Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

요약

이 기사는 제브라피시 배아에서 기계적 혈관 손상을 일으키는 방법을 설명합니다. 이 부상 모델은 실시간 현미경 검사에 이상적으로 적합한 유기체에서 지혈, 부상 관련 염증 및 상처 치유를 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

초록

얼룩말(Danio rerio) 배아는 다양한 발달 및 질병 과정을 연구하는 데 강력한 모델임이 입증되었습니다. 외부 발달 및 광학적 투명성으로 인해 이러한 배아는 특히 현미경 검사에 적합하며, 형광 단백질로 특정 세포 유형을 표지하는 수많은 형질전환 세포주를 사용할 수 있으므로 제브라피시 배아는 생체 내 손상 및 복구 중 혈관, 조혈 및 기타 세포 유형의 상호 작용을 시각화하는 데 이상적인 시스템입니다. 제브라피쉬의 정유전학(forward and reverse genetics)이 잘 발달되어 있으며, 약리학적 조작이 가능합니다. 우리는 지혈 및 혈관 복구를 포함한 혈관 손상에 대한 반응을 연구하기 위해 이러한 기능 중 몇 가지를 활용하는 미세 조작 기술을 사용하여 기계적 혈관 손상 모델을 설명합니다. 비디오와 타임랩스 현미경의 조합을 사용하여 이 혈관 손상 방법이 지혈 및 상처 복구 중에 측정 가능하고 재현 가능한 반응을 일으킨다는 것을 입증합니다. 이 방법은 전체 동물 모델에서 혈관 손상 및 복구를 자세히 연구할 수 있는 시스템을 제공합니다.

서론

제브라피쉬는 혈관 발달, 혈관 신생, 조혈 발달 및 병리학^1-3을 포함한 혈관 생물학의 다양한 주제를 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 배아는 수정 후 1일(dpf)까지 백혈구 및 선천면역계의 다른 구성 요소뿐만 아니라 기능적 순환을 발달시킵니다 ^1,4,5. 손상에 대한 염증성 및 백혈구 반응의 보존은 제브라피시 배아를 결핵 감염, 장염 및 조직 재생과 같은 다양한 염증 과정에 대한 정보 모델로 만들었습니다^6-9. 제브라피시 배아는 특히 상피 손상과 호중구 반응의 맥락에서 부상 관련 염증을 연구하는 데 사용되어 왔다^10,11. 배아에 대한 손상은 손상 부위의 세포와 손상에 반응하고 그 해상도를 조절하기 위해 모집된 선천성 면역 세포로부터 고도로 보존된 세포 반응을 초래합니다^11,12. 다른 부상 모델은 집속 레이저 펄스를 사용하여 뉴런, 근육 세포 및 심근 세포^13-15를 포함한 특정 세포 유형에 대한 손상을 공간적으로 국소화했습니다.

제브라피시 배아는 기계적 혈전과 레이저 유도 혈전 형성을 모두 사용하여 약리학적 및 유전자 조작 조건에서 지혈 및 혈전증을 연구하기 위한 모델로 사용되었습니다^16-19....

프로토콜

참고 : 제브라 피쉬를 사용하는 절차는 UCSF의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

도구 1. 준비

1. 핀 홀더에 특징점 핀을 삽입하고 핀을 고정.
2. 좋은 팁 집게를 사용하여 조심스럽게 약간의 훅을 만들기 위해 핀의 끝을 구부리십시오.
3. 조작 부상 중에 배아 안정화, 펜치를 이용한 인슐린 주사기에 장착 ½ 인치 28 게이지 바늘 끝을 구부리.

부상에 대한 제브라 피쉬 배아 2. 준비

1. 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 이전에 ^(22)과 같이 계란 물 (60ug / mL의 수족관 염)에서 계란을 수집합니다.
2. 배아는 약 melanization을 방지하기 위해 8 시간 포스트 수정 (HPF) 때 달걀 물에 0.003 % N-페닐 티오 (PTU)를 추가합니다.
3. 좋은 팁 집게를 사용하기 전에 실험에 Dechorionate 이일 포스트 수정 (DPF) 배아.
   참고 : 순환이 시작된 후 태아가 언제 부상을 입을 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 배아 DPF 2이지만, 기술이 성공적 5 DPF까지 배아 적용되었다.
4. 0.0....

결과

기계 혈관 손상은 배아 (- C도 2A), DPF (2) 상에 수행 하였다. 신속하고 신뢰성있는 응집 부상 응답 결과 (도 2D)를 출혈 중단 시간에 의해 측정. 응고 반응의 차이를 측정 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항응고제 히 루딘은 (대 직전 (5-10 NL을 물에 용해 히 루딘 μL 당 1 단위)을 상처에 퀴비에의 덕트 내로 주입하여 배아 투여했다 퀴비에의 덕트에 주사의 데모는, 이전 조브 제 ²³ 조) ^(24)을 참조하십시오. 부상 이전에이 결과 히 루딘의 관리는 크게 차량 제어 (그림 2D)에 비해 배 출혈 증가했다.

(: EGFP kdrl) 및 적혈구 (gata1a : 혈관 손상과 응고의 증거는 내피 세포에 대한 유전자 변형 라인을 사용하여 즉시 후 부상을 볼 수는 DsRed

토론

지브라 피쉬 ^{10 부상} 레이저 부상 ^13-15, 레이저 유발 혈전증 ^(16), 및 상피의 상처를 포함한 다양한 유형의 모델로서 성공적으로 사용되어왔다. 우리는 실행할 간단하며 실시간 현미경에 매우 의무가 생체 내 모델에서 부상 제어 기계적 상처를 생성하는 방법을보고한다. 신속한 지혈하고 측정 응답 및 비디오와 t​​imelapse에 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 재현성 상처 복구 프로그램 부상 결과.

그들의 단순하고 틀에 박힌 혈관 정의 현미경으로 접근 사이트에서 재현 부상을 허용 해부학, 대부분의 혈관과 조혈 세포 유형의 존재는 부상에 대한 응답을 연구하는 제브라 피쉬 배아에 특히 유용합니다. 그러나, 제브라 피쉬 배아는이 시스템 대부분의 AP를 제작, 개발 ^5,6의 첫 번째 주 동안 기능 림프구가 없습니다염증과 수리 타고난 면역의 기여를 공부 방법은 적절한. 현재, 형질 전환.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	팁 직경 0.0125 mm, 막대 직경 0.1 mm
핀 홀더	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	42 º으로 예열; C
, N-Phenylthiourea(PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid(Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	, Sigma Aldrich	H7016
유리 바닥 이미징 접시	Mattek	P35G-1.5-14-C
해부 현미경	Olympus	SZH10
형광 현미경	Zeiss	Axio Observer
수족관 소금	인스턴트 오션
인슐린 주사기 28.5 G 바늘	Becton Dickinson

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