방법 논문

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

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DOI:

10.3791/52469

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2015년 2월 2일

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1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

이 논문에서

요약

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

초록

암 진행(시작, 성장, 침습 및 전이)은 악성 세포와 주변 종양 기질 세포 간의 상호 작용을 통해 발생합니다. 종양 미세환경은 섬유아세포, 면역 세포, 혈관 내피 세포, 주피 세포 및 골수 유래 세포와 같은 다양한 세포 유형으로 구성되며, 세포외 기질(ECM)에 내장되어 있습니다. 암 관련 섬유아세포(CAF)는 수용성 인자의 분비, 혈관 신생 및 ECM 리모델링을 통해 종양 형성을 촉진하는 역할을 합니다. 암세포의 생존, 증식, 이동 및 침입에 대한 실험 모델은 대부분 2차원 단세포 및 단층 조직 배양 또는 Boyden 챔버 분석에 의존해 왔습니다. 그러나 이러한 실험은 병든 장기의 생리학적 또는 병리학적 상태를 정확하게 반영하지 않습니다. 종양 기질 또는 종양 기질 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 얻기 위해 다세포 및 3차원 배양은 세포 간 통신 및 암세포 행동의 ECM 의존적 조절을 조사하기 위한 보다 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 유형의 연구를 위한 플랫폼으로, 우리는 CAF의 1차 배양액이 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양하는 실험 모델을 제시합니다.

서론

암 조직은 암 관련 섬유아세포(CAF), 면역 세포, 종양 혈관 및 세포외 기질(ECM)로 구성된 암과 종양 기질 미세환경 사이의 긴밀한 상호 작용을 통해 진화하는 기관의 일종으로 인식될 수 있습니다. CAF는 암세포에 유사분열, 진이동 및 친침습적 효과를 발휘하는 용해성 인자(사이토카인, 성장 인자 및 케모카인)의 주요 공급원입니다. 또한 종양 혈관 형성을 자극하고 골수 유래 세포(BMDC)와 같은 전구 세포를 모집합니다. 활성화된 CAF는 ECM의 생산 및 리모델링에 관여하여 암세포의 성장과 확산을 촉진합니다1. CAF는 또한 종양 세포 집락 및 전이를 촉진하고 주변 암세포에 줄기세포 표현형을 부여할 수 있는 틈새 시장을 제공합니다. 병리학적 관찰에 따르면 암 조직의 기질 반응 또는 섬유화 변화는 예후가 좋지 않다는 것을 나타냅니다. 최근 연구에서는 유전자 서명과 같은 종양 기질 특징이 환자의 예후를 예측할 수 있음을 입증했습니다. 또한, CAF 파생 요인은 화학요법에 대한 민감도를 조절할 수 있으며, 이는 약물 민감성과 내성을 결정하는 데 있어 CAF의 역할을 강조할 수 있다2.

CAF는 종양 미세환경 내에서 CAF와 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 매개하는 신호 경로를 통해 종양 진행을 촉진하는 데 다각적인 역할을 하기 때문에 암 치료의 새로운 표적으로 점점 더 주목받고 있습니다. 암 미세환경 내 세포 집단의 이질성은 CAF를 표적으로 하는 데 장애물이 됩니다. α-평활근 액틴(α-SMA), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 섬유아세포 특이적 프로텐-1(FSP-1: S100A4라고도 함)과 같은 CAF에 대한 여러 마커가 제안되었습니다. 그러나 이러한 분자 마커는 비암성 조직에 존재하는 다른 세포와 CAF를 구별하는 데 특이적이지 않습니다3. 따라서 CAF의 특정 특성에 대한 더 많은 지식을 얻기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이를 위해 환자와 일치하는 정상 섬유아세포와 비교하여 1차 배양 CAF를 특성화하는 것이 유익합니다.

최근 여러 암 유형에서 환자 유래 CAF에 대한 분석이 보고되었으며, 이는 비암성 조직에서 유래한 섬유아세포와 비교하여 독특한 유전자 발현 패턴과 세포 거동을 밝혀냈습니다. 인간 폐암 조직에서 분리된 CAF를 사용하여 폐 CAF의 특성을 평가할 수 있는 3차원 공동 배양 방법을 개발했습니다. 이 모델에서는 폐암 세포 침입, 증식 및 콜라겐 겔 수축에 대한 CAF의 효과를 조사하여 폐 CAF의 종양 촉진 역할을 실험적으로 요약했습니다4.

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프로토콜

참고 :이 연구는 적절한 윤리위원회에 의해 승인되었다.

