방법 논문

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

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⸱

DOI:

10.3791/52480

⸱

2015년 1월 7일

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

이 논문에서

요약

흐름에서 백혈구를 모집 염증이 혈관 내피 세포의 기능은 중간 엽 기질 세포에 의해 조절된다. 우리는 흐름 호중구 모집을 평가하고 간엽 기질 세포가 이러한 과정을 조절하는 것을 재생 역할을 조사하는데 사용될 수있다 일차 인간 세포를 통합 두 시험 관내 모델을 설명한다.

초록

기질 세포는 이웃 내피 세포와 크로스 토크 (cross-talk)를 통해 염증 동안 순환 백혈구의 채용을 조절한다. 여기에서 우리는 염증이 혈관 내피 세포에 의해 흐름에서 호중구 순환의 모집을 공부 두 체외 "혈관"모델을 설명합니다. 이러한 모델의 주요 이점은, 생체 내에서 발생할 수있는 바와 같이, 순서대로 백혈구 접착 캐스케이드의 각 단계를 분석하는 능력이다. 우리는 또한 두 모델은 백혈구 모집을 조절하는,이 경우 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 기질 세포의 역할을 연구하기 위해 적용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

기본 내피 세포는 Ibidi의 microslides에 24 시간 동안없이 Transwell 필터의 반대편에 직접 접촉하는 인간의 MSC 혼자 또는 함께 배양 하였다. 배양 4 시간 동안 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)로 자극과 흐름 기반 부착 분석법에 혼입 하였다. 호중구의 루스는 관류되었다4 분의 내피 세포 이상. 호중구와 내피 세포와의 상호 작용을 흐르는 캡처 위상차 현미경으로 시각화했다.

두 모델에서 사이토 카인 자극은 용량 의존적으로 흐르는 호중구의 내피 모집 증가했다. 모집 호중구의 거동 분석 압연 용량 의존적 감소 및 내피 통해 이주에서 용량 의존적으로 증가 하였다. 공동 문화에서, MSC는 TNFα 자극 내피 세포에 호중구 부착을 억제.

우리 플로우 기반 유착 모델에서 순환 백혈구 보충의 초기 위상을 모방. 백혈구뿐만 아니라, 그들은 그러한 치료 학적 투여 MSC 또는 순환하는 종양 세포와 같은 다른 세포 유형의 채용을 검토 할 수있다. 우리의 다층 공동 문화 모델은 MSC는 염증성 사이토 카인에 대한 반응을 수정하는 내피 세포와 통신 것으로 나타났습니다, alteri호중구의 모집 겨. 이러한 모델을 사용하여 더 많은 연구가 완전히 다른 조직 및 조건 (염증성 질환 또는 암)에서 어떻게 기질 세포를 이해 염증시 백혈구의 채용에 영향을 미치는 데 필요합니다.

서론

염증은 해상도 1,2를 허용하는 염증 조직에서 꽉에 백혈구 항목의 규제와 출구를 필요로 미생물 감염이나 조직 손상에 대한 보호 반응이다. 내피 세포 (EC) 그 라인 혈관 순환 백혈구 및 조직 상주 기질 세포 사이의 크로스 토크 (cross-talk)이 과정 3을 조정 필수적이다. 그러나 백혈구의 통제되지 않은 모집 및 효과 간격은 만성 염증성 질환 4의 개발을 뒷받침. 건강과 질병에서 백혈구 모집의 우리의 현재 이해는 불완전하며 더 강력한 모델은이 과정을 분석 할 필요가있다.

후 모세관 세정맥 혈관 EC를 통해 혈액에서 백혈구의 채용을 지원하는 메커니즘은 잘 1,2,5을 설명 하였다. 순환 백혈구 전문 수용체 (예를 들면, VCAM-1, E-셀렉틴, P- 셀렉틴)에 의해 캡쳐 된염증이 내피 세포에까지 조절한다. 이러한 과도 상호 작용은 백혈구 표면에 결합 된 케모카인 및 백혈구 6 (11)에 의해 표현 인테그린을 활성화 지질 파생 매개체 (기원 내피 또는 기질 중 하나)과 상호 작용 할 수 있습니다. 이것은 차례로 내피 세포 및 전 조직 12 (15)에 부착 및 드라이브 마이그레이션을 안정화시킨다. 조직 내에서 백혈구가 자신의 운동, 기능과 생존 16, 17에 영향을 미치는 기질 유래 요원을 실시 모집. 성장하는 증거가 강력하게 신호가 다음의 채용 과정 조건 백혈구의 각 단계에서 수신하는 것이 좋습니다. 그러나, 백혈구 모집에 대한 우리의 이해가 불완전 남아 있고 아주 작은 조직 내에서 구성 요소를 형성 백혈구의 이동에 대한 알려져있다.

버밍엄에서 우리는에서 백혈구의 채용을 연구하기 위해 체외 "혈관"모델의 여러 개발9,18,19 흐름. 우리는 지금 백혈구 모집의 혈관 EC 행위로 즉시 규제가 로컬 미세 환경의 변화에​​ 대응하는 것으로 알고 있습니다. 구체적으로는, 조직 상주 간질 세포가 활발히 채용 3에서의 역할에 영향을 미칠 인접한 혈관 EC와 대화에 의해 부분적으로, 염증 반응을 조절할 수있다. 우리는 이전에 각종 간질 세포 조직 - 특이 적 방식으로 부착 및 백혈구의 이동을 지원하기 위해 EC의 기능을 조절하는 것으로 나타났다, 이러한 효과는 만성 질환 13,16,20,21에서 변경 될 수있다. 따라서, 간질 세포를 각각의 염증 반응 (22)의 상황을 특징 짓는 조직 '주소 부호'를 확립한다. 최근에, 우리는 골수 유래 MSC (BMMSC)이 강력하게 모두 호중구의 모집에 감소로 이어지는, 사이토 카인에 대한 EC의 반응을 하향 조절하고 23 림프구 것을 증명하고있다.

