마우스 골수 단핵구를 추적 생체

요약

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

초록

실시간 다광자 이미징은 생리학적 3차원 환경에서 세포 이동 및 세포 간 상호 작용을 연구할 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 면역 세포의 생물학적 활동은 주로 면역 세포의 운동 능력에 의존합니다. 혈액 단핵구는 혈류에서 반감기가 짧습니다. 그들은 골수에서 시작되어 구조적으로 골수에서 방출됩니다. 염증성 상태에서는 이 과정이 강화되어 혈액 단핵구증(blood monocytosis)이 발생하고 이후 말초 염증 조직이 침투하게 됩니다. 골수에서 혈관 네트워크로의 단핵구 이동을 제어하는 생체역학적 사건을 식별하는 것은 단핵구 생리병리학적 관련성을 이해하는 데 중요한 단계입니다. Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP(MacBlue) 마우스의 두개골 골수에 대한 이광자 현미경으로 생체 내 타임 랩스 이미징을 수행했습니다. MacBlue 마우스는 혈관 네트워크 표지와 함께 골수성 특이적 프로모터 ¹의 제어 하에 형광 리포터 강화 청록색 형광 단백질(ECFP)을 발현합니다. 이 접근 방식을 통해 개별 수질 단핵구를 실시간으로 추적하여 골수 실질과 혈관 구조 내의 이동 행동과 세포 간 상호 작용을 추가로 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 골수 단핵구 부분 집합의 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 이러한 세포가 특정 병리학적 조건에서 어떻게 영향을 받을 수 있는지 추가로 설명할 수 있습니다.

서론

골수는 조혈에서 중심적인 역할을 하며, 혈액과 수질 실질 사이를 구조적으로 재순환하고, 수명이 짧은 순환 단핵구의 풀을 재생하고^{, 2,3} 정상 상태의 조직-대식세포 및 수지상 세포의 재구성에 참여하는 단핵구의 주요 저장소를 나타냅니다 ⁴. 염증 중 또는 일과성 무형성 후 단핵구는 골수 또는 ^{비장 5, 6, 7}에서 활발하게 동원되어 염증이 있는 장기에 군락을 형성합니다. 여러 화학유인 축이 골수에서 골수성 세포를 동원시키는 과정에 관여해 왔습니다 ^{8, 5, 6,9}. 골수(myeloid compartment)를 넘어서, 골수는 T 림프구 프라이밍(priming)¹⁰의 중요한 부위이자 면역학적 기억의 틈새(niche)이기도 하다^11,12. 따라서 이 조직은 혈액학 및 면역학 분야의 수많은 연구의 중심입니다. 수질 골수성 세포의 구조적 조직에 대한 우리의 지식은 주로 고정 조직의 조직학적 단면 분석에서 비롯됩니다 ¹³. 이러한 정적인 관점은 골수의 기능적 활동의 기초가 되는 골수의 서로 다른 구획 사이의 세포 교환 역학에 대한 연구를 허용하지 않습니다.

Intravital 이미징은 이전에는 in vitro 시스템에서만 설명되었던 세포 이동성, 세포 부착 및 세포 간 상호 작용 연구에서 중요한 생물학적 입력을 구성합니다. 적절한 생체 내 이미징을 위한 기술적 과제에는 광학적 관점에서 관심 조직에 도달하는 능력, 생리적(호흡, 근육 또는 연동 수축) 또는 기계적 드리프트(수술 후 조직 파괴 및 확장, 현미경 대물렌즈에 대한 노출, 온도 및 혈관/산소화 섭동)로부터의 격리를 극대화하는 능력이 포함됩니다. 미세한 드리프트는 초점을 오랫동안 유지하는 능력을 제한할 수 있으며 세포 운동성의 정량화에 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 이러한 기술적 어려움을 줄이기 위해 여러 조직에 대해 검증된 한 가지 대안은 온도 조절 및 산소가 공급된 배지에서 배양된 이식된 조직에 대해 작업하는 것입니다. 그러나 림프 및 혈관 순환의 완전한 중단은 문제가 될 수 있습니다. 두개골 골수의 생체 내 영상은 이러한 문제와 관련하여 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 최소한의 수술만 필요합니다. 둘째, 이 부위의 뼈 두께는 마모 없이 골수 틈새를 직접 시각화할 수 있어 생리학적 섭동을 줄일 수 있습니다. 수질 네트워크는 뼈의 시상 부(parasagittal region)에서 이미지화할 수 있습니다. 그러나 정현파는 뼈 기질이 더 얇은 전두두정엽 영역에서 더 잘 보입니다^12,14.