인간의 폐 섬유 아 세포의 1 차 문화

  1. 폐 조직의 컬렉션 :
    1. 직접 수술 수술실에서 인간의 폐 조직 샘플을 얻습니다. 최대한 멀리 종양에서 수집 비 암성 샘플, 암성 및 비 암성 폐 조직으로부터 약 1cm 3 블록 모아서.
    2. 둘 베코 변형 이글 배지 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 및 0.25 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B (무 혈청 배지)로 보충 (DMEM)에서 샘플을 중단. 멸균 50 ㎖ 튜브에 일시 중단 된 샘플을 유지하고 실험실로 전송합니다.
      주 : 섬유 아세포는 높은 이동성이며 예컨대 상피, 내피 및 평활근 세포 등의 다른 종류의 세포에 비하여 증식. 가지 방법은 섬유 아세포의 이러한 기능을 이용하고, outgro 소요조직 섹션에서 날개 세포는 섬유 아 세포에 풍부하다. 여러 셀 통로 후, 다른 종류의 세포가 정제 된 섬유 아세포 세포 배양 결과, 생존 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM으로 전파하지 못한다. 초대 배양 세포는 다음 3-7 통로를 사용할 수있다.
  2. 세포 생장에 대한 절편 문화와 조화 :
    1. 수정 5 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 섬유 아세포의 차 문화를 수행합니다.
    2. 실험실에있어서, 배양 배지가없는 10cm 조직 배양 접시에 조직 샘플을 배치하고 작은 섹션으로 잘라 ~ 멸균 겸자 메스를 사용하여 크기가 2 ~ 3 mm이다. 이 과정에서 다른 세포 생장의 효율이 손상 섹션 건조하게하지 마십시오.
  3. 상피 세포층과 결합 조직의 분리 :
    1. 4 ° C에서 16 시간 동안 배양 2,000 PU / ㎖ 디스 파제 I를 포함하는 매체와 문화에 절단 된 조직 절편을 만끽 해보세요.
    2. 접시에 조직 절편을 전송하고, 인접한 결합 조직에서 상피 세포층을 분리합니다. 미생물의 오염을 방지하기 위해 클린 벤치의 섹션을 처리.
      주 : 상피 세포의 초대 배양이 필요한 경우, 단계 130을 수행한다. 단 섬유 아세포가 고립 될 경우 후속 절편 배양 및 세포 통로 정제 된 섬유 아세포 인구를 산출 상피 세포에 대한 불리한 때문에, 1.3 단계를 생략합니다.
  4. 조직 절편의 첨부 :
    1. 두 메스를 사용하여 1mm 조각으로 조직을 말하다. 충분히 작은 조각이 아닌 경우에는 접시으로부터보다 쉽게​​ 분리하고, 세포는 접시 표면에 빨리 성장하지 못할 것이다.
    2. 각 부분을 둘러싸는 빈 영역을 유지하기 위해 서로 떨어져 작은 폐 조직 섹션을 배치. 조직 절편의 부착을 용이하게하기 위해 메스 블레이드를 사용하여 조직 배양 접시의 표면에 흠집을 확인.
      참고 : 긁는또한 세포 마이그레이션 할 수있는 함께 트랙을 제공, 세포 생장을 촉진하기 위해 나타납니다.
      1. 대안 적으로, 개별적 6- 웰 플레이트의 각 웰에 다진 조직편을 배치하고, 커버 슬립으로 그들을 커버. 실리콘 그리스를 사용하여 플레이트의 표면에 커버 슬립을 부착.
      2. 각 웰 멸균 핀을 사용하여 1.5 cm 떨어진 두 지점에서 실리콘 그리스를 놓습니다. 조직편 커버리지 여러 통로 다음 세포 생장 및 세포 증식의 효과를 향상시킨다.
  5. 이후 이식편 문화 :
    1. 샘플이 건조하면 효율적으로 세포 부산물은 대부분 손실로 조직 섹션은, 건조하기 전에 조심스럽게 접시에 배지를 추가합니다. 너무 빨리 조직 섹션은 분리하는 것처럼 매체를 붓지 마십시오.
    2. 10 % FBS와 DMEM에서 배양 세포. 추가 부력에서 분리를 촉진대로, 부동 수 있다는 너무 많은 단지 조직을 충당하기에 충분한 매체를 사용하지만요리.
  6. 셀 통로 :
    1. 배양 접시의 반복​​ 운동이 조직 절편의 이탈로 이어질 수 있으므로 항상주의 문화 매체를 처리합니다.
    2. 5-7일 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 매일 매체를 새로 고침하고 매체 변경하는 동안 최소한의 배양 접시를 처리합니다. 섬유 아세포는 다음 몇 주 동안 조직 절편의 가장자리에서 자라다.
      주 : ~ 2-3주 후 벗어나지 아세포 거의 표면적의 양에 따라, 합류에 도달한다.
    3. 1X PBS로 세포를 씻으십시오, 그리고 나는 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다.
    4. 트립신 처리 한 후, 10 % FBS가 보충 된 DMEM 9 ml의 세포를 사용하여 분리. 조직 절편과 함께 10 ㎖ 튜브 내의 매질에 현탁하고 세포를 모은다. 세포 펠렛을 형성하는 원심 분리 후, 새로운 배지에서 얻어진 펠릿을 재현 탁.
    5. 새로운 막힌에 세포와 조직 섹션을 시드진짜야 요리, 어느 시점에서 조직 세포가 부착하고 성장하는 동안 요리에 연결하는 데 실패. 다음 날, 흡인에 의해 떠있는 조직 조각을 제거하고, 매체를 변경합니다. 첨부 섬유 아세포 이후 문화와 함께 전파.