메커니즘은 GOV규율하는 모집 해명은 주로 시험 관내에서 분리 한 세포 유형 (예, EC) 또는 단백질을 혼입 분석을 이용했다. 그러나, 이들 연구는 고려하지 않는 조직 로컬 환경의 영향 (즉, 기질 세포의 존재) 백혈구의 모집 및 그 이후의 조직 내로 이동. 여기서 우리는, 간질 세포가, 구체적으로는 중간 엽 줄기 세포를 두하는 플로우 기반 방법 (MSC)를 설명하는 EC 23 공 배양된다. 이러한 모델은 우리가 흐름에서 백혈구 채용을 지원하는 특별한 능력 내피 반응에 기질 세포의 효과를 검사 할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 분리 및 문화 차 인간의 내피 세포와 중간 엽 줄기 세포의

  1. 단리 및 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) :
    1. 종이 타월로 트레이에 탯줄을 넣고 70 % 에탄올 스프레이. 조직 문화 후드에 배치합니다. 양쪽 끝의 정맥 cannulate을 확인합니다. 고정하기 위해 유관 끝 주위에 케이블 타이를 놓습니다.
    2. PBS는 주사기를 이용하여 정맥 혈액을 세척 할 것. 공기와 주사기를 입력하고 제거하고 잔여 PBS를 폐기하기 위해 정맥을 통해 전달합니다.
    3. 및 10 ㎎ / ㎖의 콜라게나 Ia 형 녹여 1 mg / ml의 최종 농도로 (칼슘 및 마그네슘 클로라이드)와 PBS에서 1:10 희석. 모두 캐 뉼러가 작성 될 때까지 정맥에 콜라겐 솔루션을 전달합니다. 양쪽 끝에서 캐 뉼러에 클램프를 닫습니다.
    4. 조직 트레이 커버 및 70 % 에탄올 스프레이. 37 ° C에서 20 분, 5 % CO 2 인큐베이터에 코드를 배치합니다.
    5. 밖으로 코드를 가지고및 인큐베이터의 케이블 타이를 조입니다. 1 분 동안 부드럽게 코드를 마사지. 10 ml의 PBS로 세포 현탁액을 씻어 내고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 수집한다.
    6. 공기로 채우고 주사기 단계 1.1.5에서 사용 된 50ml 원심 분리 튜브에 수집 PBS 회 잔류 PBS를 제거 정맥 통과. RT에서 5 분 400 XG에 원심 분리기.
    7. 1 ml의 완전한 EC 매체에서 기음 뜨는에 resuspend 펠렛. EC 매질은 35 ㎍ / ml의 겐타 마이신 황산염, 10 NG / ㎖ 인간 표피 성장 인자, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 2.5 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 및 20 % 소 태아 혈청이 보충 된 M199 이루어져있다.
    8. 25cm 2 플라스크에 EC 매체와 EC 현탁액의 4 ML을 추가합니다. 다음날 매체 후 2 일 간격을 변경합니다.
    9. EC는 조약돌 모양의 형태 (그림 1Ai)를 나타낸다. 접착 분석의 경우, EC는 일반적으로 그들은 100 % 합류에 도달했을 때 (1.4 절 참조 씨를 뿌린다 ).
  2. 인간의 탯줄에서 와튼의 젤리의 중간 엽 줄기 세포 (WJMSC)의 분리 :
    1. 신선한 탯줄에서 이미 EC를 격리하는 데 사용 된 코드에서 와튼의 젤리 유래 MSC (WJMSC)를 분리합니다. 5cm 긴 조각으로 탯줄을 잘라. 혈관 공개 길이 방향으로 각각의 조각을 잘라 (2 동맥 [흰색, 견고한] 1 정맥 [노란색, 팽창).
    2. 멸균 가위와 집게가 혈관을 제거하고 폐기 사용. 3 mm의 3 개 - 2로 모든 조직을 잘라. 50 ㎖ 원심 분리 관에 3mm 3 개 - 집게 장소 2를 사용.
    3. 100 ㎎ / ㎖의 스톡 콜라게나 제 II 형을 해동하고 희석 한 1 mg / ml의 최종 농도로 10 ml의 PBS에서 100. 20,000 U / ㎖의 히알루로 스톡을 해동 한 희석 : 400 콜라게나 제 용액에서 50 U / ㎖의 최종 농도.
    4. 조직 단편을 함유하는 원심 분리 관에 추가 효소 칵테일. 조직 fragmen을 품어느린 회전에 37 ° C에서 5 시간 동안 TS.
    5. 세포 현탁액 1을 희석 : 5 PBS에. 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 100 μm의 기공 필터를 배치합니다. 100 ㎛ 세공 필터 상에 세포 현탁액을 붓는다.
      주 : 조직편 남은 필터에 보유하며 세포을 50㎖ 원심 관에 수집한다.
    6. 필터를 폐기하십시오. RT에서 10 분 동안 400 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 12 ml의 완전한 WJMSC 배양 배지 (DMEM 낮은 포도당, 10 % FCS 100 U / ml의 페니실린 + 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 혼합)에서 기음 뜨는에 resuspend WJMSC 펠렛.
    7. 75cm 2 조직 배양 플라스크에서 모든 셀을 시드. 12 ml의 완전한 WJMSC 배양 배지와 24 시간 후 매체를 변경합니다. 3 일 - 매 2 매체를 교체합니다. 이주 내에서 80 %의 합류 - 셀 (70)에 도달한다. 통로는 WJMSC 70에 도달했을 때 - 80 %의 합류 (1.4 절 참조).
  3. 골수 유래 MSC (BMMSC)의 확장 :
    1. 이전 24 설명 된대로 인간 골수 유래 MSC (BMMSC)를 분리합니다. 15 ml의 원심 분리 튜브에 10 ㎖ 예열 MSC 성장 배지 (MSCGM)를 추가한다.
    2. 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 P2 BMMSC의 바이알을 해동. MSCGM를 포함하는 원심 분리기 튜브에 BMMSC 서스펜션을 추가합니다. 피펫으로 잘 섞는다.
    3. RT에서 5 분 400 XG에 원심 분리기. 기음 완전히 뜨는.
    4. 1ml를 MSCGM에 재현 탁하고 세포는 혈구 cellometer로서 또는 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
    5. 12 ml의 MSCGM의 cm 2 당 6,000 세포 - 5000의 밀도에서 75cm 2 배양 플라스크에 씨앗 세포. 12 ml의 MSCGM와 24 시간 후 매체를 변경합니다. 12 ml의 MSCGM와 피드 세포마다 2~3일.
    6. 통로는 BMMSC 70에 도달했을 때 - 80 %의 합류 (1.4 절 참조). 세포는 섬유 모세포의 형태 (그림 1Aii)를 나타낸다.
  4. EC와 MSC의 분리 :
    1. 25cm 2 배양 플라스크에서 대기음 매체. 약 2 분 동안 0.02 %의 EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 기음 EDTA 2 ㎖의 트립신을 추가 (2.5 ㎎ / ㎖). 현미경으로보기 세포는 라운드가 될 때까지.
    2. 세포를 분리 플라스크를 누릅니다. 8 ml의 배지를 추가하여 트립신을 비활성화, 15 ML의 원심 관에 문화 플라스크 및 전송 정학 (세포 유형에 의존을 HUVEC, BMMSC에 대한 WJMSC 및 MSCGM에 대한 DMEM LG에 대한 EC 매체).
    3. RT에서 5 분 400 XG에 원심 분리기. 아래에 설명 된대로 기음 뜨는 및 펠렛을 재현 탁.
      1. MSC, 3 ml의 배지에 재현 탁 펠릿 용 계대. 별도의 세 75cm 2 배양 플라스크에 11 ml의 배지를 추가합니다. (: 3 분할 1) 각 문화 플라스크에 1 ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 통로 WJMSC와 공동 배양 분석에 사용하기 전에 BMMSC 3 회 (P3).
      2. 접착 분석에서 EC 또는 MSC를 시드 - 2 항과 3 항을 참조하십시오.
  5. 냉동 MSC :
    1. 통로 (3) 분리의 MSC에서 1.4 절에 설명 된대로. 3 ㎖ 얼음처럼 차가운 CryoSFM에서 기음 뜨는에 resuspend. 1.5 ml의 빙냉 크리오 바이알 (cryovial) 내로 세포 현탁액 1 ㎖를 피펫 분취. 냉동 컨테이너에 크리오 바이알 (cryovial)를 넣습니다.
    2. -80 ° CO / N에서 컨테이너를 저장합니다. 액체 질소로 전송합니다. MSC의 해동 유리 병 (후속 1.3.1 단계 - 1.3.6). 5 ml의 배양 배지에 재현 탁 MSC 25cm 2 플라스크에 넣고 종자 (해당 WJMSC 또는 BMMSC을위한 매체 선택).

