 수율의 일반적인 조건에서 수행할 수 있습니다. 에스테르 절단과 그에 따른 연은 매개 글리코실화는 높은 수율로 과아세틸화 인독실 배당체를 생성합니다. 마지막으로 Zemplén에 따라 보호 해제가 수행됩니다.

서론

오랫동안 인디고의 생산은 경제적으로 매우 중요한 과정이었습니다. 대규모 화학 합성을 통해 인디고를 저렴하게 얻을 수 있게 되기 전까지, 기원전부터 전구체는 천연 자원에서 얻었습니다. 인도 인디고 식물의 인디고 전구체 함량(0.2-0.8 %)이 약 30배 더 높았기 때문에, 17세기 유럽에서는 인디고 생산 식물(천연 인디고)의 재배가 수익성이 낮아졌습니다. 19세기 말에 이르러 인디고의 화학 합성이 이루어지면서 전통적인 재배 방식은 쇠퇴하였습니다1,2.

식물에서 천연으로 발생하는 인디고 전구체에는 인디칸(Indican) (1), 인사탄 A(Insatan A) (2) 및 이사탄 B(Isatan B) (3)가 포함됩니다(Figure 1). 이들은 모두 글리코실 잔기와 연결된 인독실 모티프로 구성되어 있습니다. 예를 들어 효소 가수분해에 의해 글리코시드 결합이 절단되면 인독실(indoxyl) (4)이 방출됩니다. 인독실 자체는 거의 무색이지만, 빠르게 산화되어 인디고 염료(5)를 형성할 수 있습니다. 이러한 민감한 반응은 생화학, 조직화학, 세균학 및 분자생물학에서 효소 활성을 모니터링하는 데 응용되어 왔습니다. 효소를 분리하거나 정제하지 않고 in vivo에서 활성을 스크리닝하거나, 한천 배지 또는 용액 내에서 신속 테스트(e.g., blue-white 스크리닝, 마이크로웰)를 수행하는 것이 가능합니다. 인독실 부분에 연결된 잔기(e.g., 에스테르, 글리코사이드, 황산염)에 따라 다양한 효소군(e.g., 에스테라제, 글리코시다제, 설파타제)에 적합한 기질들이 개발되었습니다3. 다음에서는 인독실 글리코사이드의 형성과 응용에 초점을 맞출 것입니다.

인돌 유도체와 인디고 염료의 형성을 보여주는 인디칸 가수분해 과정 도식.
그림 1: 천연 인디고 전구체 및 가수분해에 의한 인디고 염료의 형성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

인독실 부분의 치환 패턴은 결과적으로 생성되는 인디고 염료의 색상과 물리적 성질을 결정합니다. 가장 일반적인 치환 패턴은 5-bromo-4-chloro (X로 약칭; 녹청색), 5-bromo (청색) 및 5-bromo-6-chloro (마젠타색)인데, 이는 이들이 가장 작은 염료 입자를 형성하고, 과립을 생성하지 않으며, 가수분해 지점으로부터의 확산이 가장 적기 때문입니다. 마지막 특성은 in vivo 실험에서 특히 중요합니다3.

에스테라아제 활성 검출을 위한 인디고젠(indigogenic) 방법의 첫 보고는 1951년 indoxyl acetate와 butyrate를 사용한 Barrnett와 Seligman에 의해 발표되었습니다4. 약 10년 후, 인디고젠 원리는 포유류 글루코시다아제(glucosidase)의 국소화에 응용되었습니다5. 지금까지 합성이 어렵다는 점에도 불구하고 여러 종류의 indoxyl glycoside가 개발되었습니다. 대부분의 합성은 N-acetylated indoxyl을 수용체로, 각각의 glycosyl halide를 공여체로 사용하는 방식에 기반합니다6-14. 당화 반응(Glycosylation)은 수산화나트륨이 포함된 아세톤에서 수행됩니다. 이러한 조건에서는 다수의 부반응이 발생하여 수율이 크게 감소합니다. 특히 포도당 유형 구조의 경우 매우 낮은 당화 수율이 보고되었습니다(예를 들어, (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside의 경우 15%6, 최근 사례인 (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobioside의 경우 26%14). indoxylic acid ester를 사용하는 새로운 접근법을 통해 상당수의 indoxyl glycoside가 높은 수율로 제조되었습니다(예를 들어, (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside 수율 57%).

