파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
이 논문에서
요약
초록
mesDA(mesDA) 뉴런의 퇴화는 파킨슨병 장애의 병리학적 특징입니다. 생리적 기능과 이러한 뉴런의 취약성 및 죽음과 관련된 생물학적 과정에 대한 연구는 근본적인 원인을 이해하고 이 일반적인 신경 퇴행성 질환의 치료법을 밝히는 데 필수적입니다. mesDA 뉴런의 1차 배양은 질병 진행 중 이러한 뉴런의 발달, 장기 생존 및 퇴화를 이해하기 위해 분자, 생화학 및 전기 생리학적 특성을 조사할 수 있는 도구를 제공합니다. 여기에서는 E12.5 마우스(또는 E14.5 마우스) 배아에서 중뇌 도파민 뉴런의 분리, 배양 및 유지를 위한 자세한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 최적화된 세포 배양 조건은 축삭 및 수지상 돌기, 시냅스 연결 및 기타 뉴런 형태학적 특성의 존재를 초래하여 배양을 이 뉴런 집단의 생리학적, 세포적, 생물학적 및 분자적 특성 연구에 적합하게 만듭니다.
서론
흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다.
여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 ....
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프로토콜
참고 : 동물이 유지되고 승인 된 기관의 가이드 라인과 모든 동물의 절차를 준수하여 처리 제국 대학의 동물 복지로 하였다 윤리적 검토 기관 (AWERB) 및 홈 오피스와 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 연방 및 주 정부 규정에.
1. 시약 및 장비 설치
- 해동, 나누어지는 -80 ºC에서 저장 한 ㎎ / ㎖ 라미닌 솔루션입니다. 1-2 ㎍ / ㎠의 코팅 농도 결과 1ml를 DMEM / F12에서 2 μl를 녹인다.
참고 : 천천히 얼음과 판 / 커버 슬립에 추가 즉시 차가운 DMEM / F12에 용해 및 해동 라미닌. - 4 ºC에서 75 ml의 0.01 % 425 ml의 PBS에서 폴리 오르니 틴 L-및 저장의 희석.
참고 : 작업 솔루션의 유효 기간은 1 개월까지이다. - 너희 최대 4 ºC에서 25 % (중량 / 부피) PBS에서 BSA, pH가 7.4, 저장을 녹여아칸소.
- (HBSS)에 50 % FBS 비활성화 미디어를 준비합니다.
- (+) - - 포도당 (중량 / 부피), 0.25 %의 BSA (중량 / 부피) 50 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신, 1 배 N2 보충, 5 ....
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결과
티로신 수산화 효소 (목)에 대한 면역 조직 문화에 세포의 0.5 % 사이가 도파민 것을 보여준다. 티로신 하이드 록 (TH)와 미세 소관 관련 단백질 2 (Map2에) 항체 (그림 3)를 사용하여, 신경 돌기 도금 후 2 시간 이내에 나타나며 첫 날에 의해, 축삭과 수상 돌기는 구별 (그림 2)입니다. 뉴런은 6 주 이상 생존과 광범위한 가지를 보여줍니다. 이전에 나타낸 바와 같이 문화 뉴런 신경교 비 직접 혈청 배지에서의 농도와 관련된다. 비교적 순수한 연결을 문화를 얻을 수있는 문화에서 FBS를 제거하는 동안, 우리와 다른 혈청 또한 문화 9 도파민 신경 세포의 생존을 증가 시킨다는 것을 발견했다.
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토론
중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro - 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 가장 두드러진 신경 변성 질환, 파킨슨 병 (PD) (12, 13)의 주요 병리학 적 특성이다. 현재 치료 방법은 질병의 증상을 해결하고 중지 또는 퇴화 속도를 느리게하고 천천히, 점진적 세포 손실의 원인은 여전히 14 ~ 16 알 수 없습니다. 따라서, 생체 내에서와 developme에의 연구를위한 체외 기법의 개발ntal, 생화학,이 신경 인구의 생리 학적 특성은 PD의 .......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 작업은 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London) 의과대학 뇌과학부(Division of Brain Sciences, Department of Medicine)에서 K.N.A.에 투여한 창업 자금으로 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 변형 Eagle 배지 영양 혼합물 F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), 액상 | Invitrogen | 24020-117 | |
| 소 태아 혈청, 열 비활성화 (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 보충제 (100X), 액상 | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-포도당 용액(물 중 45%(wt/vol) | Sigma | G8769 | |
| 소 혈청 알부민 BSA | Sigma | A9430 | |
| Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 라미닌 | Sigma | L2020 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Invitrogen | 15070 | |
| 트립신(0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) 세포 배양 테스트 | Sigma | A9418 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Sigma | P3813 | |
| 항-티로신 하이드록실라제(Th) 항체 | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% 용액 | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A 및 -2B) 항체 | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 항체 | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 당나귀 항토끼 IgG 항체 | 분자 프로브 | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 당나귀 안티-토끼 IgG 항체 | 분자 프로브 | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 당나귀 안티-양 IgG 항체 | 분자 프로브 | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 당나귀 안티-양 IgG 항체 | 분자 프로브 | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 당나귀 안티-마우스 IgG 항체 | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo | Microscope Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Govern Follows – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| 두 개의 Dumont #45 펜치 – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| 블레이드 홀더/브레이커 플랫 그립 - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| 학생 아이리스 가위 - 스트레이트 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| 광섬유 할로겐 조명기 | Nikon | MKII | |
| 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫 | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| 혈구계 | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 &마이크로; m 멸균 필터 유닛 | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm 페트리 접시 | BD Biosciences | 351005 | |
| 라운드 커버 슬립 #1 두께 독일 유리 12 mm | Bellco 유리 | 1943-10012 |
참고문헌
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P.
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