2. Ibidi Microslides에 내피 세포 - 중간 엽 줄기 세포의 공동 문화 구축

  1. (; 제 1.4 ~ 1.5 × 10 6 세포) EC의 합류 25cm 2 플라스크를 Trypsinize. 재현 탁 EC 380 μL MSCGM에 (1 × 25cm 2 플라스크에 접착 분석의 모든 세포 타이 두 6 채널 Ibidi의 microslides (~ 1.25 × 10 5 / 채널)를 배정합니다PES)은 MSCGM에서 배양. 각 채널에 EC 현탁액의 30 μl를 추가합니다 (이 모세관 작용을 통해 성장 영역을 커버한다). 1 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 Ibidi의 마이크로 슬라이드를 품어 5 %.
  2. 각 채널에 140 μL MSCGM을 추가 한 다음 전원을 껐다가 대기음. 3 세척 총 두 번 반복합니다. 24 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 인큐베이터에서 140 μL MSCGM과 장소를 추가하고 5 %.
  3. 공동 문화에 대해 MSC (1.4 절)을 분리. 혈구 또는 cellometer를 사용하여 세포 수를 수행합니다. 1.5 × 105 세포 / ml로 MSC의 농도를 조정.
  4. (중간에 채널 만 성장 떠나는 영역) Ibidi 채널로부터 과량 대기음 매체. Ibidi 채널에 MSC 서스펜션의 ㎕를 추가합니다. 채널의 성장 영역으로부터 배출 된 매체를 대기음 MSC 현탁액, 30 μL를 추가한다. 한 번 더 반복 한 후 37 ° C, 5 % CO 2 <에 인큐베이터에서 Ibidi의 마이크로 슬라이드를 배치1 시간 동안 / 서브>.
  5. 각 채널에 140 μL MSCGM을 추가 한 다음 전원을 껐다가 대기음. 3 세척 총 두 번 반복합니다. 24 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 인큐베이터에서 각 채널과 장소에 140 μL MSCGM의 최종 볼륨을 추가하고 5 %.
  6. 1 × 105 U / ml의 재고 TNFα를 해동 한 희석 : 100 U / ml의 최종 농도 (당량 ~ 10 NG / ㎖)에 MSCGM에 1,000. 10 U / ㎖를 얻기 위해 MSCGM 1:10 100 U / ㎖ TNFα를 희석하여 일련의 희석을 수행합니다. 1 U / ㎖를 얻었다 MSCGM 1:10 10 U / ㎖의 TNFα를 희석.
  7. 분석하기 전에 4 시간 동안 37 ° C에서 TNFα와 채널을 취급합니다. 사이토 카인 치료 중 온도 변화가 관찰 호중구 모집의 패턴을 변경합니다. 처리되지 않은 채널에 신선한 MSCGM를 추가합니다.