다음 프로토콜에서는 인독실산 알릴 에스테르(5-bromo-4-chloro)의 간단한 합성과 이를 바탕으로 한 인독실 글리코사이드(X-Gal)의 합성에 대해 설명합니다. 간단한 모델 실험을 통해 X-Gal을 이용한 β-galactosidase의 효소 반응성을 보여줍니다.

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프로토콜

일반적인 주의:

모든 반응은 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되었습니다. 모든 시약 및 용매(p.a., 건조 용매의 수분 함량: MeCN <50ppm; Et2O <0.01%; 채널2Cl2 <0.003%; THF<0.005%)는 상업적인 출처에서 구입하여 받은 대로 사용했습니다. TLC는 Merck 실리카겔 60 F254 플레이트에서 수행되었습니다. 화합물은 UV 및/또는 EtOH/H2SO4 (9:1) 처리 및 후속 가열에 의해 검출되었습니다. 컬럼 크로마토그래피는 Merck/Fluka 실리카겔 60(230-400 메시)을 사용하여 수행했습니다. 여과는 Büchner 깔때기 및 흡인기 펌프를 사용하여 수행되었습니다. 회전 증발기(40°C, ~200rmp)를 사용하여 용매를 제거했습니다. 제품은 고진공(로터리 베인 펌프)에서 건조되었습니다. 건조 용매를 필요로 하는 반응은 아르곤 분위기 하에서 수행되었습니다.

다음에서는 5-bromo-4-chloro-indoxylic acid allyl ester (12)를 사용하는 X-Gal (16)의 합성이 설명됩니다. 다양한 치환 패턴을 가진 추가 화합물과 이 합성 서열에 따라 제조된 메틸 에스테르에 대해서는 ref.17-19를 참조하십시오.

1. 수용체 : 5- 브로 모 -4- 클로로 - 인독실 산 알릴 에스테르의 합성18 (12)

