흐름에서 백혈구를 모집 염증이 혈관 내피 세포의 기능은 중간 엽 기질 세포에 의해 조절된다. 우리는 흐름 호중구 모집을 평가하고 간엽 기질 세포가 이러한 과정을 조절하는 것을 재생 역할을 조사하는데 사용될 수있다 일차 인간 세포를 통합 두 시험 관내 모델을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
기질 세포는 이웃 내피 세포와 크로스 토크 (cross-talk)를 통해 염증 동안 순환 백혈구의 채용을 조절한다. 여기에서 우리는 염증이 혈관 내피 세포에 의해 흐름에서 호중구 순환의 모집을 공부 두 체외 "혈관"모델을 설명합니다. 이러한 모델의 주요 이점은, 생체 내에서 발생할 수있는 바와 같이, 순서대로 백혈구 접착 캐스케이드의 각 단계를 분석하는 능력이다. 우리는 또한 두 모델은 백혈구 모집을 조절하는,이 경우 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 기질 세포의 역할을 연구하기 위해 적용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
기본 내피 세포는 Ibidi의 microslides에 24 시간 동안없이 Transwell 필터의 반대편에 직접 접촉하는 인간의 MSC 혼자 또는 함께 배양 하였다. 배양 4 시간 동안 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)로 자극과 흐름 기반 부착 분석법에 혼입 하였다. 호중구의 루스는 관류되었다4 분의 내피 세포 이상. 호중구와 내피 세포와의 상호 작용을 흐르는 캡처 위상차 현미경으로 시각화했다.
두 모델에서 사이토 카인 자극은 용량 의존적으로 흐르는 호중구의 내피 모집 증가했다. 모집 호중구의 거동 분석 압연 용량 의존적 감소 및 내피 통해 이주에서 용량 의존적으로 증가 하였다. 공동 문화에서, MSC는 TNFα 자극 내피 세포에 호중구 부착을 억제.
우리 플로우 기반 유착 모델에서 순환 백혈구 보충의 초기 위상을 모방. 백혈구뿐만 아니라, 그들은 그러한 치료 학적 투여 MSC 또는 순환하는 종양 세포와 같은 다른 세포 유형의 채용을 검토 할 수있다. 우리의 다층 공동 문화 모델은 MSC는 염증성 사이토 카인에 대한 반응을 수정하는 내피 세포와 통신 것으로 나타났습니다, alteri호중구의 모집 겨. 이러한 모델을 사용하여 더 많은 연구가 완전히 다른 조직 및 조건 (염증성 질환 또는 암)에서 어떻게 기질 세포를 이해 염증시 백혈구의 채용에 영향을 미치는 데 필요합니다.
서론
염증은 해상도 1,2를 허용하는 염증 조직에서 꽉에 백혈구 항목의 규제와 출구를 필요로 미생물 감염이나 조직 손상에 대한 보호 반응이다. 내피 세포 (EC) 그 라인 혈관 순환 백혈구 및 조직 상주 기질 세포 사이의 크로스 토크 (cross-talk)이 과정 3을 조정 필수적이다. 그러나 백혈구의 통제되지 않은 모집 및 효과 간격은 만성 염증성 질환 4의 개발을 뒷받침. 건강과 질병에서 백혈구 모집의 우리의 현재 이해는 불완전하며 더 강력한 모델은이 과정을 분석 할 필요가있다.
후 모세관 세정맥 혈관 EC를 통해 혈액에서 백혈구의 채용을 지원하는 메커니즘은 잘 1,2,5을 설명 하였다. 순환 백혈구 전문 수용체 (예를 들면, VCAM-1, E-셀렉틴, P- 셀렉틴)에 의해 캡쳐 된염증이 내피 세포에까지 조절한다. 이러한 과도 상호 작용은 백혈구 표면에 결합 된 케모카인 및 백혈구 6 (11)에 의해 표현 인테그린을 활성화 지질 파생 매개체 (기원 내피 또는 기질 중 하나)과 상호 작용 할 수 있습니다. 이것은 차례로 내피 세포 및 전 조직 12 (15)에 부착 및 드라이브 마이그레이션을 안정화시킨다. 조직 ....