3. 내피 세포 - 중간 엽이 필터에 세포 공동 배양 줄기 구축

  1. 1.4 절에 설명 된대로 WJ 또는 BMMSC를 분리합니다. 펠렛을 재현 탁1 ml의 MSCGM에. 혈구 또는 cellometer를 이용한 세포 계수를 수행하여 세포.
  2. 최종 농도가 MSCGM 500 μL에 5 × 10 5 MSC가되도록 볼륨을 조정합니다.
  3. 사용 멸균 집게는 무균 상자에 6 자, 0.4 μm의 PET없이 Transwell 필터와 장소를 반전.
  4. 필터의 외부 표면 상에 시드 5 × 5 MSC. 1 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 필터를 부화 5 %.
  5. 필터의 외부 표면에서 미디어를 수집합니다. 미디어 미부착 MSC의 수를 계산. 3 ㎖ MSCGM를 포함 일치하는 6 웰 플레이트에 살균 포셉과 장소를 사용하여 다시 반전 필터.
  6. 필터 (그림 1B)의 내부 표면에 MSCGM 2 ㎖를 추가합니다. 24 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 인큐베이터에 넣고 5 %. (; 1.4 절과 같은 그림 1Ai) EC의 합류 25cm 2 플라스크를 Trypsinize.
  7. 8 ml의 MSCGM에 EC를 재현 탁 (1 × 25cm 2 플라스크 위스콘신LL 씨 네 6 자 필터; ~ 5 × 10 5 EC / 필터). 다공질 필터의 상단과 하단에서 대기음 매체. (필터 아래) 하부 챔버에 3 ㎖ 신선한 MSCGM을 추가합니다. 각 필터의​​ 내면에 2ml의 EC 현탁액을 추가한다. 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO 2 품어.
  8. 대기음 매체는 비 부착 EC를 씻어 신선한 MSCGM로 교체합니다. 첫 번째 시드 MSC없이 내부 표면에 세포를 파종하여 병렬 EC 모노 문화 필터를 설정합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어 5 % CO 2.
  9. EC 단일 층이 합류하고 틈이 없는지 확인합니다. 서브 컨 플루 언트 단층 접착 분석 (도 1b)에 사용될 수 없다.
  10. 1, 10 또는 100 U / ㎖의 TNFα로 필터의 상부 및 하부 챔버 치료 (당량 ~ 10 NG / ml)로 4 시간 동안 37 ° C에서 (섹션 2 참조) 분석에 앞서.

백혈구 4. 분리

  1. 정맥을 타고건강한 자원 봉사자들과 나누어지는에서 즉시 EDTA 튜브에 혈액. 반전 튜브 부드럽게 혼합합니다.
  2. 10 ml의 2.5 ml의 Histopaque 1119 상 1077 Histopaque 레이어 2.5 ml의 둥근 튜브를 바닥. 5 층 ml의 Histopaque 구배 상 전혈. 실온에서 40 분 동안 800 XG에 원심 분리기.
  3. (적혈구 층 이상) Histopaque 1077과 1119의 인터페이스에서 수확 주변 다형 핵 호중구 (PMN). 둥근 튜브를 바닥 10ml에 놓고 PBSA 10 ml의 구성. 부드럽게 RT에서 5 분 동안 400 XG에서 튜브를 원심 반전.
  4. (; PBSA / V w) 0.15 %의 최종 농도 (칼슘 및 마그네슘 클로라이드)와 함께 100 ㎖의 PBS에 7.5 % BSA 용액의 1:50 희석. 10 ml의 PBSA에서 기음 뜨는에 resuspend. RT에서 5 분 400 XG에 원심 분리기.
  5. 1 ml의 PBSA에 재현 탁. 세포 현탁액의 20 μL 나누어지는을 가지고 380 μL PBSA (1시 20분 희석)에 추가합니다. 혈구 또는 cellometer를 사용하여 세포를 계산합니다. 필요한 conce에 희석ntration PBSA에 (없이 Transwell 필터와 Ibidi의 마이크로 슬라이드 1 × 106 / ㎖). 분석 할 때까지 실온에서 호중구 서스펜션을 유지한다.