Intravital 이미징은 관심 모집단을 태그하는 가장 정확한 형광 리포터의 가용성에 의존합니다. 채택 이식 전 정제된 세포 집단에 대한 시험관 내 라벨링은 조혈 줄기세포 틈새(hematopoietic stem cell niches) ¹⁵ 또는 종양 생착에 유리한 골수 내피 미세도메인(bone marrow endothelial microdomains)의 중요한 특성화를 이끌어 냈으며^{, 16} 면역학의 주요 개념에 대한 몇 가지 기본적인 정보를 제공했다 ¹⁷ . 그러나 이 접근 방식은 일반적으로 수십만 개의 세포가 나중에 생체 내에서 이를 검출할 기회를 얻어야 합니다. 이는 염색 후 높은 사망률, 전신의 희석 및 활성화 상태의 변화로 설명할 수 있으며, 이는 편향된 귀환으로 이어질 수 있습니다. 형질전환 마우스 시스템의 내인성 태깅은 이러한 한계를 크게 극복하고 내인성 조골세포(endogenous osteoblast)⁸, 거핵세포(megakaryocytes⁾¹⁸ 또는 골수성 계통 부분 집합(myeloid-lineage subsets⁾⁶의 거동을 이미지화할 수 있게 되었습니다. 그럼에도 불구하고, 연구된 하위 집합 중 형광 리포터의 특이성을 고려할 때 주의해야 합니다.

MacBlue 마우스 ¹이라고 불리는 Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP는 실시간 이미징으로 수질 단핵구를 연구하기 위한 귀중한 형질전환 시스템입니다 ⁶. 고분자량 rhodamin-dextran의 정맥 주사는 골수의 혈관 정현파 네트워크와 수질 실질을 구별합니다. 이 접근법을 사용하면 관심 있는 특정 생리병리학적 맥락에서 다양한 수질 구획의 단핵구 행동을 추적할 수 있습니다. 또한, 특정 항체를 이용한 in vivo labelling을 통해 단핵구 역학과 호중구의 역학을 비교하는 추가 전략을 제안합니다.

프로토콜

참고 : 모든 실험 프로토콜 프랑스 동물 실험 윤리위원회의 승인 번호 A-75-2065에 "서비스 보호 등 상테 짐승 같은, ENVIRONNEMENT"에 의해 검증되었다. 샘플 크기는 실험의 재현성을 보장하기 위해 선택, 동물 윤리 규정의 3R에 따라 있습니다.