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프로토콜
1. 분리 및 문화 차 인간의 내피 세포와 중간 엽 줄기 세포의
- 단리 및 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) :
- 종이 타월로 트레이에 탯줄을 넣고 70 % 에탄올 스프레이. 조직 문화 후드에 배치합니다. 양쪽 끝의 정맥 cannulate을 확인합니다. 고정하기 위해 유관 끝 주위에 케이블 타이를 놓습니다.
- PBS는 주사기를 이용하여 정맥 혈액을 세척 할 것. 공기와 주사기를 입력하고 제거하고 잔여 PBS를 폐기하기 위해 정맥을 통해 전달합니다.
- 및 10 ㎎ / ㎖의 콜라게나 Ia 형 녹여 1 mg / ml의 최종 농도로 (칼슘 및 마그네슘 클로라이드)와 PBS에서 1:10 희석. 모두 캐 뉼러가 작성 될 때까지 정맥에 콜라겐 솔루션을 전달합니다. 양쪽 끝에서 캐 뉼러에 클램프를 닫습니다.
- 조직 트레이 커버 및 70 % 에탄올 스프레이. 37 ° C에서 20 분, 5 % CO 2 인큐베이터에 코드를 배치합니다.
- 밖으로 코드를 가지고및 인큐베이터의 케이블 타이를 조입니다. 1 분 동안 부드럽게 코드를 마사지. 10 ml의 PBS로 세포 현탁액을 씻어 내고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 수집한다.
- 공기로 채우고 주사기 단계 1.1.....
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결과
처음에, 우리는 마이크로 슬라이드 Ibidi의 모델 (- 9 부 (7))를 사용하여 흐름 호중구 모집 TNFα와 EC를 자극하는 효과를 분석 하였다. TNFα, 어떤 호중구의 내피 부착 단층 작은 경우 (도 2a)의 부재. 이 (25), (26) 바인딩 지원에 필요한 접착 분자 (셀렉틴) 또는 케모카인을 표명하지 아니 EC 휴식 / 치료로 예상했다. 대조적으로, 사이토킨 자극 크게 용량 의존적으로 (도 2a)에서 내피 세포에 백혈구 부착을 증가시켰다. 접착력은 일반적으로 분석에 걸쳐 안정적으로 유지. 미처리 내피 백혈구의 결합 EC 하나가 활성화된다 (즉, 배양 과정에서 오염 LPS) 및 / 또는 호중구 분리 과정이 활성화 된 것을 나타낸다. 실제로, LPS는 ICAM-1, VC, E 셀렉틴의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다AM-1 그들이 호중구를 결합 할 수 있도록 EC의 표면에 25 ~ .......
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토론
여기에서 우리는 염증이 내피 세포에 의해 호중구 순환의 모집을 공부 두 체외 "혈관"모델을 설명합니다. 이러한 모델의 주요 이점은, 생체 내에서 발생할 수있는 바와 같이, 순서대로 백혈구 접착 캐스케이드의 각 단계를 분석하는 능력이다. 우리는 이전에 TNFα 자극 EC 9, 29을 통해 용량 의존적으로 호중구 부착의 증가와 윤회를 발견했다. 우리는 또한 두 모델은 백혈구 보충에 기질 세포의 효과를 연구하기 위해 적응 될 수있는 방법을 설명한다. 여기서, MSC는 Ibidi의 마이크로 슬라이드 또는 다공질 필터의 양측에 EC와 공동 배양 하였다. 이 두 종류의 세포가함으로써 서로의 표현형 및 응답을 수정, 서로 통신 할 수있다. 우리는 MSC의 존재는 TNFα 자극 EC에 호중구 부착을 억제하는 것으로, 여기에 표시하고, 이전의 연구 (23)에있다. 이것은 간질 세포를 EC 응답을 수정하는 것을 나타낸다이후 사이토 카인과 백혈구를 순환의 모.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
탯줄은 버밍엄 여성 건강 관리 NHS 트러스트의 도움으로 수집되었습니다. HMM은 Arthritis Research UK Career Development Fellowship(19899년)과 버밍엄 대학교(University of Birmingham)의 Systems Science for Health(5212년)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콜라겐 분해 효소 Ia 타입 | 시그마 | C2674 | 10 ml PBS에 희석하여 10 mg/ml의 최종 농도를 얻습니다. -20 °에서 보관하십시오. 1ml 분취액에 함유된 C. |
| Dulbecco의 PBS | 시그마 | D8662 | 칼슘과 염화마그네슘 함유. 멸균 상태로 유지하고 RT에 보관하십시오. |
