방법 논문

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가 예쁜 꼬마 선충

DOI:

10.3791/52445

⸱

2015년 2월 22일

 ,  , 
1Institute for Society and Genetics, University of California, Los Angeles, 2Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 3California Nanosystems Institute, Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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우리는 생식계열 독성을 평가하는 데 사용되는 선충 Caenorhabditis elegans에서 고처리량 화학 분석의 세부 단계를 설명합니다. 이 분석법에서는 화학 물질 노출에 따른 생식세포 기능의 중단을 이수성 배아에 특이적인 형광 리포터를 사용하여 모니터링합니다.

초록

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우리의 환경에 존재하는 화학 물질의 수천의 생식 독성을 확인하는 것은 환경 보건 분야에서 가장 밝히는 과제 중 하나가되었습니다. 이것은 척추 동물의 높은 번호를 필요로하지 않고, (1) 정확하게 (2) 높은 처리량 방식으로 중간에서 이렇게 생식 과정 키 기능 요점을 되풀이하고있다 모델 시스템의 소수에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다.

우리는 선충 C. 여기에 분석을 설명 aneuploid 배아의 유도를 모니터링하여 생식 세포 독성 물질의 신속한 식별 할 수 간스. GFP 리포터 라인을 이용하여, 배아 파괴로 인한 염색체 분리에 오차가 용이하게 시각화 및 자동화 된 형광 현미경에 의해 정량화. 따라서, 그 독성에 대한 화합물의 특정 세트의 스크리닝은 수일 384 96- 웰 플레이트 형식으로 수행 될 수있다. 긍정적 인 시간의 차 분석그는 염색체 이상은 감수 분열 또는 초기 배아 염색체 분리에 유래 오류 여부를 판단하기 위해 수행 될 수있다. 전부,이 분석 결과 화학 물질에의 노출 다음과 생식 기능 장애의 신속한 평가를위한 빠른 첫 번째 패스 전략을 나타냅니다.

서론

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미국에서 상업에 등록 된 약 87,000 화학 물질이이 건강에 미치는 영향 1 테스트 한의 또 적은 수 있습니다. 테스트 한 것들 중에서 일부만 특히 여성 생식 세포 발생과 분화 동안 포유류 이른 생식 이벤트의 변경을 결정하는데 어려움으로 인해 일부 생식 건강에 미치는 영향에 대해 평가되었다. 사실, 첫 번째 감수 이벤트는 여성 포유 동물의 배아 발달의 초기 단계 동안 자리를 차지할 때문에 액세스 및 심사 목적에 맞는 숫자를 수집하기가 어렵습니다.

생식 세포는 세대 간의 중요한 연결을 제공하고, 그것의 적절한 기능은 세포의 염색체 분열의 복잡한 프로그램의 정확한 실행이 감수 분열이라에 따라 달라집니다. 감수 과정의 조절 곤란 저감 다산 및 생산 될 수있다염색체의 이상 수의 생식 세포 및 배아는 조건 이수성 불린다. 감수 분열 염색체 편석 에러는 인간의 건강에 매우 적합하다. 염색체 이상은 1 (150) 출산의 주파수, 삼 염색체 21, 18, ​​13뿐만 아니라 가장 흔한 유형 2,3 인 X와 Y 염색체 오류, 일반적이다. 또한, 염색체의 기원을 포함한 선천성 기형이, 미국 4 환경의 영향이 염색체 분리와 행동에 영향을 미칠 수 있다는 생각 유아 사망의 주요 원인이되는 5....

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프로토콜

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먹이 박테리아 1. 준비

주 :이 항목은 먹이 세균 (대장균 OP50)의 제조를 설명한다.

  1. E.의 단일 콜로니를 분리 무균 원성 국물 (LB) 한천 플레이트에서 대장균 균주 OP50는 멸균 LB 배지 300 ml의에 접종합니다.
  2. 포화 상태에 도달 할 때까지 접종 문화, 200 rpm으로 37 ° C에서 통에 밤새 성장하도록 허용합니다.
  3. 6 멸균, 미리 무게를 50 ML 원뿔 튜브에 OP50을 전송합니다. 6000 RPM (5000 XG)에서 5 분 동안 원심 분리하여 세균 펠렛.
  4. 상층 액을 제거하고 멸균 M9 50 ml의 세균을 씻어. 두 번 반복합니다.
  5. 두 번째 세척 후 더 M9는 튜브에 남아 있지 않도록 보장, 나머지 M9를 제거합니다.
  6. 박테리아 펠렛을 함유하는 튜브를 칭량 펠릿의 중량을 결정하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 무게를 뺀다.
  7. 펠릿 난을 재현 탁M9 N 100 mg / ml의 농도로.
  8. 이 웜 문화에 사용 될 때까지 4 ℃에서 OP50 솔루션을 저장합니다.

