종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

요약

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

초록

암 진행(시작, 성장, 침습 및 전이)은 악성 세포와 주변 종양 기질 세포 간의 상호 작용을 통해 발생합니다. 종양 미세환경은 섬유아세포, 면역 세포, 혈관 내피 세포, 주피 세포 및 골수 유래 세포와 같은 다양한 세포 유형으로 구성되며, 세포외 기질(ECM)에 내장되어 있습니다. 암 관련 섬유아세포(CAF)는 수용성 인자의 분비, 혈관 신생 및 ECM 리모델링을 통해 종양 형성을 촉진하는 역할을 합니다. 암세포의 생존, 증식, 이동 및 침입에 대한 실험 모델은 대부분 2차원 단세포 및 단층 조직 배양 또는 Boyden 챔버 분석에 의존해 왔습니다. 그러나 이러한 실험은 병든 장기의 생리학적 또는 병리학적 상태를 정확하게 반영하지 않습니다. 종양 기질 또는 종양 기질 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 얻기 위해 다세포 및 3차원 배양은 세포 간 통신 및 암세포 행동의 ECM 의존적 조절을 조사하기 위한 보다 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 유형의 연구를 위한 플랫폼으로, 우리는 CAF의 1차 배양액이 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양하는 실험 모델을 제시합니다.

서론

암 조직은 암 관련 섬유아세포(CAF), 면역 세포, 종양 혈관 및 세포외 기질(ECM)로 구성된 암과 종양 기질 미세환경 사이의 긴밀한 상호 작용을 통해 진화하는 기관의 일종으로 인식될 수 있습니다. CAF는 암세포에 유사분열, 진이동 및 친침습적 효과를 발휘하는 용해성 인자(사이토카인, 성장 인자 및 케모카인)의 주요 공급원입니다. 또한 종양 혈관 형성을 자극하고 골수 유래 세포(BMDC)와 같은 전구 세포를 모집합니다. 활성화된 CAF는 ECM의 생산 및 리모델링에 관여하여 암세포의 성장과 확산을 촉진합니다¹. CAF는 또한 종양 세포 집락 및 전이를 촉진하고 주변 암세포에 줄기세포 표현형을 부여할 수 있는 틈새 시장을 제공합니다. 병리학적 관찰에 따르면 암 조직의 기질 반응 또는 섬유화 변화는 예후가 좋지 않다는 것을 나타냅니다. 최근 연구에서는 유전자 서명과 같은 종양 기질 특징이 환자의 예후를 예측할 수 있음을 입증했습니다. 또한, CAF 파생 요인은 화학요법에 대한 민감도를 조절할 수 있으며, 이는 약물 민감성과 내성을 결정하는 데 있어 CAF의 역할을 강조할 수 있다².

CAF는 종양 미세환경 내에서 CAF와 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 매개하는 신호 경로를 통해 종양 진행을 촉진하는....

프로토콜

참고 :이 연구는 적절한 윤리위원회에 의해 승인되었다.

인간의 폐 섬유 아 세포의 1 차 문화

1. 폐 조직의 컬렉션 :
   1. 직접 수술 수술실에서 인간의 폐 조직 샘플을 얻습니다. 최대한 멀리 종양에서 수집 비 암성 샘플, 암성 및 비 암성 폐 조직으로부터 약 1cm ³ 블록 모아서.
   2. 둘 베코 변형 이글 배지 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 및 0.25 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B (무 혈청 배지)로 보충 (DMEM)에서 샘플을 중단. 멸균 50 ㎖ 튜브에 일시 중단 된 샘플을 유지하고 실험실로 전송합니다.
      주 : 섬유 아세포는 높은 이동성이며 예컨대 상피, 내피 및 평활근 세포 등의 다른 종류의 세포에 비하여 증식. 가지 방법은 섬유 아세포의 이러한 기능을 이용하고, outgro 소요조직 섹션에서 날개 세포는 섬유 아 세포에 풍부하다. 여러 셀 통로 후, 다른 종류의 세포가 정제 된 섬유 아세포 세포 배양 결과, 생존 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM으로 전파하지 못한다. 초대 배양 세포는 다음 3-7 통로를 사용할 수있다.
2. 세포 생장에 대한 절편 문화와 조화 :
   <....

결과

이 공동 배양법, 종양 미세 환경을 흉내 낸 콜라겐 젤에 포함 된 암 세포와 섬유 아세포와의 상호 작용을 연구하기위한 유용한 도구이다. 콜라겐 겔 수축, 암세포의 침윤 및 형태 변화 : 이전의 연구에서, 세 개의 파라미터가이 실험 모델에서 평가 하였다. 암 세포의 증식은 또한 면역 염색 Ki67 ^4를 이용하여 추정 하였다. 폐 조직 샘플을 절제 폐 로브 (도 1A)의 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. 샘플을 잘게 다진시키고 DMEM에서 배양은 10 % FBS (도 1b)로 보충. 조직 절편의 섬유 아세포 성장 현미경 (도 1C)으로 관찰 하였다. 일차 배양 된 폐 섬유 아세포의 콜라겐 겔에 포함되었다 (도 2a, a) 및 A549 폐암 세포 겔상에서 공 배양 하였다 (도 2A, B). 부동 C 후배지 ulture (도 2A는, c),

토론

CAFS 암세포 주변 ECM의 주요 구성 요소를 형성하고, 종양 만 골격을 제공 할뿐만 아니라 적극적으로 종양 발생에 관여하지 ^7. 축적 된 증거 CAF 매개 종양 진행 ^(8)의 중요한 역할을 강조 최종 예후에 CAFS 또는 관련 분자의 영향을 풀어 낸다.

이전 연구에서는 폐 CAFS ^(4)를 분리하는 가지 방법을 사용. 이 실험에서는, 접시 표면에 조직 절편 밀착성의 유지가 매우 중요하다. 세포 배양 배지에 떠있는 조직 절편으로부터 이주 할 수없는 한 조직 절편 표면으로부터 분리되고 나면, 더 이상 같은 배양 접시에 세포의 생장에 사용될 수 없다. 조직의 절단은 접시 표면에 부착하기위한 접착제 역할을 삼출물을 얻을 수 있습니다. 커버 슬립으로 조직 절편을 고정 할 때 사용되는 그리스의 양도이다 critiCAL. 그리스 소량의 그리스가 과도한 세포 배양 영역을 가리는 반면, 부착 된 커버 슬립을 유지하지 못한다. 커버.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	시그마 Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
콜라겐 유형 IA	닛타 젤라틴 Inc.	CELL-1A
재구성 완충액	닛타 젤라틴 Inc.
커버 슬립	NUNC	174934
실리콘 그리스	Dow Corning Toray	고진공 그리스
Dispase I	WAKO	386-02271
6-웰 플레이트	BD Falcon	353046
셀 여과기 (70 μ m)	BD 팔콘	352350