| 1X 미디엄 M199 | Gibco | 31150-022 | 웜 인 37 ° C 사용 전 수조. |
| 겐타마이신 황산염 | 시그마 | G1397 | 4 >C. M199 500ml 병에 추가합니다. |
| 인간 표피 성장 인자 | Sigma | E9644 | -20 °에 저장; C 10 &마이크로; l 분취량. |
| 송아지 혈청 (FCS) | Sigma | F9665 | FCS는 분리된 EC의 성장과 생존력을 보장하기 위해 배치 테스트를 거쳐야 합니다. 56°C에서 불활성화를 가열합니다. -20°C에서 10ml 분취량에 보관합니다. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | 강력하고 일주일 이내에 독성이 있으므로 매주 신선한 완전한 HUVEC 배지를 만들어야 합니다. -20 °에서 보관하십시오. 1ml 분취액에 함유된 C. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | 스톡은 에탄올입니다. -20 °에서 보관하십시오. C 10 &마이크로; l 분취량. |
| 콜라겐 분해 효소 유형 II | 시그마 | C6885 | PBS의 주식을 100 mg / ml의 최종 농도로 희석합니다. -20 °에서 보관하십시오. C in 100 µ l 분취량. |
| 히알루로니다아제 | 시그마 | H3631 | PBS의 재고를 최종 농도 20,000 U/ml로 희석합니다. -20 °에서 보관합니다. C in 100 µ l 분취량. |
| 100 &마이크로; 50ml 원심분리기 튜브용 m 세포 여과기 | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | 다른 상용 세포 여과기(예: Greiner bio-one)도 사용할 수 있습니다. |
| DMEM 저포도당 | Biosera | LM-D1102/500 | 37°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조. |
| 페니실린/스트렙토마이신 믹스 | 시그마 | P4333 | -20 °에 저장; 1ml 분취액에 함유된 C. |
| 25cc 조직 배양 플라스크 | SLS | 353109 | |
| 75cc 조직 배양 플라스크 | SLS | 353136 | |
| 골수 중간엽 줄기 세포 바이알 | Lonza | PT-2501 | 도착 시 액체 질소에 보관하십시오. 세포는 도착 시 통로 2에 있지만 통로 0으로 지정됩니다. 통로 3으로 확장하고 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소에 보관하십시오. |
| 중간엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 ° C 사용 전 수조. Cell Tracker Green 염색의 경우 FCS가 없는 배지를 사용하십시오. |
| EDTA (0.02 %) 솔루션 | 시그마 | E8008 | 4 °C에서 저장 37 °C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조. |
| 트립신 솔루션 | Sigma | T4424 | -20 °에서 저장; 2ml 분취액에 함유된 C. RT에서 해동하고 즉시 사용하십시오. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | 세포 현탁액을 추가하기 전에 추가하기 전에 얼음에 보관하십시오. |
| Mr. Frosty 냉동 컨테이너 | Nalgene | 5100-0001 | RT에 보관하십시오. 세포가 -80 °에 저장된 cryovials를 추가할 때; 세포를 액체 질소로 옮기기 전에 24시간 동안 C. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C 처리, 멸균 | Ibidi | IB-80606 | 대체 모델에는 유리 모세관, Cellix Biochips(www.cellixltd.com), BioFlux 플레이트(www.fluxionbio.com/bioflux/) 및 GlycoTech 병렬 플레이트 플로우 챔버(http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html)가 포함됩니다. |
| 세포 추적기 녹색 염료 | 생명 기술 | C2925 | 5 µ에 저장; l -20 °C에서 분취량. 예열 된 5ml에 희석 (37 ° C) MSCGM. |
