방법 논문

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

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DOI:

10.3791/52475

⸱

2015년 2월 19일

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

이 논문에서

요약

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초록

mesDA(mesDA) 뉴런의 퇴화는 파킨슨병 장애의 병리학적 특징입니다. 생리적 기능과 이러한 뉴런의 취약성 및 죽음과 관련된 생물학적 과정에 대한 연구는 근본적인 원인을 이해하고 이 일반적인 신경 퇴행성 질환의 치료법을 밝히는 데 필수적입니다. mesDA 뉴런의 1차 배양은 질병 진행 중 이러한 뉴런의 발달, 장기 생존 및 퇴화를 이해하기 위해 분자, 생화학 및 전기 생리학적 특성을 조사할 수 있는 도구를 제공합니다. 여기에서는 E12.5 마우스(또는 E14.5 마우스) 배아에서 중뇌 도파민 뉴런의 분리, 배양 및 유지를 위한 자세한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 최적화된 세포 배양 조건은 축삭 및 수지상 돌기, 시냅스 연결 및 기타 뉴런 형태학적 특성의 존재를 초래하여 배양을 이 뉴런 집단의 생리학적, 세포적, 생물학적 및 분자적 특성 연구에 적합하게 만듭니다.

서론

흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다.

여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 E14.5)의 사용은 생존을 향상시킵니다. 이 나이에 신경 해부 동안 그대로 세포 잎, 이는 아직 축삭을 개발하여 현저하게 수명을 연장해 스트레스를 최소화하지 않았습니다. 또한,이 프로토콜의 2 절에 설명 된대로 복부 중뇌의주의 해부, 더 생존 성을 향상시킨다. 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 대안적인 도금법이 프로토콜 부 (4)에 제시되어있다. 이 아래 4 된 커버에 비해 배아 당 최대 10 된 커버의 수율로 연결표준 도금 조건 따라서 당 실험 동물의 양을 감소시킨다.

축삭과 dentrites의 문화 전시 가지 뉴런은 시냅스 연결을 형성 라이브 세포 이미징, 면역 세포 화학 및 전기 생리학 연구에 대한 이러한 문화가 적합 신경 세포와 시냅스 마커의 존재를 알 수있다. 또한, 신경 세포 배양의 사용은 유전 적 및 약리학 적 조작을 용이하게한다. 체외에서 2 일에서 신경 돌기의 가지 발달 연구 수 있습니다. 또한, 문화의 장기 생존율 (최대 6 주) 뉴런의 느린, 진보적 인 변성의 연구에 적합합니다.

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프로토콜

참고 : 동물이 유지되고 승인 된 기관의 가이드 라인과 모든 동물의 절차를 준수하여 처리 제국 대학의 동물 복지로 하였다 윤리적 검토 기관 (AWERB) 및 홈 오피스와 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 연방 및 주 정부 규정에.

1. 시약 및 장비 설치

  1. 해동, 나누어지는 -80 ºC에서 저장 한 ㎎ / ㎖ 라미닌 솔루션입니다. 1-2 ㎍ / ㎠의 코팅 농도 결과 1ml를 DMEM / F12에서 2 μl를 녹인다.
    참고 : 천천히 얼음과 판 / 커버 슬립에 추가 즉시 차가운 DMEM / F12에 용해 및 해동 라미닌.
  2. 4 ºC에서 75 ml의 0.01 % 425 ml의 PBS에서 폴리 오르니 틴 L-및 저장의 희석.
    참고 : 작업 솔루션의 유효 기간은 1 개월까지이다.
  3. 너희 최대 4 ºC에서 25 % (중량 / 부피) PBS에서 BSA, pH가 7.4, 저장을 녹여아칸소.
  4. (HBSS)에 50 % FBS 비활성화 미디어를 준비합니다.
  5. (+) - - 포도당 (중량 / 부피), 0.25 %의 BSA (중량 / 부피) 50 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신, 1 배 N2 보충, 5 % (부피 / 부피) FBS, 0.36 %의 D를 추가하여 완전한 매체 준비 DMEM / F12 및 저장 4 ºC에서.
    참고 : 유효 기간 10 일입니다.
  6. 적어도 30 분 동안 70 % (부피 / 부피) 에탄올을 끓는 배치 된 커버는 그리스와 오토 클레이브의 모든 흔적을 제거합니다.
  7. 장소 24 웰 플레이트에 된 커버와 각 웰에 500 ㎕의 폴리 -L- 오르니 틴 솔루션을 추가합니다. RT의 조직 문화 후드에서 1 시간을 품어하고, 500 μL 물로 3 회 세척한다. 각 플레이트에 500 μL의 라미닌 솔루션을 추가하고 37 ºC에서 가습 된 조직 문화 인큐베이터에서 O / N을 품어.
    참고 : 더 세척이 24 시간 배양 한 후 세포의 죽음에 폴리 -L- 오르니 틴 세 번보다 적지 결과를 세척, 라미닌 처리 후 필요 없지만.
  8. 천연 가스 토치 f를 통해 유리 피펫의 팁을 폴란드어절름발이.
    참고 :이 단계 후에 팁의 직경이 정상 크기의 절반해야한다.
  9. 멸균 된 가위와 오토 클레이브를 사용하여, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 캡을 잘라.

