방법 논문

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가

DOI:

10.3791/52445

⸱

2015년 2월 22일

 ,  , 
1Institute for Society and Genetics, University of California, Los Angeles, 2Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 3California Nanosystems Institute, Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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우리는 생식계열 독성을 평가하는 데 사용되는 선충 Caenorhabditis elegans에서 고처리량 화학 분석의 세부 단계를 설명합니다. 이 분석법에서는 화학 물질 노출에 따른 생식세포 기능의 중단을 이수성 배아에 특이적인 형광 리포터를 사용하여 모니터링합니다.

초록

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우리의 환경에 존재하는 화학 물질의 수천의 생식 독성을 확인하는 것은 환경 보건 분야에서 가장 밝히는 과제 중 하나가되었습니다. 이것은 척추 동물의 높은 번호를 필요로하지 않고, (1) 정확하게 (2) 높은 처리량 방식으로 중간에서 이렇게 생식 과정 키 기능 요점을 되풀이하고있다 모델 시스템의 소수에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다.

우리는 선충 C. 여기에 분석을 설명 aneuploid 배아의 유도를 모니터링하여 생식 세포 독성 물질의 신속한 식별 할 수 간스. GFP 리포터 라인을 이용하여, 배아 파괴로 인한 염색체 분리에 오차가 용이하게 시각화 및 자동화 된 형광 현미경에 의해 정량화. 따라서, 그 독성에 대한 화합물의 특정 세트의 스크리닝은 수일 384 96- 웰 플레이트 형식으로 수행 될 수있다. 긍정적 인 시간의 차 분석그는 염색체 이상은 감수 분열 또는 초기 배아 염색체 분리에 유래 오류 여부를 판단하기 위해 수행 될 수있다. 전부,이 분석 결과 화학 물질에의 노출 다음과 생식 기능 장애의 신속한 평가를위한 빠른 첫 번째 패스 전략을 나타냅니다.

서론

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미국에서 상업에 등록 된 약 87,000 화학 물질이이 건강에 미치는 영향 1 테스트 한의 또 적은 수 있습니다. 테스트 한 것들 중에서 일부만 특히 여성 생식 세포 발생과 분화 동안 포유류 이른 생식 이벤트의 변경을 결정하는데 어려움으로 인해 일부 생식 건강에 미치는 영향에 대해 평가되었다. 사실, 첫 번째 감수 이벤트는 여성 포유 동물의 배아 발달의 초기 단계 동안 자리를 차지할 때문에 액세스 및 심사 목적에 맞는 숫자를 수집하기가 어렵습니다.

생식 세포는 세대 간의 중요한 연결을 제공하고, 그것의 적절한 기능은 세포의 염색체 분열의 복잡한 프로그램의 정확한 실행이 감수 분열이라에 따라 달라집니다. 감수 과정의 조절 곤란 저감 다산 및 생산 될 수있다염색체의 이상 수의 생식 세포 및 배아는 조건 이수성 불린다. 감수 분열 염색체 편석 에러는 인간의 건강에 매우 적합하다. 염색체 이상은 1 (150) 출산의 주파수, 삼 염색체 21, 18, ​​13뿐만 아니라 가장 흔한 유형 2,3 인 X와 Y 염색체 오류, 일반적이다. 또한, 염색체의 기원을 포함한 선천성 기형이, 미국 4 환경의 영향이 염색체 분리와 행동에 영향을 미칠 수 있다는 생각 유아 사망의 주요 원인이되는 5 개의 새로운 것이 아니다,하지만 여전히 제대로 이해된다. 그것은 인간의 불임, 초기 개발 및 전반적인 생식 건강을 방해 우리의 환경에 도입 된 화학 물질의 어떤 조사하는 것이 중요하다.