5. 흐름 시스템을 조립

  1. 도 1c에 도시 된 바와 같이 유동 시스템을 설정한다. 히터를 켜고 37 ℃로 설정합니다. 3 방향 탭에 20 ML의 주사기 (플런저를 제거)와 5 ML의 주사기를 연결합니다. 미세 기공 테이프를 사용하여 방풍 실에 탭을 연결합니다.
  2. 측정 약 밸브와 3 방향 탭 사이의 거리 규소 2/4 mm (두께)의 긴 튜브 조각을 잘라. 1/3 mm (얇은)​​ 튜브 10mm 긴 부분과 두꺼운 튜브의 한쪽 끝 삽입 - 팔을 잘라. 3 방향 탭에 두꺼운 튜브 측을 연결합니다.
  3. 전자 3 방향이 개소의 포트에 얇은 튜브 끝을 연결합니다. 이것은 "세척 저수지"입니다. 두껍고 얇은 튜브 8mm 긴 조각 - 6 컷.
  4. 두꺼운 튜브의 한쪽 끝으로 얇은 튜브를 삽입합니다. AT & T는두꺼운 튜브가 2 ML의 주사기에 종료 ACH (플런저 제거).
  5. "샘플 저장"을 만들기 위해 전자 마이크로 밸브의 포트에 2 ML의 주사기의 얇은 튜브 끝을 연결합니다. 측정 및 마이크로 밸브와 현미경 스테이지의 중심 사이의 거리 얇은 튜브의 긴 조각을 절단하여 필터 챔버 유동 밸브를 연결한다.
  6. 얇은 튜브의 끝에 두꺼운 튜브 10mm 조각 - 마이크로 슬라이드 모델의 경우, 8을 연결합니다. 두꺼운 튜브의 끝에 커넥터 모양의 L를 놓습니다. 이것은 마이크로 슬라이드에 연결됩니다. 얇은 튜브의 끝에 튜브를 연결 Portex 블루 라인 압력계의 10mm 조각 - 필터 모델의 경우, 8을 연결합니다.
  7. 마이크로 밸브 위에 얇은 튜브 끝을 놓습니다. 이 세척 및 샘플 저수지의 공통 출력됩니다. PBSA와 저수지를 입력합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 그들을 통해 PBSA 흐르는하여 국무 튜브.
  8. 29mm (50 ㎖) 유리의 압력계에 튜브를 연결합니다yringe. 10 ml의 PBSA로 작성하여 국무 주사기. 튜브에 연결된 단부가 위쪽으로 향하도록 주사기를 전환하고 모든 기포를 밀어 낸다. 5 ml의 PBSA와 리필.
  9. 유리 주사기로 이어지는 압력계 튜브의 끝에 두꺼운 튜브 12mm 조각 - 만하는 마이크로 모델의 경우, (10)을 연결합니다. 두꺼운 튜브의 끝 부분에 커넥터 모양의 L를 놓습니다. 주입 / 철수 주사기 펌프에 유리 주사기를 놓습니다.
  10. 0.1Pa로 (없이 Transwell 필터) 또는 0.05 실바 (Ibidi의 microslides) 다음 식을 사용하여 소망의 벽 전단 응력을 생성하는데 필요한 리필 유량 (Q) (τ 파스칼 w, 펜실바니아) 계산 :
    γ w = (6.Q) / (WH 2)
    τ = n.γ
    여기서 w = 폭과 내부 유동 채널의 내부 깊이 = H. N = 흐르는 용액의 점도; PBSA는 N = 0.7 mPa · s 인입니다 평행 판 필터 유동 챔버를 들면, 폭 (w)은 4mm 및 깊이 (H) 0.133 mm이다. D챔버의 epth 인해 사용되는 파라 필름 가스켓의 두께의 차이로 약간 다를 수 있습니다. Ibidi의 마이크로 슬라이드를 들어, 폭이 3.8 mm이며 깊이는 0.4 mm이다.
    주 : 유동 채널의 치수, 및 포획 역학의 차이에 우리 모델 필터 (6)에 비해 마이크로 슬라이드 모델에 대해 상이한 전단 응력을 사용 인해.

6. 필터를 통합 병렬 플레이트 흐름 회의소 설정

  1. 금속 템플릿을 사용하여 파라 필름 조각 (유리 커버 슬립 같은 크기)를 잘라. 금속 템플릿을 사용하여 (유동 채널을 만들 수) 파라 필름에 20 × 4mm 슬롯을 잘라. 유리 커버 슬립의 유동 채널을 표시 가스켓을 사용합니다.
  2. 유리 커버 슬립에 6 자 필터의 가장자리를 맞 춥니 다. 필터가 유동 채널의 표시를 다루고 있는지 확인합니다. 조심스럽게 형 10A 메스를 사용하여 필터를 잘라.
  3. 조심스럽게 보장 파라 필름 개스킷 필터를 덮 유동 채널슬롯 필터 (도 1d)의 중앙에있다. 깨끗한 조직의 조각을 사용하고 거품을 밀어 넣습니다.
  4. 방풍 유동 챔버의 바닥 판의 오목 부에 배치 커버 슬립. 가스켓의 맨 위에 상단 방풍 판을 놓고 함께 플레이트 (그림 1D)를 조입니다.
  5. 세척 버퍼 (PBSA)가 밸브를 통해 흐를 수 있도록하는 3 방향 탭을 돌립니다. 상단 Persex 판의 입구 포트에 압력계 튜브를 연결합니다. 기포가 통과 할 수 있도록 채널을 통해 흐름을 실행 PBSA.
  6. 방풍 판의 출구 포트에 주사기 펌프에서 압력계 튜브를 연결합니다. 리필 눌러 실행하려면 주사기 펌프를 설정합니다. 챔버의 상부 판에 떨어 뜨린 어떤 PBSA를 청소합니다.
  7. 반전 위상차 현미경의 무대에 챔버를 놓습니다. 필터 위의 EC (그림 1B)를 시각화하는 데 초점을 조정합니다.

7. 흐름 <대한 Microslides 설정/ P>

  1. 반전 위상차 현미경의 스테이지로하는 마이크로 놓습니다. 채널의 입구 포트에 L 모양의 커넥터를 연결합니다. 유동 채널을 통해 PBSA를 실행합니다.
  2. 채널의 출구 포트에 주사기 펌프에서 커넥터 모양의 L를 놓습니다. 리필 눌러 실행하려면 주사기 펌프를 설정합니다. 마이크로 슬라이드에 떨어 뜨린 어떤 PBSA를 청소합니다. EC 단일 층을 시각화하는 데 초점을 조정합니다.