선충 성장 중간 (NGM)....

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결과

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이러한 미세 소관 독 Nocodazole 등의 화학 약품에 Pxol-1 :: GFP 기자 균주의 노출 (그림 1) DMSO 제어에 비해 노출 성인 자웅 동체의 자궁에 GFP를 발현하는 배아의 높은 비율의 유도에 이르게. GFP 양성 배아 다른 배아뿐만 아니라 동물의 소화관에서 관찰 자동 형광 관찰 약한 배경 형광보다 상당히 밝습니다. 웜 직접 노출 384- 웰 플레이트 상에 결상 및 적어도 하나 GFP 양성 배아를 함유 벌레의 수는 물론 그 웜의 총 개수에 의해 정규화하고, 각 웰에 대해 계산된다. 화학 화면에서 긍정적 인 히트는 주파수 1.7 DMSO (10)보다 더 높은에서 웜 인구에 GFP 양성 배아의 비율을 유도 화합물을 의미한다. 임계 최적화에 이어, 고 함량의 화상 분석 (소재 파일을 참조) 자동화 CALC 허용웰 벌레의 총 개수로 나눈 양의 개체 (즉, 배아)의 개수와의 위험률은 분석의 대규모 적응위한 .......

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토론

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여기에 기재된 방법은 생식선 독성의 식별을위한 제 대규모 전략을 구성한다. 그것은 충실하게 생식 기능 장애에 대한 프록시로 사용되는 초기 배아에서 이수성의 유도를보고 GFP 형질 전환 Pxol-1 :: GFP 포함하는 변형의 사용을 필요로한다. 방법 C. 동기화의주의를 포함 엘레 웜 인구와 자동화 된 고 함량 현미경으로 GFP 긍정적 인 웜의 영상 다음 96 웰 형식의 화학 물질에 웜 '노출.

이 프로토콜의 여러 단계는 결과의 일관성에 중요하다. 제대로 노출에 사용됩니다 L4 유충을 단계적으로 같은 수를 최대화하기 위해 첫째, 웜 인구는 매우 동기해야한다. 이 때문에, 여기에 설명 된 방법은 제 웜 인구에 의한 표백 후 L1 고갈에 의해 두 개의 동기화 단계를 포함한다. 두 번째로 중요한 파라이 방법의 미터는 노출의 길이입니다. 웜은 정기적으로 24 시간 또는 65 시간 중 노출된다. 감수 분열로 C의 연.......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 이 작업을 가능하게 해준 NIH ES020353와 Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award의 다음 자금 출처에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
60mm 통풍이 잘되고 날카로운 모서리 페트리 접시TritechT3315
AgarApex20-274
Axygen 96-well 투명 둥근 바닥 2ml 폴리프로필렌 딥 웰 플레이트CorningP-DW-20-C-S
BactopeptoneApex20-261
Bacto-tryptoneFisher ScientificBP1421-2
표백제Clorox
염화칼슘 (CaCl2)VWRAA12316-A1
콜레스테롤피셔 사이언티픽ICN10138225
DMSOVWRIC19018680
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
에탄올 200 프루프VWREM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 웰 플레이트Sigma-AldrichM1937-32EA
ImageXpress Micro XLS 시스템분자 장치
레바미솔 염산염Fluka31742
무수 황산마그네슘(MgSO4)VWR97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & 분석 소프트웨어분자 장치
산칼륨 일염기성 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
생물학적 배양용 레이온 필름VWR60941-086
염화나트륨(NaCl)Sigma-AldrichS5886
수산화나트륨(NaOH)Fisher ScientificS318
인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)VWRBDH0316
실체현미경NikonSMZ 745이 현미경은 총 배율 형태가 3.35X에서 300X입니다. 유사한 특성을 가진 모든 현미경이 작동합니다.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP 리포터 균주Caenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
효모 추출물Becton Dickinson212750
인

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), ....

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태그

C elegansGFP

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