포유 동물 모델의 이러한 한계의 관점에서, 우리는 <회충 생식 독성을 테스트하기 위해 높은 처리량 스크린 분석법을 개발EM> C. 엘레. 우리는 작은 크기, 낮은 비용, 짧은 재생주기, 생식 세포의 비율이 높은 및 조작 (6)의 용이성으로이 일반적으로 사용되는 유전자 모델 시스템에서 제공하는 여러 가지 중요한 기능을 동원했다. 웜 96- 웰 플레이트 또는 대량의 액체 배양 물에서 성장 될 수 있고, 투명성 때문에 직접 형광 리포터 검출 용 플레이트 상에 이미징 될 수있다. 후술 분석은 이러한 특성을 활용하고 및 배아 생식 세포 분열 이수성의 유도를 검출하는 형광 리포터에게 Pxol :: GFP-1을 함유하는 웜 변형을 이용한다.

이 리포터 균주의 사용은 주로 암수 웜 인구 남성 일반적 드문에 기초한다. 이 남성은 (<0.2 %)이 자연스럽게 X 염색체 7의 분리에 오류를 발생. 그러나 생식 세포 분열로 자주 염색체의 분리의 오류로 연결과 heterochromosomes, 그것은 남성의 표현형 (X의 missegregation)뿐만 아니라 배아 치사 (염색체의 missegregation)의 높은 발병률을 모두 상관 관계. 배아 치사의 문제를 회피하면서 쉽게 수컷의 유도를 검출하기 위해, 남성 특이 프로모터 (XOL-1) 여전히 웜의 자궁 내에 포함 된 초기 배아에서 GFP의 발현을 구동하는 데 사용된다. 이와 같이, GFP 발현의 배아 외관 aneuploid 배아의 존재에 대한 프록시로서 사용된다. 이 방법은 이전 생식계 정비 및 감수 8,9에 관여 유전자를 동정하는데 사용되어왔다. 화학적 선별하도록 구성된,이 균주는 높은 처리량 스크린 매체에 사용된다. 중요한 것은, 변형 충실 화학 물질의 aneugenicity를보고하고 포유 동물의 생식 엔드 포인트 (10)에 따라서 관련이있다. 여기에 설명 된 분석은보고 제약 및 화학 산업 설정에서 독성 학자들에게 특히 유용 할 것입니다빠르게 생식 엔드 포인트에 대한 화학 물질의 독성을 평가합니다. 또한,이 분석은 완전히 21 세기 보고서 11 독성에 강조 정부의 우선 순위로 정렬합니다.

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프로토콜

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먹이 박테리아 1. 준비

주 :이 항목은 먹이 세균 (대장균 OP50)의 제조를 설명한다.

  1. E.의 단일 콜로니를 분리 무균 원성 국물 (LB) 한천 플레이트에서 대장균 균주 OP50는 멸균 LB 배지 300 ml의에 접종합니다.
  2. 포화 상태에 도달 할 때까지 접종 문화, 200 rpm으로 37 ° C에서 통에 밤새 성장하도록 허용합니다.
  3. 6 멸균, 미리 무게를 50 ML 원뿔 튜브에 OP50을 전송합니다. 6000 RPM (5000 XG)에서 5 분 동안 원심 분리하여 세균 펠렛.
  4. 상층 액을 제거하고 멸균 M9 50 ml의 세균을 씻어. 두 번 반복합니다.
  5. 두 번째 세척 후 더 M9는 튜브에 남아 있지 않도록 보장, 나머지 M9를 제거합니다.
  6. 박테리아 펠렛을 함유하는 튜브를 칭량 펠릿의 중량을 결정하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 무게를 뺀다.
  7. 펠릿 난을 재현 탁M9 N 100 mg / ml의 농도로.
  8. 이 웜 문화에 사용 될 때까지 4 ℃에서 OP50 솔루션을 저장합니다.

선충 성장 중간 (NGM) 페트리 접시 2. 준비

주 :이 섹션은 판 C.는 NGM 페트리 접시의 준비에 대해 설명합니다 엘레 웜은 정기적으로 실험실에서 유지됩니다.