마우스 1. 준비

1. 마취
   1. 촬상의 짧은 기간 (1 시간 미만)를 들면, 케타민 (100 ㎎ / kg) 및 크 실라 진 (10 ㎎ / kg)을 함유하는 식염수 용액 200 μL의 복강 내 주사하여 마우스를 마취시키다.
   2. 또한, 영상의 긴 기간 동안 (4 시간까지), 적응 마스크를 통해 O ₂ / N ₂ O의 70/30 혼합물에서 기화 이소 플루 란 2.5 %의 흡입으로 마우스를 마취시키다.
   3. 참고 :이 방법은보다 안정적인 무의식을 제공하고 약물의 시리얼 복강 내 주입을 방지 할 수 있습니다.
   4. 마우스가 마취되면, 니퍼와 발바닥의 자극을 통해 무의식을 확인하십시오.
2. 혈관 염색 / 추가 염색
   1. 혈관의 얼룩 : 꼬리 정맥에 정맥 내 Rhodamin-200 μL의 덱스 트란 (2 MDA 식염수 완충액 중 10 ㎎ / ㎖)을 주입한다.
   2. 호중구 염색의 경우 : 정맥 꼬리 정맥에 생리 식염수 100 ㎕에 (클론 1A8) Ly6G-PE의 2 μg의 주입.
3. 고정화
   1. 고정의 경우, 현미경 및 마취 가스 흡입기에 맞게 맞춤 제작 한 정위 홀더를 사용합니다.
      참고 : sterotactic 소유자는 동물의 머리를 체결 할 수있는 기타 이동식 및 적응 두 개의 금속 플레이트 브래킷, 하나는 고정되어와 함께 금속 지원입니다.
   2. 호흡 운동으로부터 격리를 보장하기 위해 고정 플레이트 사이의 마우스의 머리를 설치합니다. 고정 플레이트와 SK를 스트레칭 머리 사이에 귀를 조인치 안정성과 동물의 호흡 복지를 확인합니다.
4. 두피를 제거
   1. 조심스럽게 눈과의 접촉을 피하고, 멸균 주걱으로 두피의 젖은 머리 에탄올을 70 %를 사용합니다.
   2. 완전히 정면 뼈 정수리 뼈의 후방에서 두피를 제거하기 위해 멸균 가위와 집게로 피부를 잘라. 광범위한 출혈을 방지하기 위해 눈과 귀에서 3mm까지 멀리 할 것. 두개골 (골막)을 덮고있는 느슨한 결합 조직을 제거합니다. 따뜻한 PBS 적신 종이 타월로 남아있는 머리카락을 세척 할 것.
5. 집중 시스템 설정
   1. 직접 분포를 제어하기 위해 작은 게이지 바늘을 이용하여 두개골에 수술 글루 18mm 직경의 고무 링을 붙여. (30 μL가 충분해야한다) 누출을 방지하기 위해 고무 링의 전체 둘레를 붙인다.
   2. PBS 적신 종이 타월로 링에서 마지막으로 한 번 두개골을 청소 한 다음의 완전한 침수 37 ° C PBS를 추가두개골. 안구 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈은 0.9 % 염화나트륨 용액 또는 특정 안연고 방울을 추가한다. 목적에 따라 정위 홀더를 드래그합니다.
   3. 약 직접 전송 현미경을 통해 안구를 사용하여 필드를 놓습니다.