  1. N- 아세틸 화 : N- (4- 브로 모 -3- 클로로 -2- 메틸 페닐) - 아세트 아미드 (6)의 합성
    1. 10.0g(45.7mmol)의 4-브로모-3-클로로-2-메틸아닐린을 30ml 디클로로메탄에 용해시킵니다.
      주의! 디클로로 메탄은 유해하며 얼음 목욕에서 용액을 냉각시킵니다.
    2. 무수아세트산 6.50ml(68.7mmol)를 적가하고 혼합물을 실온으로 데웁니다. 혼합물은 8 시간 또는 밤새 교반 할 수 있습니다. 주의! 무수 아세트산은 부식성이며 가연성입니다.
    3. 용매를 제거하고 9 : 1 에틸 아세테이트 / 메탄올에서 재결정화합니다 (수율 : 97 % (11.6 g, 44.2 mmol), 무색 고체) .
      주의! 에틸 아세테이트는 자극적이고 가연성입니다. 주의! 메탄올은 독성이 있으며 가연성입니다.
  2. 산화 : N- 아세틸 -5- 브로 모 -6- 클로로 - 안트라닐산의 합성 (7)
    1. 쿨러 및 드롭 퍼널이 장착된 3구 둥근 바닥 플라스크에 40ml의 물에 2.30g(8.76mmol)의 6(1.1단계에서 얻은 제품)과 2.10g(8.52mmol) MgSO4•7H2O의 혼합물을 환류합니다.
    2. 물에 적가형 50ml의 포화 KMnO4 용액을 3시간에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가합니다. 그런 다음 환류에서 2 시간 더 가열하십시오, ca. 135 ° C 오일 수조. 주의! 과망간산 칼륨은 유해하고 산화됩니다.
    3. 실온으로 냉각하고 반응 중에 형성되는 파이롤루사이트(MnO2)를 여과합니다.
      주의! 파이롤루사이트는 해롭습니다.
    4. pH 1까지 여과액에 염산(37%)을 첨가한 다음 제품을 여과하고 진공 건조(수율: 70%(1.80g, 6.15mmol), 무색 고체).
      주의! 염산은 부식성입니다.
  3. 탈아세틸화: 5-브로모-6-클로로-안트라닐산의 합성 (8)
    1. 7(단계 1.2에서 얻은 제품) 3.90g(13.3mmol)을 1N 수산화나트륨 수용액 70ml에 용해하고 약 100°C(오일 수조)에서 5시간 동안 가열합니다.
      주의! 수산화나트륨은 부식성입니다.
    2. 실온으로 식히고 pH 1까지 염산 (37 %)을 첨가 한 다음 Büchner 깔때기로 제품을 여과하고 진공 상태에서 건조시킵니다 (수율 : 88 % (2.93 g, 11.7 mmol), 무색 고체).
  4. 무수물 형성 : 5- 브로 모 -6- 클로로 - 이사 토산 무수물의 합성 (9)
    1. 8 (단계 1.3에서 얻은 제품) 8의 8.17 g (32.6 mmol)를 33 ml 건조 아세토 니트릴에 현탁 .
      주의! 아세토니트릴은 유해하고 가연성입니다.
    2. 실온에서 저어주고 5.3ml와 18.5ml 건조 디클로로메탄에 3.22g(10.8mmol) 트리포스겐 용액을 30분에 걸쳐 동시에 적가합니다. 그런 다음 50 ° C (오일 배스)에서 3 시간 동안 가열합니다. 주의! 피리딘은 유해하고 가연성입니다 .
      주의! Triphosgene은 독성이 있으며 phosgene을 방출 할 수 있습니다.
    3. 용매의 약 75%를 제거하고 증류수 100ml를 첨가하여 반응을 냉각하고 제품을 여과합니다. 소량의 차가운 디클로로메탄으로 씻으십시오.
    4. 제품을 진공 상태에서 건조시킵니다 (수율 : 88 % (7.53 g, 27.2 mmol), 무색 고체).
  5. N- 알킬화 : 5- 브로 모 -6- 클로로 -N- [(메 톡시 카르 보닐) 알릴] - 이사 토산 무수물의 합성 (10)
    1. 250ml의 무수 디메틸포름아미드에 9(1.4단계에서 얻은 제품) 25g(90mmol)을 녹입니다. 얼음 목욕으로 식힙니다.
      주의! 디메틸포름아미드는 유해하고 가연성입니다.
    2. 1.15 등가량의 수소 소듐 (파라핀 60 %) 부분을 현명하게 추가합니다 .
      주의! 수소화 나트륨은 부식성이며 가연성입니다. 물/얼음과의 심한 반응.
    3. 0 °C에서 30 분 동안 교반 한 후 실온으로 데우고 1.2 등가의 알릴 브로 모 아세테이트를 적가하십시오.
    4. 5 시간 동안 교반 한 후 500ml의 증류수를 첨가하여 반응을 끄고 제품을 여과하십시오.
    5. 물 (3 회, 100ml)로 씻고 진공 상태에서 제품을 건조시킵니다 (수율 : 93 % (31.5g, 84.1mmol), 무색 고체).
  6. 무수물 개폐 : 5- 브로 모 -6- 클로로 -N- (메 톡시 카르 보닐 알릴) - 안트라닐산 알릴 에스테르의 합성 (11)
    1. 100ml 알릴 알코올에 10(1.5단계에서 얻은 제품) 10g(27mmol)을 녹입니다.
      주의! 알릴 알코올은 유해하고 환경에 위험합니다.
    2. 350mg(8.70mmol)의 수소화나트륨(파라핀 60%)을 추가로 추가합니다.
    3. 6.5시간 또는 밤새 교반한 후 용매를 제거합니다.
    4. 조제품을 컬럼 크로마토그래피(컬럼 30 x 6cm, 실리카 240g) 석유 에테르/에틸 아세테이트 2:1; RF = 0.66), (수율 : 80 % (8.30 g, 21.3 mmol), 황색 오일) .
      주의! 석유 에테르는 가연성, 자극성 및 환경에 위험합니다.
  7. Dieckmann 응축 : 5- 브로 모 -4- 클로로 - 인독실 산 알릴 에스테르의 합성 (12)
    1. 100ml 건조 디 에틸 에테르에 11 (1.6 단계에서 얻은 제품) 3.0g (7.7mmol)과 tert- 부톡 <[>.75g"칼륨 1.75g (15.6mmol)을 혼합합니다 .
      주의! 칼륨 tert- 부톡 사이드는 부식성 및 가연성입니다 .
      주의! 디 에틸 에테르는 유해하고 가연성이 매우 높습니다.
    2. 혼합물을 환류(냉각기)에서 40-45°C에서 2시간 동안 가열합니다.
    3. 용매의 약 75%를 제거하고 희석된 염산(100ml, 1M)을 첨가합니다.
      주의! 완전히 건조하지 마십시오, 분해가 발생할 수 있습니다.
    4. 제품을 여과하고 진공 상태에서 건조시킵니다 (수율 : 84 % (5.14 g, 15.5 mmol), 무색에서 약간 녹색 고체).