인간 폐 섬유 아세포 암세포 2. 입체 공동 문화

  1. 세포 및 시약의 제조 :
    1. 약 2 × 10 5 상피 세포와 잘 당 2.5 × 10 5 섬유 아세포를 사용합니다. (3 ㎎ / ㎖, pH를 3), FBS (100 %), 재구성 완충액 (50 mM의 NaOH 등, 260 mM의 NaHCO3을 200 mM의 HEPES)가, 5X DMEM는, DMEM은 섬유 아세포 배양 용 10 % FBS가 보충 된 콜라겐 형 IA 준비 3D 및 공동 배양 배지 (1 : 암세포 섬유 아세포 배양 배지 및 배지 1 혼합물).
    2. 문화 A549 폐 선암 세포, 섬유 아세포 및 DMEM에서 A549 차원 공동 배양은 10 % FBS로 보충.
  2. 콜라겐 겔 Formation :
    1. 1X PBS와 10cm 접시에서 배양 섬유 아세포를 씻고 난 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 ~ 5 분 동안 트립신 처리 후, 10 % FBS가 보충 된 9 ㎖의 DMEM을 사용하여 세포를 분리. 10 ㎖ 튜브에 세포를 배지를 수집하고, 세포 펠렛을 형성하도록 200-300 XG에이를 원심 분리기.
    2. 5 × 105 / ml의 밀도로 100 % FBS에서 얻어진 펠렛을 재현 탁.
    3. 얼음에 콜라겐 젤을 준비합니다. 다음 절차에 앞서 냉장고 시약 피펫 및 튜브 쿨. 심지어 얼음에, 혼합물을 어느 정도 고화하고, 총 부피는 모든 성분의 합보다 작다.
    4. 각 웰에서, FBS에서 섬유 아세포 서스펜션 (2.5 × 10 5 세포)의 0.5 ml의 2.3 ml의 유형 IA 콜라겐, 670 ㎕의 5 배 DMEM, 330 ㎕를 재구성 버퍼를 혼합하여 콜라겐 젤을 준비합니다. 젤은 실온에서 쉽게 설정할 수 있습니다.
      1. 적극적으로 균질 마일을 보장하기 위해 피펫xture. 피펫 팅 과정에서 거품을 만들지 마십시오.
    5. 6- 웰 플레이트의 각 웰에 혼합물 (3 ㎖)를 첨가하고, 30-60 분 동안 방해없이 37 ℃ 배양기에서 허용 아교질로 만들다.
  3. 콜라겐 겔 암 세포 배양 :
    1. 6 수정을 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 입체 공동 문화를 수행합니다.
    2. 1 × 105 / ㎖의 밀도로 3D 공동 - 배양 배지 (또는 A549 세포의 경우에는 10 % FBS를 가진 DMEM)에 재현 탁 암세포.
    3. 각 겔의 표면에 재현 탁 된 세포 용액 (2 × 105 세포) 2 ㎖를 붓는다. 실험 조건에 따라 공동 배양 암 세포 또는 섬유 아세포의 세포 수를 수정한다.
  4. 젤의 수축 :
    1. 암 세포는 콜라겐 겔에 부착 할 수 있도록 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 젤. 각 젤을 분리하고 O를 잘 각각 '부동 문화'를 생성6 잘 판 바.
      주 : 부유 배양을 사용하여 겔 크기에 다양한 변경이 공 배양 암세포와 섬유 아세포 세포 간의 상호 작용에 의해 매개되는 기계적 장력 및 콜라겐 분해에 의해 발생된다.
    2. 우물의 가장자리에서 각 젤을 분리 각도 21 G 바늘이나 작은 주걱을 사용합니다. 2-3 일마다이 3D 공동 배양 배지 2 ㎖로 웰을 새로. 5 일간 매일 각 겔의 크기를 측정한다.
  5. 콜라겐 젤의 분석 :
    1. 이러한 분석 Sircol 콜라겐 정량 방법을 사용하여 각각의 콜라겐 겔 함량을 측정. 젤 5에서 RNA를 수집 한 후 transcriptomic 분석 또는 정량 RT-PCR을 수행합니다.