2. 두 광자 이미징 취득

1. 선택적으로 680에서 1080 nm의 동조, NIR 광의 140fs 펄스를 제공 사파이어 레이저, 레이저 전력 제어를위한 음향 광학 변조기 : 티타늄과 결합 다 광자 현미경을 사용한다. 2 다이크로 익 미러 (565 nm에서 690 nm의), 610분의 565 및 550분의 500 대역 통과 필터의 조합 (3 형광 채널의 동시 녹음 가능) 3 외부 비 descanned 감지기 (NDD)를 포함하는 구성을 사용하고, 20 (NA = 1) 침수 목적 × 계획 아포 크로 매트 485 짧은 패스 필터.
2. anaes 좋은 homeothermy 있도록 가열 챔버를 설정thetized 마우스.,
   참고 : 온도는 더 나은 안정성을 위해 세션을 이미징 전에 1 시간을 설정할 수 있습니다. 우리의 경우, 32 ° C는 마취 마우스의 최적의 체온 (36 ~ 37 ° C)를 얻기 위해 선택되었으며, 4 시간까지 유지된다. 이 온도는 사용하는 (디지털 프로브가이 점을 확인하는 데 사용할 수있는) 시스템에 적응 될 수있다. 또한, 사용 된 가열 챔버는 블랙 / 어둡고 외광 오염을 방지 시스템 (목적 및 전동 플레이트)의 일부를 커버한다.
3. 시스템을 켭니다
   1. 사파이어 레이저, 다음 전체 현미경 시스템 : 티를 켭니다. 수집 소프트웨어를 시작합니다. 870 nm의 레이저 파장 범위를 설정. 녹음에 적합한 NDD을 선택합니다.
      참고 : 우리의 경우, 두 번째 고조파 발생 (SHG) ^(19)과 시안 형광 단백질 (ECFP)가 485 짧은 패스 필터 후 NDD에 의해 감지됩니다. 550분의 500 대역 통과 필터 및 rhodamin 덱스 트란이 t에 의해 검출 된 후 ECFP도 NDD 의해 검출그는 NDD 610분의 565 대역 통과 필터 후.
4. 인수 설정을 조정합니다
   1. 소프트웨어의 "라이브 취득"촬상 명령을 사용하여 현미경 방향 제어를 사용하여, 로다 민계 ECFP 신호 영역에 초점을 조정한다. 최소한의 광 손상 최상의 신호 대 잡음비를 구하는 최소 레이저 파워를 설정한다.
      주 : 사용 된 전력 설정은 관심 영역의 깊이에 따라 달라집니다. 일반적 AOM 설정은 15 mW의 주위를 넘어 대물 레이저 파워를 나타내는 약 20 %로 설정된다. 그것은 각각의 NDD이 사진 표백 및 사진 손상을 감소하는 PMT가에 이득 전력을 증가하는 것이 좋습니다. 전형적인 획득 설정 1.58 μS 하나의 화소 지속 시간과 스캔 및 배율 1.5 512 X 512 픽셀의 해상도이다.
5. 관심의 선택 영역
   1. 기록 파라미터가 설정되면, 다시 "라이브"취득 커맨드를 사용실시간으로 모니터링 할 목적 (X, Y, Z)를 선택하는 필드 조직을 조사.
      참고 : 일반적으로, 우리는 혈관 및 실질 영역 모두를 포함하는 필드를 선택했다.
   2. "위치"소프트웨어 명령을 사용하여 필드를 등록합니다.
      참고 :이 명령은 X, Y, 다른 먼 필드의 Z 좌표를 기억합니다.
   3. 선택과 같은 절차를 사용하여 (3까지) 관심의 추가 필드를 등록합니다.
   4. 선택 배율 필요한 볼륨에 따른 제 기억 위치에 "Z-스택"소프트웨어 명령으로 3D의 Z-스택을 설정합니다. 제 깊은 위치하고 높은 위치를 외운다. 깊이 레이저 파워 정규화.
      주 : 여러 부수적 필드 촬상을 위해, 우리는 12 μm의 두께의 체적을 확보하기 위해 각 필드의 3 μm 인 Z-5 단계로 구분하여 슬라이스를 획득. 이러한 설정은 연구 셀의 타입에 적응 될 수있다.
6. 시작 획득
   1. 선택220; 시계열 "소프트웨어 명령 및 시간 간격의 지속 기간과 사이클의 수를 선택한다. "실험을 시작"소프트웨어 명령을 선택하여 필요한 시간의 경과와 기간에 따라 시간 경과 영상을 시작합니다.
      주 : 우리의 경우는 30 분 실시간을 나타내는 60 사이클 동안 하나의 볼륨 각각 30 초를 획득. 작은 시간 경과는 혈관에서 고속 셀 압연을 추적하기 위해 수행 될 수있다. 이 경우, Z 얇게 스택 및 2 개 이하의 상이한 필드에 동시에 기록 될 수있다.
   2. 셋업의 정기적 인 모니터링.
      1. 항상 의식이 있는지 확인하기 위해 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
         참고 : 수염 또는 동물의 다리의 동요는 부흥의 지표입니다. 동물의 호흡이 불규칙적 인 경우에, 이소 플루 란의 양이 다소 감소 될 수있다. 인수시 강한 조직 드리프트는 마우스 부흥의 지표입니다.
      2. 목표를 확인하는 것은 제대로 담근다. 37 ° C PBS의 betwee 갱신N 개의 인수 (30 분).
         참고 : 인수시 신호의 프로그레시브 실종 PBS 누설의 지표입니다.
7. 절차의 끝
   1. 필요한 동영상이 기록되면, 신속하게 심폐 소생술 전에 자궁 전위에 의해 동물을 안락사.
      주 : 상처 치유는 길이 촬상을 수행 할 수있는 가능성을 제한하는 24 ~ 48 시간에 딱지의 형성을 유도.

