마우스 골수 단핵구를 추적 생체

요약

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

초록

실시간 다광자 이미징은 생리학적 3차원 환경에서 세포 이동 및 세포 간 상호 작용을 연구할 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 면역 세포의 생물학적 활동은 주로 면역 세포의 운동 능력에 의존합니다. 혈액 단핵구는 혈류에서 반감기가 짧습니다. 그들은 골수에서 시작되어 구조적으로 골수에서 방출됩니다. 염증성 상태에서는 이 과정이 강화되어 혈액 단핵구증(blood monocytosis)이 발생하고 이후 말초 염증 조직이 침투하게 됩니다. 골수에서 혈관 네트워크로의 단핵구 이동을 제어하는 생체역학적 사건을 식별하는 것은 단핵구 생리병리학적 관련성을 이해하는 데 중요한 단계입니다. Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP(MacBlue) 마우스의 두개골 골수에 대한 이광자 현미경으로 생체 내 타임 랩스 이미징을 수행했습니다. MacBlue 마우스는 혈관 네트워크 표지와 함께 골수성 특이적 프로모터 ¹의 제어 하에 형광 리포터 강화 청록색 형광 단백질(ECFP)을 발현합니다. 이 접근 방식을 통해 개별 수질 단핵구를 실시간으로 추적하여 골수 실질과 혈관 구조 내의 이동 행동과 세포 간 상호 작용을 추가로 정량화할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 골수 단핵구 부분 집합의 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 이러한 세포가 특정 병리학적 조건에서 어떻게 영향을 받을 수 있는지 추가로 설명할 수 있습니다.

서론

골수는 조혈에서 중심적인 역할을 하며, 혈액과 수질 실질 사이를 구조적으로 재순환하고, 수명이 짧은 순환 단핵구의 풀을 재생하고^{, 2,3} 정상 상태의 조직-대식세포 및 수지상 세포의 재구성에 참여하는 단핵구의 주요 저장소를 나타냅니다 ⁴. 염증 중 또는 일과성 무형성 후 단핵구는 골수 또는 ^{비장 5, 6, 7}에서 활발하게 동원되어 염증이 있는 장기에 군락을 형성합니다. 여러 화학유인 축이 골수에서 골수성 세포를 동원시키는 과정에 관여해 왔습니다 ^{8, 5, 6,9}. 골수(myeloid compartment)를 넘어서, 골수는 T 림프구 프라이밍(priming)¹⁰의 중요한 부위이자 면역학적 기억의 틈새(niche)이기도 하다^11,12. 따라서 이 조직은 혈액학 및 면역학 분야의 수많은 연구의 중심입니다. 수질 골수성 세포의 구조적 조직에 대한 우리의 지식은 주로 고정 조직의 조직학적 단면 분석에서 비롯됩니다 ¹³. 이러한 정적인 관점은 골수의 기능적 활동의 기초가 되는 골수의 서로 다른 구획 사이의 세포 교환 역학에 대한 연구를 허용하지 않습니다.

I....

프로토콜

참고 : 모든 실험 프로토콜 프랑스 동물 실험 윤리위원회의 승인 번호 A-75-2065에 "서비스 보호 등 상테 짐승 같은, ENVIRONNEMENT"에 의해 검증되었다. 샘플 크기는 실험의 재현성을 보장하기 위해 선택, 동물 윤리 규정의 3R에 따라 있습니다.

마우스 1. 준비

1. 마취
   1. 촬상의 짧은 기간 (1 시간 미만)를 들면, 케타민 (100 ㎎ / kg) 및 크 실라 진 (10 ㎎ / kg)을 함유하는 식염수 용액 200 μL의 복강 내 주사하여 마우스를 마취시키다.
   2. 또한, 영상의 긴 기간 동안 (4 시간까지), 적응 마스크를 통해 O ₂ / N ₂ O의 70/30 혼합물에서 기화 이소 플루 란 2.5 %의 흡입으로 마우스를 마취시키다.
   3. 참고 :이 방법은보다 안정적인 무의식을 제공하고 약물의 시리얼 복강 내 주입을 방지 할 수 있습니다.
   4. 마우스가 마취되면, 니퍼와 발바닥의 자극을 통해 무의식을 확인하십시오.
2. 혈관 염색 / 추가 염색
   1. 혈관의 얼룩 : 꼬리 정맥에 정맥 내 Rhodamin-200 μL의 덱스 트란 (2 MDA 식염수 완충액 중 10....