백혈구 위에 내피 세포의 관류 8.

  1. 샘플 탱크로 정제 호중구 2 ㎖를 넣고 2 분 동안 따뜻하게 둡니다. 2 분 동안 PBSA와 내피 세포를 씻으십시오.
  2. 내피 세포에 걸쳐 호중구를 관류하는 ON 밸브를 돌립니다. 4 분 동안 호중구 러스를 제공합니다. 밸브을 끄고 실험의 나머지 부분에 대한 세척 저수지에서 PBSA를 관류.
  3. 이 EC의 monolay을 방해하므로 거품이 분석 중 어느 시점에 유동 채널을 통과하지 않는 공기를 확인어 및 부착 호중구의 원인 분리.

9. 녹음 호중구 캡처 및 행동

  1. 기록 호중구 모집 중 호중구 흐름 또는 사후 관류 동안.
  2. 유로의 중심에 10 필드 - 적어도 5의 모든 디지털 녹음합니다. 입구 포트에서의 채널의 가장자리로 이동하고 대물 포트의 가운데를 식별함으로써 채널의 중심을 식별.
    1. 호중구 흐름 중에 기록은 1 분 동안 하나의 필드 매 10 초 영상을. 채널을 따라 이동하고 1 분 동안 다른 필드를 기록합니다. 루스의 기간 동안 반복합니다.
    2. (호중구 루스 종료 후 통상 2 분) 백혈구 거동을 평가하기위한 유동 채널의 중심 아래 필드 10 - 포스트 - 관류를 기록하기위한, 10 초 (5)의 기록을 만든다. 이미지를 10 초 간격 내의 모든 초를 가져 가라. 이 흐름에서 캡처 및 부착 neutro의 행동에 대한 충분한 시간을 허용PHILS 분석한다.
    3. 이미지마다 30 초 복용 5 분 동안 적어도 10 transmigrated 호중구를 함유하는 단일 필드를 기록한다. 이것은 (위 또는 아래 어느 내피) 이주 된 세포의 속도를 계산하는데 이용 될 수있다.
    4. 10 초 필드 (일반적으로 9 분 후 관류)의 또 다른 시리즈를 기록합니다. 이 호중구 시간이 내피 세포의 단층을 통해 마이그레이션 할 수 있습니다.
    5. 주사기 펌프를 중지하고 튜브를 제거합니다. 유량 용기를 분해하여 샘플 저수지와 튜브를 씻어. 이후 필터 /하는 마이크로 채널에 대해 반복합니다.

백혈구 모집 및 행동 분석 (10)

  1. 2 분 시점에서 10 초 동안 녹음 각 필드 호중구 수를 계산. 모든 세포를 계산하기 위해 첫 번째, 두 번째 필드에 존재해야한다. 시야의 두 측면 (즉, 상부 / 우측 테두리) 상에있는 필드에 부분적으로 세포에 포함수,만큼 그들은 전체 10 초 동안 필드에 남아있다.
  2. 필드 당 자기편 호중구의 평균 수를 계산합니다. 기록 된 필드의 길이 및 폭을 측정한다. 필드의 영역을 계산합니다. 1mm 2에 얼마나 많은 분야가 계산합니다. 1mm 2 필드의 수 평균에 의한 호중구 수를 곱한다.
  3. 관류 호중구의 양을 곱하여 관류 호중구의 총 수를 계산한다 (예를 들어, 2 × 106 / ㎖의 *를 Q [예를 들면, 평행 평판 유동 챔버 용 0.0999 ㎖ / 분]) 루스의 지속 시간에 의해 (예를 들어, 4 분 ).
  4. 부착 한 세포의 총 수 (접착 세포 / mm 관류 10분의 2 6)를 결정하기 위해 관류 호중구의 총 수에 의해 호중구 카운트 / mm 2 나눈다.
  5. 부착 호중구가 단단히 부착 또는 (보충 비디오 1과 2) transmigrated, 압연 여부를 평가합니다.
    1. 호중구를 압연 단계 밝은 천천히 내피 세포의 단층을 따라 이동합니다 (1-10 μm의 / 초, 보충 비디오 1).
    2. 단단히 부착 세포 중 하나 (즉, 녹화 중 이동하지 않음) 또는 형상 변화를 거치고 EC 표면 (그림 1Ei)를 통해 마이그레이션하는 고정 남아, EC 표면 상 밝고 바인딩됩니다.
    3. transmigrated 호중구는 어둡고 EC 층 (그림 1Eii) 아래 단계입니다.
  6. 고정 및 transmigrated, 롤링되어 부착 세포의 비율을 계산합니다. 이와 달리, 동작은 호중구 (- 10.7 단계 10.6에 기재된 바와 같이) 전체의 밀착성을 계산하는 데 사용되는 동일한 수식을 적용하여 다른 동작을 나타내는 총 세포 수로 표현 될 수있다.
    1. 마크 롤링 호중구의 첨단. 10 초 시퀀스의 끝에서 동일한 셀의 선단을 표시한다. 선 내기를 그립니다이 점과 싸우는 세포를 여행 거리를 측정한다.
    2. 셀이 롤링되는 기록 (즉, 10 초)의 지속 시간에 의해이 값을 나눈다. 시도하고 전체 10 초 간격 필드에있는 호중구를 선택합니다.
  7. 표면 (모양의 변화된 위상 밝은) 또는 내피 세포 (상 어두운) 아래를 통해 마이그레이션 호중구의 속도를 계산하려면 (보충 비디오 2)를 기록, 5 분을 사용합니다.
    1. 시퀀스의 시작 부분에 마이그레이션 세포의 윤곽을 그리고 순서를 통해 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다. 각 셀에 대해 각각 1 분 간격으로 중심의 X 및 Y 위치를 기록합니다. 두번째 이미지의 값과 시퀀스의 첫 번째 이미지로부터 X 및 Y 위치의 값을 뺀다. 이 피타고라스의 이론을 기반으로합니다.
    2. 세 번째 이미지에서 두 번째 이미지에서 값을 뺍니다. 시퀀스의 모든 이미지에 대해이 작업을 수행합니다. 광장 t그는 X와 Y 값과 함께 추가합니다.
    3. 제곱근 결과 값. 각 분 간격에서 계산 된 속도를 평균하여 각 셀에 대한 속도를 계산한다. 트랙 (10)은 호중구 마이그레이션 및 평균 속도를 계산한다.