3. 데이터 분석

1. 드리프트 보정
   1. 3D 자동 추적 Imaris 비트 평면의 소프트웨어를 사용합니다.
   2. Imaris에 3D 이미지 시퀀스를 엽니 다. 선택 명령을 "발견", 균일 분야에서 배포 가능하면, 4 개의 앵커 포인트의 최소 모든 시점 수동 추적 (마우스 클릭 + 이동)을 생성합니다.
   3. "편집 트랙"탭에서 "올바른 드리프트"명령을 사용하여 드리프트 보정을 적용합니다.
   4. t에 대한 확인그는 X에있는 보정, Y, 특히 Z에서의 품질은 artefactual 흔들림을 방지 할 수 있습니다.
      참고 : 보정이없는 만족스러운 경우, 다른 고정 점을 시도하거나 분석에서 비디오를 제외합니다.
2. 셀 추적
   1. 명령 "새로운 관광 명소를 추가"를 사용 및 알고리즘 설정 "시간이 지남에 트랙 명소"를 선택합니다. 다음 단계로 이동합니다.
   2. "소스 채널"명령을 사용하여 관심있는 전체 채널 중 하나를 자동 세포 추적 절차를 적용합니다. 10 μm의 개체를 설정합니다 (즉, 세포) 직경. 다음 단계로 이동합니다.
      참고 : 선택은 측정 된 신호의 객체와 특이도의 차이에 따라 달라집니다. 즉, 전체 채널에 자동 추적은 검출 된 신호가 관심 대상에 특정한 경우에만 가능하다. SHG 및 ECFP 모두 485 짧은 패스 필터 후의 NDD 의해 검출되기 때문에,보다 구체적으로는 트래킹 및 오 후 NDD ECFP 의해 기록 신호를 이용하여 효율적인 것00/550 대역 통과 필터. 클러스터 또는 조밀 한 포장 객체는 3.1.2 단계와 유사 개별 개체의 수동 선택이 필요합니다.
   3. "품질"필터 유형을 선택 불특정 객체의 추적을 제외 할 임계 값을 설정합니다. 다음 단계로 이동합니다.
   4. 두 지점 사이의 "최대 거리"와 "갭의 크기"의 정확한 매개 변수와 함께 "브라운 알고리즘 모션"을 선택합니다. 트랙 생성을 확인합니다.
   5. 트랙이 자동으로 계산되면, "트랙 기간"필터 유형을 선택 인 트랙 (4 시점을 나타내는)보다 짧은 120 초를 제거하기 위해 임계 값을 설정합니다.
   6. 필수 : 자동 추적 한 결과, 트랙의 품질을 확인.
      1. 객체가 트랙 경로를 따라 확인하는 시간 줄을 풀다. , "편집"탭에서 사용할 수 트랙 포인트 보정의 옵션을 사용하지 않는 경우 : "삭제"명령 (모든 트랙 페이지를 삭제하여 허위 또는 부적절한 트랙을 삭제OINT 개별적으로) "연결 해제"명령을 사용하여. 트랙 경로가 불연속 인 경우, 누락 된 시점 (마우스 클릭 + 이동)를 추가 주어진 트랙에서 모든 지점을 선택하고 사용하는 "편집 트랙"탭에서 명령을 "연결".
3. 정량 매개 변수
   1. , "환경 설정"명령에서 "통계"탭을 선택 목록에서 관심있는 동적 매개 변수를 선택합니다. 선택 명령 및 생성 된 엑셀 파일을 저장 "파일을 모든 통계를 내 보냅니다."
      참고 : 여러 동적 매개 변수가 직접적 트랙 길이, 순간 속도, 평균 속도로 소프트웨어에서 얻은, 그리고 직진을 추적하고 있습니다. 운동성 계수 ^{6은, (20)을} 결정할 수 있지만, 소프트웨어에 의해 직접 제공되지 않는다.
   2. 각 셀의 경우, 시간 (ΔT)의 각 기간에 대한 변위의 평균 계산 (30 초 시간 경과 영화를, ΔT는 30, 60, 90 초, 등이 될 것이다).시간 간격의 함수로서 사각형의 평균 변위를 플롯. 곡선의 직선 부분의 기울기를 계산함으로써 운동성 계수를 구하는.