2. Indoxyl-Glycoside : X-Gal17의 합성

  1. 상 전달 당화 : (5-bromo-4-chloro-indox-3-ylic acid allyl ester) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranoside (14)의 합성
    1. 인독실산 알릴레스터 12(1.7단계에서 얻은 제품) 400mg(1.21mmol), 테트라부틸암모늄황산수소 410mg(1.21mmol) 및 공여체 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-ᴅ-갈락토피라노실 브로마이드(α-아세토브로모갈락토오스) 500mg(1.21mmol)을 10ml 디클로로메탄에 혼합합니다. 주의! 테트라 부틸 암모늄 수소 황산염은 유해합니다.
    2. 탄산칼륨 (1M) 수용액 10ml를 추가합니다 .
      주의! 탄산 칼륨은 부식성입니다.
    3. 공여체(TLC: 석유 에테르/에틸 아세테이트)가 완전히 소진될 때까지 실온에서 저어줍니다.
    4. 유기상 (분리 깔때기)을 분리하고 Na2SO4 위에서 건조시키고 용매를 제거한다.
    5. 조제품을 컬럼 크로마토그래피(petroleum ether/ethyl acetate 1:1; R, F = 0.33). (수율 : 86 % (690 mg, 1.04 mmol), 무색 고체).
  2. 에스테르 절단 및 탈 카르 복실 화 : (N- 아세틸 -5- 브로 모 -4- 클로로 인돌 -3- 일) 2,3,4,6- 테트라 -O- 아세틸 -β-ᴅ- 갈락 토피라 노시드의 합성 (15)
    1. 14(2.1단계에서 얻은 제품) 600mg(0.908mmol)을 15ml 건조 테트라하이드로푸란에 용해합니다.
      주의! 테트라하이드로푸란은 유해하고 가연성입니다.
    2. 모르폴린 800μl와 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 105mg(9.09μmol)을 넣고 실온에서 밤새 저어줍니다.
      주의! 모르폴린은 가연성이며 부식성이 있습니다.
    3. 솔벤트를 제거합니다.
    4. 아세트산 400mg(2.40mmol), 탄산칼륨 800mg(5.79mmol) 및 무수아세트산 10ml를 추가합니다.
      주의! 실버 아세테이트는 자극적이며 환경에 위험합니다.
    5. 90-100 °C에서 20분 동안 가열합니다.
    6. 실온으로 냉각한 후 디클로로메탄으로 희석합니다.
    7. 혼합물을 물로 두 번 씻고 희석 된 NaHCO3 용액 (10 %)으로 한 번 씻습니다 .
      주의! 중탄산나트륨은 부식성입니다.
    8. 유기상을Na2SO4(필터)에서 건조시키고 용매를 제거합니다.
    9. 조제품을 컬럼 크로마토그래피(PE/EA 1:1; R F = 0.24), (수율 : 88 % (495 mg, 8.00 mmol), 무색 고체).
  3. Zemplén 탈아세틸화: (5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranoside의 합성 (16)
    1. 396 mg (0.436 mmol) 15 (2.2 단계에서 얻은 제품)를 10 ml 메탄올에 용해시킵니다.
    2. 촉매 양만큼 메탄올산 나트륨을 넣고 실온에서 밤새 저어줍니다.
      주의! 메탄올산 나트륨은 가연성이며 부식성입니다.
    3. Amberlite IR-120 H+(필터) 및 농축액으로 중화합니다.
      주의! Amberlite IR-120 H+는 자극적입니다.
    4. 제품을 진공 상태에서 건조시킵니다 (수율 : 87 % (170 mg, 0.416 mmol), 무색 고체).

3. 모델 실험 예시 : X-Gal을 사용하는 β-galactosidase의 활동 증명

  1. 마이크로 원심 분리 튜브 (X-Gal은 몇 μl의 디메틸 설폭 사이드에 용해 될 수 있음)에서 500 μl 버퍼 (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산; 또는 효소에 적합한 기타 완충액)에 X-Gal의 0.5 mM 용액을 준비합니다.
  2. 1 μl β,1-3-갈락토시다아제(EC 3.2.1.23 10,000 U/ml 또는 기타 적절한 β-갈락토시다아제)를 넣고 37°C에서 쉐이크(600 rps)합니다.
  3. 반응을 따르십시오. 인디고 타입 염료는 단기간 후에 형성됩니다.