  1. NGM 한천 배지를 압력솥.
  2. 무균 절차를 이용하여, 연동 펌프를 이용하여 6cm 페트리 접시에 NGM 한천 용액 17㎖의 분배.
    주 : 판에서 한천의 일정 금액이 다른 하나의 판에서 전환 할 때 현미경을 재조명의 필요성을 감소시킨다.
  3. 한천 응고하자 여분의 수분이 증발 할 수 있도록 사용하기 전에 2~3일 실온에서 접시를 남겨주세요.
  4. 멸균 기법을 사용 NGM 플레이트 종자. OP50 액체 배양의 1-2 방울을 적용하고 유리 막대를 사용하여 확산. 확인되지판의 가장자리에 박테리아 잔디 모든 방법을 전파한다.
  5. OP50 잔디가 벌레를 성장 판을 사용하기 전에 실온에서 1~2 일 동안 성장하는 것을 허용합니다.

동기 웜 인구의 3 준비

주 : C.의 수명 엘레는 배아 단계, 네 애벌레 단계 (L1-L4) 및 성인으로 구성되어 있습니다. 이 섹션에서는 웜의 시대 - 동기 인구의 준비에 대해 설명합니다. 표백제 처리 후 C.elegans과 접촉 모든 자료는 멸균해야합니다.

  1. 1 일 - 임신하는 웜 인구의 준비
    1. 웜 인구의 대부분이 굶주린 L1 유충 구성하는 NGM 플레이트를 사용합니다.
    2. 멸균 웜 L1 애벌레 선택 수집하고 신선한 6cm의 NGM 플레이트로 전송은 OP50 시드. 벌레의 대부분이 임신하는 성인 때까지 20 ℃에서 약 65 시간 동안 품어. 에판 혼잡을 방지하고 각 신선한 NGM 판에 L1 유충 이상의 하나 또는 두 개의 클러스터를 전송하지 않습니다, 벌레 박테리아를 파괴없이 증가 할 수 있습니다.
  2. 4 일 - 동기화 된 L1 유충 인구의 설립
    1. M9의 1-2 ml로를 세척하여 NGM 판에서 임신하는 벌레를 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송.
    2. 임신하는 웜이 약 5 ~ 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 침전 보자. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다.
    3. 2-4 마이크로 원심 튜브 웜 펠렛을 전송하고 표백제 / NaOH 용액 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 2 ~ 3 분 동안 품어. 모든 벌레가 죽었 확인 실체 현미경 하에서 반응의 진행을 모니터링합니다. 배아가 죽을 수 있으므로 이상 5 분 표백하지 마십시오.
    4. 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 벌레를 수집합니다. 상층 액을 제거하고 멸균 M9의 1 ml에 추가반응을 중화.
    5. 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 두 번 벌레를 씻으십시오.
    6. 상층 액을 제거하고 최대 100 ~ 200 μL에 M9를 추가합니다.
    7. 유리 파스퇴르 피펫 웜의 드롭을 추가 사용 / M9는 배아가 부화 할 수 있도록 20 ° C에서 최소 24 시간 동안 그들을 NGM 판을 지우고 배양 혼합.
      참고 : 음식없이 유충의 성장은 L1 단계에서 중단 될 것입니다.
  3. 5 일 - 동기화 된 L4 애벌레 인구의 설립
    1. M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L1 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송.
    2. 약 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 죽은 성인 웜 침전물을 보자.
    3. 새로운 원뿔 15 ML 튜브의 L1 웜은 상층 액을 수집하고, 2,600 RPM (1,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 웜을 침전.
    4. 뜨는 르를 제거약 500 μL AVING.
    5. 실체 현미경을 이용하여 10 μL 삭제 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 웜 용액의 농도를 결정한다. 적어도 5 방울을 계산합니다.
    6. 20 ~ 25 웜 / μL로 웜의 농도를 조정하고 OP50 시드 NGM 판에 웜 / M9 믹스의 50 μl를 추가합니다.
    7. 그들은 L4 단계에 도달 할 때까지 L1 동기화 된 인구가 성장 할 수 있도록 (주말을 통해 배양 용) 15 ° C에서 65 시간 동안 품어.

96 웰 플레이트에서 화학 물질에 웜의 4 노출

참고 :이 섹션은 Pxol1의 사용에 대해 설명 :: C를 포함하는 GFP 전사 기자 엘레 변형은 이수성의 유도를위한 화면으로 이동합니다.

