유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Summary

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

Abstract

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

Introduction

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

또한 미세 입자로 알려진 전기 자동차는 세포 - 세포 통신에 관여 생물학적 과정 ^(1)의 다양한 범위를 조절하는 데 ....

Protocol

참고 : 다음 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든 제도적 국내 및 국제 지침에 따라 수행되고있다. 모든 인간의 주제 샘플은 기관 검토위원회 (IRB)가 승인 한 프로토콜에서와 주제의 동의와 시험 하였다.

1. 방법 A : 개별 탐지 방법

전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 1.1) 처리

1. 다음 2 단계 차등 원심 분리 프로토콜을 사용하여 ACD-솔루션 또는 다른 즉시 적절한 항 응고 및 프로세스 (30 분 이내 최대)의 1.5 ml에 포함 된 2 개의 10 ml의 유리 튜브에 기증자 / 환자의 혈액을 그립니다.
   참고 :이 프로토콜은 그려진 혈액의 결합 ~ 17 ml의에서 약 10 ml의 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)의를 얻을 것입니다. 다소간 PPP가 필요한 경우, 혈액 수집 튜브의 수는 적절히 조절 될 수있다.
2. RT에서 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리버피 코트와 적혈구에서 혈장을 분리합니다. 버피 코트와 붉은 세포를 포함하는 바닥 층을 방해하지 않도록주의, 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 플라즈마 상층 액의 1.2 분취 량을 전송합니다.
3. 혈소판 및 대 세포 단편을 제거하기 위해 RT에서 10 분 동안 13,00....

Results

도 1은 분리 및 비드 기반 방법 또는 개별 검출 방법 중 하나를 사용하여 전기차의 검출을위한 전반적인 프로세싱 방식을 설명. FCM 큰 전기차를 분석 잘 작동하지만 대부분의 세포 계측기 개별적으로 엑소 좀 같이 입자에게 작은을 검출 할 수없는 사용하여 전기 자동차의 개별 감지. 비드 - 기반 접근은 표 1에 요약 된 작은 전기 자동차는, 그러나,이 방법의 사용과 관련된 단점이있다 검출 될 수있다. 일반적으로, (또는 수 크로스 구배 분획 절차의 첨가없이) 초 원심 분리를 사용하여 전기차의 격리는 전기 자동차는 기능 분석에 필요한 경우 추천. 초 원심은 혈청 단백질 및 기능 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 플라즈마에서 다른 수용성 오염 물질을 포함하여 불순물을 제거합니다. 그러나, 초 원심은 시간 소모와 EV의 양과 질 ^(12)을 변경할 수 있습니다.

"> 두 검출법에 대한 예상 결과가 그림 2-3에 묘사.......

Discussion

격리, 치료 및 전기 자동차의 분석을위한 두 개의 서로 다른 프로토콜이 각각 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여, 발표되었다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 선택하는 것은 간단하지 않다 항상 관심 개별 소집단뿐만 아니라 테스트되는 샘플의 이해를 요구한다. 가장 적절한 방법을 선택할 때 또한, 취득 사용 계측기의 감도가 고려되어야한다. 때때로 아니라, 방법의 조합은 혼자 어느 한 방법보다 샘플에 대한 자세한 정보를 제공, 사용하는 최상의 단일 프로토콜이 없습니다. 이상적으로는, 여러 다른 분리 및 검출 기술은 EV 특정 인구가 연구되고 성능에 대하여 고려 사이토 개별 고려한 맞춤형 프로토콜을 개발하기 위해서는 먼저 평가해야한다. 대안 격리 기술은 초 원심 분리, 자당 밀도 분획 화, 면역 자기 B를 포함EAD 분리, 크로마토 그래피, 및 친 화성 정제 ^(12), 다른 검출 방법은 주사 전자 현미경, 투과 전자 현미경, 원자력 현미경, 동적 광산란 및 웨스턴 블로 팅 ^(8)를 포함한.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II 탁상용 유세포 분석기	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC 버전 6.0
FlowJo 소프트웨어	Treestar US		Mac 버전 9.6.1 또는 PC 버전 7.6.5
Sphero Rainbow 형광 입자	BD Biosciences	556298	형광 강도 일관성을 유지하기 위해 모든 채널 전압을 조정하는 데 사용됩니다
울트라 레인보우 형광 입자	Spherotech	URFP-10-5	배치에서 배치로 EV 게이팅 일관성을 보장하기 위해 Megamix-Plus SSC 비드와 함께 사용됩니다
. Megmix-Plus SSC 비드	Biocytex	7803	실행 간 일관성을 유지하기 위해 FSC 및 SSC  전압을 조정하는 데 사용됩니다. 또한 모든 실행에서 동일한 흐름률이 사용되는지 확인하기 위해 흐름률을 모니터링하고 다이얼을 조정하는 데 사용할 수 있습니다
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	보상 제어에 사용되며 음의 AbC 구슬은 비즈 기반 방법에 사용됩니다.
Nonidet P-40 대안 (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	SC-281108	은 음성 대조군으로 사용하기 위해 초기 판독 후 샘플을 용해하기 위해서만 개별 검출 방법에 사용됩니다. 재고는 PBS에서 1:10으로 희석하여 최대 1개월 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
BD TruCOUNT 튜브	BD Biosciences	절대	EV 농도가 필요할 때 사용할
Ultrafree-MC, GV 0.22 µ m 원심 필터 유닛	Millipore		UFC30GVNB 크기에 따라 EV를 염색 세척하고/또는 분획
Vacutainer 유리 전혈관 ACD-A	BD Biosciences
Facs 튜브 12x75 폴리스트렌	BD Biosciences	352058
50 ml 저장통 개별 포장	Phoenix	RR-50-1s
Green-Pak 피펫 팁 - 10 &마이크로; l	Rainin	GP-L10S
Green-Pak 피펫 팁 -200 &마이크로; 엘	Rainin	GP-L250S
Green -Pak 피펫 팁 - 1,000 & 마이크로; 엘	Rainin	GP-L1000S
안정 스택 L300 팁 사전 멸균 Rainin		SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 채널 LTS  조절 가능  스페이서	Rainin	LA8-300XLS
96웰 조직 배양 플레이트	E& K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 배지(Hepes 제외)	UCSF 세포 배양	CCFAE001	비드 기반 검출 방법에 사용되는 배지
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µ m 여과 UCSF	세포 배양 시설	CCFAL003
초원심분리기 튜브, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µ l
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 &마이크로; l
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µ l
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µ l
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µ l
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µ l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µ l
CD62L APC	바이오레전	304810	2 &마이크로; l
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 &마이크로; l
CD235a FITC	바이오레전	349104	2 &마이크로; l
패널 III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µ l
CD62p APC	Biolegend	304910	2 &마이크로; l
CD66b PE	바이오레전	305106	2 &마이크로; l
CD15 FITC	엑알파	X1496M	5 &마이크로; l
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	바이오레전드	400230