여기에서는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포존 DNA를 사용하여 새로운 교모세포종(GBM)을 유도, 모니터링 및 분석하는 효율적이고 다재다능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하부의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.
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방법 논문
신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 모세포종의 소설 모델을 생성합니다
이 논문에서
요약
초록
예후가 좋지 않은 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양인 교모세포종(GBM)의 발병 및 진행에 대한 새로운 유전자의 기여도를 검사하는 것이 시급합니다. 새로운 잠재적 치료법이 빠르게 등장하고 있으며 인간 질병의 두드러진 특징을 밀접하게 재현하는 실험 모델에서 체계적인 테스트가 필요합니다. 본 명세서에서는 신생아 마우스의 심실하 영역의 세포에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 매개 통합을 통해 교모세포종의 새로운 모델을 유도하는 방법을 자세히 설명합니다. 잠자는 숲속의 미녀 전이(transposon) 시스템을 사용하여 게놈 통합에 적합한 새로운 전이(transposon)를 복제하는 간단한 방법을 제시하고 생물 발광, 조직학 및 면역 조직화학을 사용하여 플라스미드 흡수 및 질병 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 또한 새로운 1차 교모세포종 세포주를 생성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 이상적으로, 이 보고서는 뇌종양 연구자들 사이에서 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 더 널리 보급하여 교모세포종 발병 기전 및 진행에 대한 심층적인 이해와 환자를 위한 효과적인 치료법의 적시 설계 및 테스트로 이어질 것입니다.
서론
수술, 방사선 요법, 화학 요법으로 치료 한 경우 다형성 교 모세포종 (GBM)는 15~21개월의 평균 생존 기간으로, 성인에서 가장 흔한 (60 %) 차 뇌종양이다. GBM에 대한 소설 치료는 필수적이다. 실험 요법 적절히 인간 질병의 두드러진 특징을 재현 동물 모델에서 시험을 요구한다. 설치류 교종 세포주를 사용하여 화학이 알킬화제와 돌연변이 유발, 또는 배아 체세포 유전자 변형, 또는 이식을 포함 GBM의 전략을 유도한다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 뇌 내로 또는 피하로 동일한 유전자형의 동물 세포를 이용하여 동계 어느 동소, 신경 교종 세포주 주입을 채용; 또는 이종 세포는 면역에 이식 가장 일반적으로 인간 GBM 세포주, 마우스 3 손상. 이종 이식은 두개 내 종양의 연구에 많은 장점을 제공합니다 재현성의 편의를 위해, standardized 성장률, 죽음과 종양 현지화의 시간. 의사 pallisading 괴사, 핵 atypias, 미만성 침윤, 미세 혈관의 증식 : 착상하고 정확하게 조직 학적을 재현하는 능력의 한계에 사용되는 인공, 침습 수술 방법으로 인간의 GBM (WHO 4 등급)의 특성을 특징으로 인해 그러나 이러한 모델은 한계를 가지고 및 glomeruloi....
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프로토콜
참고 : 모든 동물 프로토콜이 동물의 사용 및 관리에 대한 미시간위원회의 대학 (UCUCA)에 의해 승인되었습니다.
새로운 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존에 관심의 순서 1. 복제
참고 : 유전자 또는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스 시스템을 사용하여 (shRNA를 등) 억제 요소를 삽입하려면, PKT 또는 PT2 플라스미드의 중추로 관심의 순서를 복제. 복제를 직접 규제 요소, 관심과 마커의 유전자가 반전 반복 (IR / DR)의 어귀를 유지하도록. 아래에 자세히 설명되어 있습니다 PKT 백본에 PDGFβ 복제의 예 (참조 그림 1b).
- 반응 부피 50 μL를 XbaI에서 /의 XhoI 제한 효소의 단위를 37 ~ 10 ° C에서 4 시간 플라스미드 벡터 PKT-IRES-Katushka 5 μg의 다이제스트.
- 5-10 부와 37 ° C에서 4 시간을 pGEM-T- mPDGFβ 플라스미드 5㎍을 mPDGFβ의 cDNA를 다이제스트를 NcoI / SacI로 제한 효소들.