  1. M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L4 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송.
  2. 하단에 L4 웜 침전물하자15 ml의 약 5 ~ 10 분 동안 원뿔 튜브. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다.
  3. M9의 3-5 ml에 첨가하고, 실체 현미경을 이용하여 10 ㎕의 방울 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 용액 웜의 농도를 결정한다. 각 샘플에 대해 적어도 5 방울을 계산합니다.
  4. M9 1,000 웜 / ml의 농도로 재현 탁 웜.
  5. 섹션 1에서 OP50 박테리아 희석 M9와 10 배. 낮은 온도는 웜 개발에 영향을주기 때문에 재 부유 세균은 실내 온도에 도달해야합니다.
  6. 제 (단계 4.4) 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 추가하고 2ml의 깊은 환저 96- 웰 플레이트의 각 웰에 (단계 4.5)으로 희석 OP50 세균 400 μL를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용. 마지막에, 각 웰은 500 μL 100 웜이있을 것이다.
  7. 최종 제안 CONCENTR을 달성하기 위해, 목적하는 웰에 시험 물질 또는 적절한 제어 중 0.5 μl를 추가100 μM의 ATION는, 농도는 일반적으로 C. 화학 화면에 사용 엘레 (12). 최종 농도 0.1 % DMSO 또는 에탄올 용매 컨트롤을 노출.
    참고 : 우리는 긍정적 인 제어와 같은 nocodazole (100 μM)의 사용을 권장합니다.
  8. 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 우물 사이에 교차 오염을 방지하기 위해 잘 판을 밀봉해야합니다.
  9. 알루미늄 호일로 접시를 감싸.
  10. 시간의 적당한 길이 (24 또는 65 시간)에 적합한 온도의 셰이커 (170-180 RPM)에 접시를 전송합니다. 실내의 온도는 웜의 성장에 영향을 미친다; 20 ° C의 주변 온도를 유지한다.

384 웰 플레이트에서 임신하는 웜 5. 이미지 획득

참고 :이 섹션은 성인 자웅 동체의 자궁 내 배아에서 GFP의 발현을 시각화, 이미지 노출 Pxol1 :: GFP 벌레에 함량이 높은 현미경의 사용에 대해 설명합니다. 용각 384 웰 플레이트가 상영 될, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용합니다.

  1. 셰이커 화학 물질에의 노출 후 10 ~ 15 분 동안 96 웰 플레이트 나머지는 어른 벌레가 판의 바닥에 침전 수 있도록 할 수 있습니다.
  2. 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 매우 조심, M9의 350 μl를 제거합니다.
  3. M9 1 ml의 단계를 반복 5.1 벌레를 씻으십시오.
  4. 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 참 조심, M9 1 ㎖를 제거합니다.
  5. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 나머지 M9에 웜을 재현 탁하고, 96 웰 플레이트에서 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 모으고 검은 벽 / 클리어 바닥 384- 웰 플레이트의 웰에로드. 384 웰 플레이트의 모든 우물이로드 될 때까지, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용하여 프로세스를 반복합니다.
    주 : 중요을 증가시키기 위해 모든 웰은 동일한 볼륨을 갖도록위한이미지 획득 과정의 효율성 및 오토 포커스의 속도. 각 웰은 80-100 웜 사이에 포함해야합니다.
  6. 각 웰의 levamisole (100 μM)의 1 μl를 추가하고 벌레가 약 30 분 동안 품어 보자.
    주 :의 levamisole가 아세틸 콜린 수용체 작용 물질로서 작용하고 벌레를 고정화.
  7. 자동화 된 영상을 제공 할 수있는 위드 함량이 높은 현미경으로 접시를 전송합니다.
  8. 이미지 수집의 경우, 제조업체의 지침에 따라 높은 함량의 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 사용합니다. 물론 당 1 영상을 획득 할 수 4X 목표를 선택합니다.
  9. 화상 취득을 시작하기 전에, 2160 X 2160 노출 이미지의 해상도가 45 밀리 초에 GFP 촬상 파라미터를 조정한다.
  10. 웰 벌레의 총 수로 나눈 GFP 양성 벌레의 수와 데이터를 수집, 측정, 후자는 웰 사이의 일관성이 비교적.