3. 공기 - 액체 인터페이스 문화 침략 분석

  1. 오일, 37 ° C에서 콜라겐 젤을 배양 한 후, 새로운 6-에 메쉬 (70 ㎛의 공극 크기)을 배치하여 공기 수축 겔을 노출잘 접시. 유동 세포 계측법에 사용되는 시판 셀 스트레이너의 메쉬를 확인합니다.
  2. 부드럽게 3D 공동 배양 배지 11 ml로 각각의 웰을 채운다.
  3. 멸균 스푼을 사용하여 메쉬에 젤을 놓고 젤에 남아있는 모든 매체를 제거합니다. 공기가 겔의 상부 표면을 노출 동안이 상태에서, 중간 젤에서 잠수함. 공기 - 액체 인터페이스 등이 문화 조건을 정의합니다.
    주 : 인큐베이터에서 37 ℃에서 공기 - 액체 계면을 유지 배양 5-7 일 후, 경부암 세포 겔로 이동한다. 세포 유형 및 셀룰러 상호 작용의 결과로서 따라, 암세포에서 세포의 형태 학적 변화의 가변 정도는 공기 - 액체 계면 배양에 의해 유도된다.
  4. 조직 학적 평가를 위해 실온에서 밤새 포르말린 용액에서 겔을 고정하고 파라핀에 포함. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 수직 섹션 (4 μm의) 얼룩​​. 면역 조직 화학 분석 O를 수행n은 섹션 4.

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결과

이 공동 배양법, 종양 미세 환경을 흉내 낸 콜라겐 젤에 포함 된 암 세포와 섬유 아세포와의 상호 작용을 연구하기위한 유용한 도구이다. 콜라겐 겔 수축, 암세포의 침윤 및 형태 변화 : 이전의 연구에서, 세 개의 파라미터가이 실험 모델에서 평가 하였다. 암 세포의 증식은 또한 면역 염색 Ki67 4를 이용하여 추정 하였다. 폐 조직 샘플을 절제 폐 로브 (도 1A)의 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. 샘플을 잘게 다진시키고 DMEM에서 배양은 10 % FBS (도 1b)로 보충. 조직 절편의 섬유 아세포 성장 현미경 (도 1C)으로 관찰 하였다. 일차 배양 된 폐 섬유 아세포의 콜라겐 겔에 포함되었다 (도 2a, a) 및 A549 폐암 세포 겔상에서 공 배양 하였다 (도 2A, B). 부동 C 후배지 ulture (도 2A는, c),

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토론

CAFS 암세포 주변 ECM의 주요 구성 요소를 형성하고, 종양 만 골격을 제공 할뿐만 아니라 적극적으로 종양 발생에 관여하지 7. 축적 된 증거 CAF 매개 종양 진행 (8)의 중요한 역할을 강조 최종 예후에 CAFS 또는 관련 분자의 영향을 풀어 낸다.

이전 연구에서는 폐 CAFS (4)를 분리하는 가지 방법을 사용. 이 실험에서는, 접시 표면에 조직 절편 밀착성의 유지가 매우 중요하다. 세포 배양 배지에 떠있는 조직 절편으로부터 이주 할 수없는 한 조직 절편 표면으로부터 분리되고 나면, 더 이상 같은 배양 접시에 세포의 생장에 사용될 수 없다. 조직의 절단은 접시 표면에 부착하기위한 접착제 역할을 삼출물을 얻을 수 있습니다. 커버 슬립으로 조직 절편을 고정 할 때 사용되는 그리스의 양도이다 critiCAL. 그리스 소량의 그리스가 과도한 세포 배양 영역을 가리는 반면, 부착 된 커버 슬립을 유지하지 못한다. 커버...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 과학 연구를 위한 보조금(KAKENHI)의 지원을 받았습니다(26461185 및 25460137).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM시그마 AldrichD5796
FBSGIBCO10437
콜라겐 유형 IA닛타 젤라틴 Inc.CELL-1A
재구성 완충액닛타 젤라틴 Inc.
커버 슬립NUNC174934
실리콘 그리스Dow Corning Toray고진공 그리스
Dispase IWAKO386-02271
6-웰 플레이트BD Falcon353046
셀 여과기 (70 μ m)BD 팔콘352350

참고문헌

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