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결과

처음에, 우리는 마이크로 슬라이드 Ibidi의 모델 (- 9 부 (7))를 사용하여 흐름 호중구 모집 TNFα와 EC를 자극하는 효과를 분석 하였다. TNFα, 어떤 호중구의 내피 부착 단층 작은 경우 (도 2a)의 부재. 이 (25), (26) 바인딩 지원에 필요한 접착 분자 (셀렉틴) 또는 케모카인을 표명하지 아니 EC 휴식 / 치료로 예상했다. 대조적으로, 사이토킨 자극 크게 용량 의존적으로 (도 2a)에서 내피 세포에 백혈구 부착을 증가시켰다. 접착력은 일반적으로 분석에 걸쳐 안정적으로 유지. 미처리 내피 백혈구의 결합 EC 하나가 활성화된다 (즉, 배양 과정에서 오염 LPS) 및 / 또는 호중구 분리 과정이 활성화 된 것을 나타낸다. 실제로, LPS는 ICAM-1, VC, E 셀렉틴의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다AM-1 그들이 호중구를 결합 할 수 있도록 EC의 표면에 25 ~ ...

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토론

여기에서 우리는 염증이 내피 세포에 의해 호중구 순환의 모집을 공부 두 체외 "혈관"모델을 설명합니다. 이러한 모델의 주요 이점은, 생체 내에서 발생할 수있는 바와 같이, 순서대로 백혈구 접착 캐스케이드의 각 단계를 분석하는 능력이다. 우리는 이전에 TNFα 자극 EC 9, 29을 통해 용량 의존적으로 호중구 부착의 증가와 윤회를 발견했다. 우리는 또한 두 모델은 백혈구 보충에 기질 세포의 효과를 연구하기 위해 적응 될 수있는 방법을 설명한다. 여기서, MSC는 Ibidi의 마이크로 슬라이드 또는 다공질 필터의 양측에 EC와 공동 배양 하였다. 이 두 종류의 세포가함으로써 서로의 표현형 및 응답을 수정, 서로 통신 할 수있다. 우리는 MSC의 존재는 TNFα 자극 EC에 호중구 부착을 억제하는 것으로, 여기에 표시하고, 이전의 연구 (23)에있다. 이것은 간질 세포를 EC 응답을 수정하는 것을 나타낸다이후 사이토 카인과 백혈구를 순환의 모...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