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결과

indicane 및 5-bromo-indicane의 최초 합성은 이미 1927년과 1929년에 Robertson에 의해 발표되었습니다15,16. indoxylic acid methyl ester를 수용체로 사용하여 반응성이 높은 2번 위치를 차단함으로써 부반응을 부분적으로 억제했습니다. 탈보호 및 탈탄산 반응(160 °C, acetic anhydride, 1 hr) 이후 acetone/sodium hydroxide에서 글리코실화(glycosylation)를 진행하고, 최종적으로 탈아세틸화를 거쳐 Indicane과 5-bromo-indicane을 얻었습니다. 이러한 개념을 바탕으로, 본 연구진은 indoxylic acid allyl ester를 수용체로 사용하는 개선된 indoxyl glycoside 합성법을 개발했습니다17-19. 수용체 합성은 각각의 치환된 aniline 유도체 (5)에서 시작됩니다(Figure 2). 아미노 기능기의 아세틸화 (6) 후, p...

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토론

특히 포도당 유형 구조와 더 복잡한 당류에 대한 낮은 수율과 한계로 인해 인독실 배당체에 대한 새로운 합성 접근법이 개발되었습니다. 인독실산 에스테르는 귀중한 핵심 중간체임이 입증되었으며 확장 가능한 모듈식 경로로 얻어졌습니다. 모든 단계는 수율이 높으며 저렴한 출발 물질과 쉬운 정밀 작업으로 인해 멀티그램 합성이 가능합니다. 알릴 에스테르 접근법의 장점은 반응성 2-위치를 차단한다는 것입니다. 따라서 수율 감소 부반응이 억제됩니다. 알릴 에스테르를 사용하면 선택적 절단이 가능하며, 이는 카르복실 기능을 포함하는 기질에서 특히 중요합니다.

이들 수용체의 상 전달 글리코실화는 각각의 과아세틸화 글리코실 할로겐화물로 수행되었으며 일반적인 조건에서 높은 수율에 성공했습니다. 그 후, 알릴 에스테르를 팔라듐 촉매로 선택적으로 절단하고, 조제물을 온화한 은 매개 탈카르복실화를 거쳤다. 이것이 합성의 핵심 단계입니다. 특히 반응 시간을 짧게 유지하고 온도를 최대한 낮게 유지하는 것이 중요했...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

덴마크 코펜하겐에 소재한 Glycom A/S의 이 작업에 대한 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산 무수물Grü ssing10298부식성, 가연성
아세시그마-알드리치608-001-00-3유해, 인화성
알릴 알코올알드리치453021유해하고 환경에 위험한
앰버라이트 IR-120 H+Fluka06428자극성
브로모아세트산Merck802260부식성, 독성, 위험 환경을 위해:
4-Bromo-3-chloro-2-methylanilineABCRAB 171687자극성
디클로로메탄ACROS326850010유해한
디에틸 에테르Grü ssing10274유해하고 극도로 가연성
인 디메틸 포름 아미드ACROS348430010유해하고 가연성
DimethylsulfoxideSigma-Aldrich41648
에틸 아세테이Sigma-Aldrich607-022-00-5자극성 인화성
에틸렌 디아민 테트라 아세트산AppliChemA1103.0500자극성
&베타; 1,3-갈락토시다아제, 재조합, E. coliCalbiochem345795
염산VWR20252.290부식성
황산마그네슘 수화물Merck105885
메탄올ACROS326950010독성, 인화성
MorpholineJanssen Chimica15.868.57부식성, 인화성
Peroleum etherAzelis111053가연성, 자극성, 환경에 위험
탄산칼Grü ssing12005부식성
과망간산 칼륨Gr ü ssing12056유해하고 산화성
Potassium tert-butoxideMerck804918부식성, 가연성
PyridineSigma-Aldrich613-002-00-7유해하고 가연성
Silver acetateFluka85140환경에 위험한 자극성
중탄산나트륨Grü ssing12144부식성
수소화 나트륨Merck814552부식성, 가연성
수산화 나트륨Riedel-de H ä enS181200부식성
나트륨 메탄올 레이트Merck806538부식성, 가연성
황산나트륨Grü ssing12175
테트라부틸암모늄 수소황산염 랭커스터5438유해한
테트라하이드로푸란시그마-알드리치87371유해하고 인화성
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)시그마-알드리치216666
트리포스겐플루카15217독성
트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염SigmaT-3253자극제
토니트릴 트 륨

참고문헌

  1. Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
  2. Hunger, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).
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