배아 복부 중뇌 2. 해부

  1. 마취시키다가 시간이 초과 임신 (E12.5) CO 2 흡입 댐 후 자궁 전위에 의해 안락사.
  2. 70 % 에탄올로 복부를 스프레이 자궁 주머니가 모두 노출 될 때까지 복부 절개를합니다. 사용 집게 질 첨부 파일을 절단하고 자궁을 제거합니다. 100mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 HBSS의 자궁을 놓습니다.
  3. 집게 (그림 1C)를 사용하여 자궁과 양막에서 배아를 제거합니다. 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS에있는 장소 배아.
    주 : 그림 1D의 사각형은 배아 복부 중뇌의 위치를 나타냅니다.
  4. 해부 현미경 (10 배 확대)에서 배아를 놓고 중간 뇌를 해부, 지협과 중뇌 - diencephalic 경계 영역에서 뇌를 절단 bioscissor와 집게 사용하여 아치 (그림 1E를 절개 라인도 1a를 참조하십시오).
  5. 전체 중뇌을 복용 한 후, mediodorsal 중뇌 (그림 1 층)에 상처를합니다.
  6. 두 포셉 (그림 1H)를 사용하여, 수막을 제거합니다.
    참고 : 중요한 단계 :이 단계는 최적의 신경 세포 수율과 생존을 위해 필수적이다. 배양 조건은 뇌 세포의 최적이기 때문에, 주위 조직에서 세포의 대부분은 도금 후 다이이 조직으로부터 세포 사멸 신호 문화 무결성이 손상된다.
  7. 멸균 면도날 (도 1H, I)을 사용하여 나비 형상을 관찰하고, 각 날개의 약 절반을 절단하는 페트리 접시에 중뇌 조직을 병합.
    주 : 그림 1J는 격리 된 복부 중뇌를 보여줍니다.
  8. 이동15 ML 원뿔 관에 얼음처럼 차가운 HBSS로 복부 중뇌의 조각 다음 배아를 진행합니다.
    참고 : 2.1-2.8 이상 1 시간을 안 단계. 얼음이 기간을 넘어 배아를 유지하는 것은 상당히 세포 생존 능력을 감소시킨다.

복부 중간 뇌 세포의 3 해리

  1. 층류 후드 하에서 복부 중뇌 조각을 전송. HBSS를 제거하고 (복부 중뇌의 최대 12 조각에 충분한 볼륨을) 원뿔 튜브로 예열 한 ㎖ (37 ° C) 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 37 ºC에서 조직을 품어.
  2. 후드 트립신 EDTA를 제거하고 조직을 1 ml의 탈 활성화 매체 (혈청 트립신을 비활성화합니다)를 추가합니다.
  3. 비활성화 매체를 제거하고 두 번 완전 배지 1 ㎖의의 조직을 씻는다.
    주 : 해리 된 세포를 폐기하는 것을 방지하기 위해, 튜브의 모든 매체를 제거하고 조직을 피펫 피한다.
  4. 1ml의 완전한 매체와 trit 추가화재 연마 유리 피펫으로 조직을 요산. 거품의 형성을 방지하고 단일 세포 현탁액이 달성 될 때까지 분쇄하여 계속합니다.
    참고 : 일반적으로 8-10 완전한 분리에 필요한 제한된 팁을 통과한다.
  5. RT에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기와 매체를 제거합니다.
  6. 다시 일시 중지 천천히 피펫 팅에 의해 완전 배지 1 ㎖의의 펠렛을 위 아래로 4 배합니다.

4. 도금 복부 중간 뇌 세포

  1. 90 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 세포 현탁액 10 μL와 혼합하여 혈구 세포의 수를 계산.
    참고 : 세포의 생존도이 단계에서 확인할 수 있습니다.
  2. 캡의 상단에 한 번에 집게, 하나를 사용하여, 100mm 페트리 접시에 멸균 microcentrifuge 관 뚜껑을 놓고 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다.
    참고 : 된 커버를 세척하지 말고이 uneve의 원인이되므로, 라미닌 건조 방지n 개의 문화와 세포의 생존 감소.
  3. (볼륨 유출없이 커버 슬립의 표면을 덮도록 최적) 완전 배지를 첨가하여 1 μL 당 1500 세포로 볼륨을 조절하고, 각 커버 슬립 위에 세포 현탁액 100 ㎕ (150,000 세포의 합계)를 추가한다. 가습 조직 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 닫고 1 시간 동안 그들을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2).
    주 : CRITICAL 단계 :이 단계는 세포의 부착과 생존을 증강 용 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 필요하다. 대안 적으로, 세포를 직접 웰 (함유 된 커버)하지만 세포의 수 (대신 150,000) 웰 당 350,000 증가되어야로 전달 될 수있다. 직접 전송 때문에 (옆 또는 커버 슬립 아래) 판에 부착 세포의 약 3-4 된 커버를 산출하는 동안 즉,이 방법을 사용하여, 8-10, 커버 슬립, 취득 할 수있다. 평균 viabili이 방법을 사용하여 배양 TY는 약 90 %였다.