결과

마우스 두개골 구조는 생체 내에 영상에 의해 골수 생리학을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 프런트 정수리 주변 얇게 뼈, 그것은 뼈의 마모없이 medullar 틈새에 접근 할 수있다. 1 MacBlue 트랜스 제닉 마우스의 두개골 넓은 2D 필드를 나타내는 도표. 뼈 매트릭스는 주로 SHG ^(19)에 의해 쉽게 검출 I 콜라겐으로 구성되어있다. rhodamin - 덱스 트란의 주입은 골수의 혈관 네트워크 얼룩과 뼈 매트릭스와 선박 ⁽¹⁴⁾ 사이의 실질 골수 틈새 시장의 식별이 가능합니다. ECFP 세포는 골수의 두 구획으로 분포되지만 골 기질로부터 결석된다. 단구 수동 조직 내에서의 위치에 따라 분류된다. 혈관 단핵구는 전체 셀 용기의 크기를 무시하고, 맥관계 내에있을 때 정의된다. 만 큰 수집 세정맥 우리에서 제외됩니다nalysis. 세포가 혈관 및 골 기질 사이에 위치 할 때 실질 단구 정의된다.

토론

생체 내 영상화 방법의 중요한 점은 영상의 지속 시간을 최대화하고 염증 세포의 역학에 영향을 줄 수있는 세균 오염 및 염증의 위험을 최소화하기 위해 초점 안정성을 보장한다. 수술은 골수에 접근하는 것은 최소한의 수행으로 두개골 골수의 영상은 이러한 목표를 다음과 같습니다. 멸균 물질 및 방부제의 사용은 세포 항상성 교란을 유발할 수있는 감염의 위험을 제한하기 위해 필수적이다.

정위 홀더의 개발은 도전하고 (목적 및 전동 현미경의 무대, 마취 가스 흡입기의 사용 사이의 거리) 특정 각 시스템에 대한 사용자 정의를 필요로 할 수도 있습니다. 이는 넓은 촬상면 액세스 가능한 수평으로 마우스의 머리를 얻는 것이 중요하다. 동물이 배치되면, 몇 분의 requir 수 있다는 가능성ED는 초점면의 양호한 안정성을 얻었다. 따라서, 취득 녹음을 시작하기 전에 조직 드리프트를 확인하는 것이 좋습니다. 관심 지역의 선택과 함께이 과정 동안 지속될 수 있기 때문에, .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	메리알		100 mg/ml, 마취제
자일라진	바이엘 헬스케어		10 mg/ml, 마취제
이소플루란	박스터		2.5%, 마취
O2/NO2			70/30 혼합물, 마취제
로다민-덱스트란	인비트로젠		2 MDa, 10 mg/ml, 혈관 염색
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		클론 1A8, 호중구 염색
위 홀더	집에서 만든		수술
에탄올 70%			수술
멸균 가위 및 집게			수술
고무 링			직경 18mm, 수술
Glubran 2	Queryo 의료		수술용 접착제, 고무 링 고정
소형 게이지 바늘	테루모		수술
Zeiss LSM 710 NLO 다광자 현미경	Carl Zeiss		Microscope
Ti:사파이어 크리스탈 레이저	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec pulses of NIR light
Zen 2010	Carl Zeiss		인수 소프트웨어
Imaris Bitplane	비트플레인		분석 소프트웨어, 3D 자동 추적
PBS 1X	D. Dutscher		수술
온도 조절 챔버	Carl Zeiss		생체 내 이미징