| 세포 계수 챔버 | Nexcelom | SD-100 | 또는 혈구계를 사용할 수 있습니다. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| 종양 괴사 인자 α (TNF&알파;) | R& D Systems | 210-TA-100 | PBS의 재고를 100,000 U/ml의 최종 농도로 희석합니다. -80 °에서 보관합니다. C 10 &마이크로; l 분취량. |
| 6-웰, 0.4 &마이크로; m 애완 동물 Transwell는 | 있는 SLS | 353090 | |
| K2-EDTA | RT에 Sarstedt | 상점. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | 4 °C에 보관하십시오. 사용 전에 RT로 따뜻하게 하십시오. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | 4 °C에 보관하십시오. 사용하기 전에 RT로 따뜻하게 하십시오. |
| 10 ml 둥근 바닥 튜브 | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5 % BSA 분수 V 솔루션 | Life technologies | 15260-037 | 4 °C에 저장. |
| 20ml Plastipak 주사기 | BD 팔콘 | 300613 | |
| 5ml Plastipak 주사기 | BD 팔콘 | 302187 | |
| 2ml Plastipak 주사기 | BD 팔콘 | 300185 | |
| 3M 저자극성 수술 테이프 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | 방풍실 벽에 주사기 탭을 고정하는 데 사용합니다. |
| 실리콘 고무 튜브, 1/3mm(얇은 튜브)의 내경/외경(ID/OD) | Fisher Scientific | FB68854 | 실리콘 튜브를 적절한 크기로 자릅니다. 전자 마이크로밸브로 직접 연결되는 모든 튜브는 얇아야 합니다. |
| 실리콘 고무 튜빙 2/4mm의 ID/OD(두꺼운 튜빙) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex 블루 라인 압력계 튜빙 | Smiths | 200/495/200 | 튜빙 주사기 펌프로 이어집니다. |
| 3방향 마개 | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 펌프용 50ml 주사기 | Popper Micromate | 550962 | 사용하기 전에 기포를 제거하여 프라이밍해야 합니다. |
| 유리 커버 슬립 | Raymond A Lamb | 26 x 76mm 커버 슬립 주문 제작. 로트 번호 2440980. | |
| 파라필름 개스킷 | American National Can Company | 알루미늄 템플릿을 사용하여 26 x 76mm 파라필름 조각을 자르고 메스 10a를 사용하여 20 x 4mm 슬롯을 자릅니다. 개스킷 두께는 약 133μm입니다. | |
| 2 개의 방풍 평행 판 | Wolfson Applied Technology Laboratory | 8 개의 나사로 함께 고정 된 평행 판으로 구성된 특별히 설계된 챔버. 하부 플레이트에는 중간에 돌출된 시야 슬롯과 커버슬립, 필터 및 개스킷을 위한 공간을 허용하기 위해 밀링된 얕은 홈이 있습니다. 상부 방풍판에는 흐름 채널 위에 위치한 입구 및 출구 구멍이 있습니다. | |
| 최소 데드 스페이스가 있는 전자 3방향 마이크로밸브 | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | 12볼트 DC 전원 공급 장치에 전자적으로 연결됩니다. |
| 주입 / 회수 용 주사기 펌프 (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | 직경을 29mm로 설정하고 보충 (흐름) 속도를 설정합니다. |
| L자형 커넥터 | Labhut | LE876 | Ibidi 마이크로슬라이드 채널의 입구 및 출구 포트에 연결합니다. |
| 비디오 카메라 | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | 디지탈 비디오를 녹화할 수 있는 컴퓨터에 연결합니다. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | 데이터 분석용. 다양한 동작을 표시하는 셀에 수동으로 태그를 지정합니다. 롤링 및 이동 속도 분석을 위해 세포를 추적합니다. |
| 여기에 설명된 시약 사용의 위험에 대한 자세한 내용은 제품 데이터시트를 참조하십시오. |
참고문헌
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the ....
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