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결과

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이러한 미세 소관 독 Nocodazole 등의 화학 약품에 Pxol-1 :: GFP 기자 균주의 노출 (그림 1) DMSO 제어에 비해 노출 성인 자웅 동체의 자궁에 GFP를 발현하는 배아의 높은 비율의 유도에 이르게. GFP 양성 배아 다른 배아뿐만 아니라 동물의 소화관에서 관찰 자동 형광 관찰 약한 배경 형광보다 상당히 밝습니다. 웜 직접 노출 384- 웰 플레이트 상에 결상 및 적어도 하나 GFP 양성 배아를 함유 벌레의 수는 물론 그 웜의 총 개수에 의해 정규화하고, 각 웰에 대해 계산된다. 화학 화면에서 긍정적 인 히트는 주파수 1.7 DMSO (10)보다 더 높은에서 웜 인구에 GFP 양성 배아의 비율을 유도 화합물을 의미한다. 임계 최적화에 이어, 고 함량의 화상 분석 (소재 파일을 참조) 자동화 CALC 허용웰 벌레의 총 개수로 나눈 양의 개체 (즉, 배아)의 개수와의 위험률은 분석의 대규모 적응위한 ...

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토론

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여기에 기재된 방법은 생식선 독성의 식별을위한 제 대규모 전략을 구성한다. 그것은 충실하게 생식 기능 장애에 대한 프록시로 사용되는 초기 배아에서 이수성의 유도를보고 GFP 형질 전환 Pxol-1 :: GFP 포함하는 변형의 사용을 필요로한다. 방법 C. 동기화의주의를 포함 엘레 웜 인구와 자동화 된 고 함량 현미경으로 GFP 긍정적 인 웜의 영상 다음 96 웰 형식의 화학 물질에 웜 '노출.

이 프로토콜의 여러 단계는 결과의 일관성에 중요하다. 제대로 노출에 사용됩니다 L4 유충을 단계적으로 같은 수를 최대화하기 위해 첫째, 웜 인구는 매우 동기해야한다. 이 때문에, 여기에 설명 된 방법은 제 웜 인구에 의한 표백 후 L1 고갈에 의해 두 개의 동기화 단계를 포함한다. 두 번째로 중요한 파라이 방법의 미터는 노출의 길이입니다. 웜은 정기적으로 24 시간 또는 65 시간 중 노출된다. 감수 분열로 C의 연...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 작업을 가능하게 해준 NIH ES020353와 Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award의 다음 자금 출처에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
60mm 통풍이 잘되고 날카로운 모서리 페트리 접시TritechT3315
AgarApex20-274
Axygen 96-well 투명 둥근 바닥 2ml 폴리프로필렌 딥 웰 플레이트CorningP-DW-20-C-S
BactopeptoneApex20-261
Bacto-tryptoneFisher ScientificBP1421-2
표백제Clorox
염화칼슘 (CaCl2)VWRAA12316-A1
콜레스테롤피셔 사이언티픽ICN10138225
DMSOVWRIC19018680
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
에탄올 200 프루프VWREM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 웰 플레이트Sigma-AldrichM1937-32EA
ImageXpress Micro XLS 시스템분자 장치
레바미솔 염산염Fluka31742
무수 황산마그네슘(MgSO4)VWR97061-438
MetaXpress High Content Image Acquisition & 분석 소프트웨어분자 장치
산칼륨 일염기성 (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
생물학적 배양용 레이온 필름VWR60941-086
염화나트륨(NaCl)Sigma-AldrichS5886
수산화나트륨(NaOH)Fisher ScientificS318
인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4)VWRBDH0316
실체현미경NikonSMZ 745이 현미경은 총 배율 형태가 3.35X에서 300X입니다. 유사한 특성을 가진 모든 현미경이 작동합니다.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP 리포터 균주Caenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
효모 추출물Becton Dickinson212750
인

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
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  4. Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
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  10. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
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재인쇄 및 허가

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허가 요청

태그

C elegansGFP

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