5. 문화 성장 및 유지 관리

  1. 배양 1 시간 후에, 조심스럽게 400 ㎕의 예열 (37 ºC까지) 완전 배지 함유하는 24 웰 플레이트에 배지를 포함하여 전송 된 커버 (총 부피 : 500 μl를). 37 ºC에서 세포 O / N을 품어.
  2. 우물의 배양 후 24 시간 이내에, 부드럽게 각 웰에 500 ㎕의 완전 배지를 추가합니다.
    주 : 처음 몇 시간은 도파민 뉴런의 생존과이 지점을 넘어 크게 변하지 않는다 생존 세포의 수에 대한 가장 중요한 단계이다.
  3. 처음 2 주 동안이나 매체가 노란색이 될 때까지 문화에 추가 용지를 추가하지 마십시오. 2 주 이상 또는 신선한 완전한 예열 미디어 (일반적으로 매 2 주) 노란색, 미디어의 교환 절반 (500 μL) 중간 색상 변경을 배양합니다.
    참고 : 내 도파민 뉴런문화는 이러한 조건에서 6 개 이상의 주 동안 살아남을 것입니다.

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결과

티로신 수산화 효소 (목)에 대한 면역 조직 문화에 세포의 0.5 % 사이가 도파민 것을 보여준다. 티로신 하이드 록 (TH)와 미세 소관 관련 단백질 2 (Map2에) 항체 (그림 3)를 사용하여, 신경 돌기 도금 후 2 시간 이내에 나타나며 첫 날에 의해, 축삭과 수상 돌기는 구별 (그림 2)입니다. 뉴런은 6 주 이상 생존과 광범위한 가지를 보여줍니다. 이전에 나타낸 바와 같이 문화 뉴런 신경교 비 직접 혈청 배지에서의 농도와 관련된다. 비교적 순수한 연결을 문화를 얻을 수있는 문화에서 FBS를 제거하는 동안, 우리와 다른 혈청 또한 문화 9 도파민 신경 세포의 생존을 증가 시킨다는 것을 발견했다.

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토론

중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro - 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 가장 두드러진 신경 변성 질환, 파킨슨 병 (PD) (12, 13)의 주요 병리학 적 특성이다. 현재 치료 방법은 질병의 증상을 해결하고 중지 또는 퇴화 속도를 느리게하고 천천히, 점진적 세포 손실의 원인은 여전히 14 ~ 16 알 수 없습니다. 따라서, 생체 내에서와 developme에의 연구를위한 체외 기법의 개발ntal, 생화학,이 신경 인구의 생리 학적 특성은 PD의 ...

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

이 작업은 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London) 의과대학 뇌과학부(Division of Brain Sciences, Department of Medicine)에서 K.N.A.에 투여한 창업 자금으로 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco의 변형 Eagle 배지 영양 혼합물 F-12Invitrogen11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), 액상Invitrogen24020-117
소 태아 혈청, 열 비활성화 (FBS)Invitrogen16140
N2 보충제 (100X), 액상Invitrogen17502-048
D-(+)-포도당 용액(물 중 45%(wt/vol)SigmaG8769
소 혈청 알부민 BSASigmaA9430
Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 라미닌SigmaL2020
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen15070
트립신(0.05% (wt/vol)Invitrogen25300
소 혈청 알부민(BSA) 세포 배양 테스트Sigma A9418
인산염 완충 식염수 (PBS)SigmaP3813
항-티로신 하이드록실라제(Th) 항체Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poly-L-ornithine, 0.01% 용액SigmaP4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A 및 -2B) 항체MilliporeMAB3418
Anti-Synapsin-1 항체MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 당나귀 항토끼 IgG    항체분자 프로브A-21206
Alexa Fluor 594 당나귀 안티-토끼 IgG    항체분자 프로브A-21207
Alexa Fluor 488 당나귀 안티-양 IgG    항체분자 프로브A-11015
Alexa Fluor 594 당나귀 안티-양 IgG    항체분자 프로브A-11016
Alexa Fluor 594 당나귀 안티-마우스 IgG    항체Molecular ProbesA-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))Biowhittaker17-942E
StereoMicroscope Carl ZeissStemi 2000-C
Inverted phase contrast microscopeCarl ZeissAxiovert 40 C
Dumont ForcepsFine Scientific ToolsMay-45
Cover Slip Govern Follows – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
두 개의 Dumont #45 펜치 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
블레이드 홀더/브레이커 플랫 그립 - 11cmFine Scientific Tools10052-11
학생 아이리스 가위 - 스트레이트 11.5 cmFine Scientific Tools91460-11
광섬유 할로겐 조명기NikonMKII
일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫Fisherbrand13-678-20C
혈구계ProscitechSVZ2NIOU
0.2 &마이크로; m 멸균 필터 유닛NalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm 페트리 접시BD Biosciences351005
라운드 커버 슬립 #1 두께 독일 유리 12 mmBellco 유리1943-10012 

참고문헌

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  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

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