탯줄은 버밍엄 여성 건강 관리 NHS 트러스트의 도움으로 수집되었습니다. HMM은 Arthritis Research UK Career Development Fellowship(19899년)과 버밍엄 대학교(University of Birmingham)의 Systems Science for Health(5212년)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 Ia 타입시그마C267410 ml PBS에 희석하여 10 mg/ml의 최종 농도를 얻습니다. -20 °에서 보관하십시오. 1ml 분취액에 함유된 C.
Dulbecco의 PBS시그마D8662칼슘과 염화마그네슘 함유. 멸균 상태로 유지하고 RT에 보관하십시오.
1X 미디엄 M199Gibco31150-022웜 인 37 ° C 사용 전 수조.
겐타마이신 황산염시그마G13974 >C. M199 500ml 병에 추가합니다.
인간 표피 성장 인자SigmaE9644-20 °에 저장; C 10 &마이크로; l 분취량.
송아지 혈청 (FCS)SigmaF9665FCS는 분리된 EC의 성장과 생존력을 보장하기 위해 배치 테스트를 거쳐야 합니다. 56°C에서 불활성화를 가열합니다. -20°C에서 10ml 분취량에 보관합니다.
Amphotericin BGibco15290-026강력하고 일주일 이내에 독성이 있으므로 매주 신선한 완전한 HUVEC 배지를 만들어야 합니다. -20 °에서 보관하십시오. 1ml 분취액에 함유된 C.
HydrocortisoneSigmaH0135스톡은 에탄올입니다. -20 °에서 보관하십시오. C 10 &마이크로; l 분취량.
콜라겐 분해 효소 유형 II시그마C6885PBS의 주식을 100 mg / ml의 최종 농도로 희석합니다. -20 °에서 보관하십시오. C in 100 µ l 분취량.
히알루로니다아제시그마H3631PBS의 재고를 최종 농도 20,000 U/ml로 희석합니다. -20 °에서 보관합니다. C in 100 µ l 분취량.
100 &마이크로; 50ml 원심분리기 튜브용 m 세포 여과기Scientific Lab Supplies (SLS)352360다른 상용 세포 여과기(예: Greiner bio-one)도 사용할 수 있습니다.
DMEM 저포도당BioseraLM-D1102/50037°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.
페니실린/스트렙토마이신 믹스시그마P4333-20 °에 저장; 1ml 분취액에 함유된 C.
25cc 조직 배양 플라스크SLS353109
75cc 조직 배양 플라스크SLS353136
골수 중간엽 줄기 세포 바이알LonzaPT-2501도착 시 액체 질소에 보관하십시오. 세포는 도착 시 통로 2에 있지만 통로 0으로 지정됩니다. 통로 3으로 확장하고 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소에 보관하십시오.
중간엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)LonzaPT-3001Warm in 37 ° C 사용 전 수조. Cell Tracker Green 염색의 경우 FCS가 없는 배지를 사용하십시오.
EDTA (0.02 %) 솔루션시그마E80084 °C에서 저장 37 °C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조.
트립신 솔루션SigmaT4424-20 °에서 저장; 2ml 분취액에 함유된 C. RT에서 해동하고 즉시 사용하십시오.
CryovialsGreiner bio-one2019-02세포 현탁액을 추가하기 전에 추가하기 전에 얼음에 보관하십시오.
Mr. Frosty 냉동 컨테이너Nalgene5100-0001RT에 보관하십시오. 세포가 -80 °에 저장된 cryovials를 추가할 때; 세포를 액체 질소로 옮기기 전에 24시간 동안 C.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C 처리, 멸균IbidiIB-80606대체 모델에는 유리 모세관, Cellix Biochips(www.cellixltd.com), BioFlux 플레이트(www.fluxionbio.com/bioflux/) 및 GlycoTech 병렬 플레이트 플로우 챔버(http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html)가 포함됩니다.
세포 추적기 녹색 염료생명 기술C29255 µ에 저장; l -20 °C에서 분취량. 예열 된 5ml에 희석 (37 ° C) MSCGM.
세포 계수 챔버NexcelomSD-100또는 혈구계를 사용할 수 있습니다.
Cellometer auto T4 cell counterNexcelomAuto T4-203-0238
종양 괴사 인자 α (TNF&알파;)R& D Systems210-TA-100PBS의 재고를 100,000 U/ml의 최종 농도로 희석합니다. -80 °에서 보관합니다. C 10 &마이크로; l 분취량.
6-웰, 0.4 &마이크로; m 애완 동물 Transwell는있는 SLS353090
K2-EDTART에 Sarstedt상점.
Histopaque 1119Sigma111914 °C에 보관하십시오. 사용 전에 RT로 따뜻하게 하십시오.
Histopaque 1077Sigma107714 °C에 보관하십시오. 사용하기 전에 RT로 따뜻하게 하십시오.
10 ml 둥근 바닥 튜브Appleton WoodsSC211 142 AS
7.5 % BSA 분수 V 솔루션Life technologies15260-0374 °C에 저장.
20ml Plastipak 주사기BD 팔콘300613
5ml Plastipak 주사기BD 팔콘302187
2ml Plastipak 주사기BD 팔콘300185
3M 저자극성 수술 테이프 9m x 2.5cmMicropore1530-1방풍실 벽에 주사기 탭을 고정하는 데 사용합니다.
실리콘 고무 튜브, 1/3mm(얇은 튜브)의 내경/외경(ID/OD)Fisher ScientificFB68854실리콘 튜브를 적절한 크기로 자릅니다. 전자 마이크로밸브로 직접 연결되는 모든 튜브는 얇아야 합니다.
실리콘 고무 튜빙 2/4mm의 ID/OD(두꺼운 튜빙)Fisher ScientificFB68855
Portex 블루 라인 압력계 튜빙Smiths200/495/200튜빙 주사기 펌프로 이어집니다.
3방향 마개BOC Ohmeda AB
Glass 펌프용 50ml 주사기Popper Micromate550962사용하기 전에 기포를 제거하여 프라이밍해야 합니다.
유리 커버 슬립Raymond A Lamb26 x 76mm 커버 슬립 주문 제작. 로트 번호 2440980.
파라필름 개스킷American National Can Company알루미늄 템플릿을 사용하여 26 x 76mm 파라필름 조각을 자르고 메스 10a를 사용하여 20 x 4mm 슬롯을 자릅니다. 개스킷 두께는 약 133μm입니다.
2 개의 방풍 평행 판Wolfson Applied Technology Laboratory8 개의 나사로 함께 고정 된 평행 판으로 구성된 특별히 설계된 챔버. 하부 플레이트에는 중간에 돌출된 시야 슬롯과 커버슬립, 필터 및 개스킷을 위한 공간을 허용하기 위해 밀링된 얕은 홈이 있습니다. 상부 방풍판에는 흐름 채널 위에 위치한 입구 및 출구 구멍이 있습니다.
최소 데드 스페이스가 있는 전자 3방향 마이크로밸브Lee Products Ltd.LFYA1226032H12볼트 DC 전원 공급 장치에 전자적으로 연결됩니다.
주입 / 회수 용 주사기 펌프 (PHD2000)Harvard Apparatus70-2001직경을 29mm로 설정하고 보충 (흐름) 속도를 설정합니다.
L자형 커넥터LabhutLE876Ibidi 마이크로슬라이드 채널의 입구 및 출구 포트에 연결합니다.
비디오 카메라Qimaging01-QIC-F-M-12-C디지탈 비디오를 녹화할 수 있는 컴퓨터에 연결합니다.
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592데이터 분석용. 다양한 동작을 표시하는 셀에 수동으로 태그를 지정합니다. 롤링 및 이동 속도 분석을 위해 세포를 추적합니다.
여기에 설명된 시약 사용의 위험에 대한 자세한 내용은 제품 데이터시트를 참조하십시오.
는 10ml 관에 를 거릅니다

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