결과

마우스 두개골 구조는 생체 내에 영상에 의해 골수 생리학을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 프런트 정수리 주변 얇게 뼈, 그것은 뼈의 마모없이 medullar 틈새에 접근 할 수있다. 1 MacBlue 트랜스 제닉 마우스의 두개골 넓은 2D 필드를 나타내는 도표. 뼈 매트릭스는 주로 SHG ^(19)에 의해 쉽게 검출 I 콜라겐으로 구성되어있다. rhodamin - 덱스 트란의 주입은 골수의 혈관 네트워크 얼룩과 뼈 매트릭스와 선박 ⁽¹⁴⁾ 사이의 실질 골수 틈새 시장의 식별이 가능합니다. ECFP 세포는 골수의 두 구획으로 분포되지만 골 기질로부터 결석된다. 단구 수동 조직 내에서의 위치에 따라 분류된다. 혈관 단핵구는 전체 셀 용기의 크기를 무시하고, 맥관계 내에있을 때 정의된다. 만 큰 수집 세정맥 우리에서 제외됩니다nalysis. 세포가 혈관 및 골 기질 사이에 위치 할 때 실질 단구 정의된다.

토론

생체 내 영상화 방법의 중요한 점은 영상의 지속 시간을 최대화하고 염증 세포의 역학에 영향을 줄 수있는 세균 오염 및 염증의 위험을 최소화하기 위해 초점 안정성을 보장한다. 수술은 골수에 접근하는 것은 최소한의 수행으로 두개골 골수의 영상은 이러한 목표를 다음과 같습니다. 멸균 물질 및 방부제의 사용은 세포 항상성 교란을 유발할 수있는 감염의 위험을 제한하기 위해 필수적이다.

정위 홀더의 개발은 도전하고 (목적 및 전동 현미경의 무대, 마취 가스 흡입기의 사용 사이의 거리) 특정 각 시스템에 대한 사용자 정의를 필요로 할 수도 있습니다. 이는 넓은 촬상면 액세스 가능한 수평으로 마우스의 머리를 얻는 것이 중요하다. 동물이 배치되면, 몇 분의 requir 수 있다는 가능성ED는 초점면의 양호한 안정성을 얻었다. 따라서, 취득 녹음을 시작하기 전에 조직 드리프트를 확인하는 것이 좋습니다. 관심 지역의 선택과 함께이 과정 동안 지속될 수 있기 때문에, ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	메리알		100 mg/ml, 마취제
자일라진	바이엘 헬스케어		10 mg/ml, 마취제
이소플루란	박스터		2.5%, 마취
O2/NO2			70/30 혼합물, 마취제
로다민-덱스트란	인비트로젠		2 MDa, 10 mg/ml, 혈관 염색
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		클론 1A8, 호중구 염색
위 홀더	집에서 만든		수술
에탄올 70%			수술
멸균 가위 및 집게			수술
고무 링			직경 18mm, 수술
Glubran 2	Queryo 의료		수술용 접착제, 고무 링 고정
소형 게이지 바늘	테루모		수술
Zeiss LSM 710 NLO 다광자 현미경	Carl Zeiss		Microscope
Ti:사파이어 크리스탈 레이저	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec pulses of NIR light
Zen 2010	Carl Zeiss		인수 소프트웨어
Imaris Bitplane	비트플레인		분석 소프트웨어, 3D 자동 추적
PBS 1X	D. Dutscher		수술
온도 조절 챔버	Carl Zeiss		생체 내 이미징