- 100 % 에탄올 2.5 권, 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.8의 1/10 부피를 첨가하여 전체 DNA를 석출시킨 -20 ° C에서 밤새....
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결과
SB 유도 된 아교 모세포종의 histo 병리학 적 특징을 특성화하기 위해, C57 / BL6 신생아 생쥐 플라스미드 종양 DNA, 즉, NRAS (PT / CAGGS와 트랜스포존을 코딩과 조합 코드하는 플라스미드 루시페라아제 (PT2 / SB100x 뤽)와 P1으로 주입하면서 -NRASV12)와 SV40 LG 텔레콤 (PT / CMVSV40-LGT) (도 3c) 또는 PDGFβ 짧은 머리 핀의 자형으로 p53의와 NRAS (그림 3D와 함께 GFP 기자 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) 암호화하는 플라스미드). 동물 분사 (그림 2a) 다음날 생물 발광을 모니터링하고 주기적으로이 안락사 때 죽어가는 단계에 도달 할 때까지했다. 빈사 단계는 동물이 증상을 보여주는 장애인 이동성, 웅크 리고 자세, 정치 못한 모피와 체중 감량이되는 임상 단계로 정의된다. 때때로, 동물 원과 갑작스러운 점프에서 산책처럼, 발작.......
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토론
이 글에서, 우리는 세부 사항 신생아 마우스의 뇌실 영역을 주변 세포에 종양 플라스미드 DNA의 SB의 transposase- 매개 통합을 사용하여 GBM의 새로운 모델을 생성하기위한 다양하고 재현하는 방법. 우리가 관심있는 새로운 유전자 트랜스포존 플라스미드를 생성하는 프로토콜을 제시, 살아있는 동물에서 종양의 진행을 모니터링하는 방법, 및 이들의 종양 histo 병리학 및 면역 조직 화학적 특징을 특성화하는 방법을 예시한다.
우리의 실험실로 (그림 3) 등 13 보여,이 모델은 안정적 (1) 의사 palisading 괴사, (2) 혈관 증식, (3) 핵 비정 형성, (4) 이상 유사 분열 등 인간의 GBM의 두드러진 특성을 가진 종양 (작성 5) 혈관 주위 및 확산 침공. 신생아 마우스의 사용은 최소의 장비 및 SE에서 비교적 용이 기술적 절차를 제공하는 관점에서 최적 물류 인특정 유전 적.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 플라스미드를 후하게 선물하고 이 방법을 숙달하기 위해 제공된 교육에 대해 John Ohlfest 박사와 Stacey Decker13 박사에게 감사드립니다. 파라핀 함유 절편의 Hematoxylin-Eosin 염색 절차를 표준화하는 데 도움을 주신 Marta Dzaman에게 감사드립니다. 또한 이 원고를 정독하고 유용한 제안을 해 준 Molly Dahlgren에게도 감사드립니다. 이 작업은 MGC 및 PRL에 대한 NIH/NINDS 보조금, MCG 및 PRL에 대한 Leah's Happy Hearts Foundation 보조금의 지원을 받습니다. Alex's Lemonade Foundation young Investigator Award 및 CK에 대한 St. Baldrick's Foundation Fellowship.
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재료
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| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | 주사는 그것 없이도 만들 수 있지만 자동 주입기는 재현성과 편의성을 높입니다 |
| 10 Μ l 700 시리즈 핸드 핏 MICROLITER 주사기 | 해밀턴 | 모델 701 | 이 주사기 모델은 0.5에서 500 ul의 용액을 안정적으로 전달합니다. 다른 syrnges (예 5 ul, 모델 75)도 사용될 수 있습니다 |
| 30 게이지 피하 주사 바늘 (1.25", 15o 베벨) | Hamilton | S/O# 197462 | 이 바늘은 다른 침습적 절차 없이 신생아 마우스의 피부와 두개골을 관통하는 데 이상적입니다. 무뎌지면(피부에 쉽게 들어가지 않음) 교체해야 합니다. |
| in vivo-jetPEI | Polyplus Transfection | 201-10G | 분취량은 소량으로 -20 oC |
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참고문헌
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet. Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).
- Dai, C., Holland, E. C. Glioma models. Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).
- Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Ri....
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