방법 논문

신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

DOI:

10.3791/52495

⸱

2015년 2월 21일

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 많은 신경 질환에서 질병 발병에 기여하는 발달 경로를 식별하는 데 사용할 수 있는 강력하고 복제적인 신경 세포 집단을 생성하기 위해 신경 전구 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포와 구별할 수 있는 방법을 설명합니다.

초록

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신경 질환에 대한

사후 검사는 많은 질병이 증상이 나타나기 전에 장기간 질병이 진행되기 때문에 질병 시작의 근본적인 원인을 확인하는 데 이상적이지 않습니다. 환자와 건강한 대조군의 섬유아세포는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)로 효율적으로 재프로그래밍될 수 있고, 이후 이러한 질병 연구를 위해 신경전구세포(NPC)와 뉴런으로 분화될 수 있기 때문에 이제 환자의 증상이 나타나기 전에 발생한 발달 과정을 요약할 수 있습니다. 우리는 hiPSC를 NPC로 효율적으로 분화할 수 있는 방법을 제시하며, NPC는 기능적 뉴런으로 추가로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 강력한 계대, 동결-해동 또는 전이되어 신경구로 성장할 수 있으며, 신속한 유전자 스크리닝을 통해 복제, 이동, 산화 스트레스 및/또는 세포사멸을 포함하여 세포 표현형에 영향을 미치는 분자 요인을 식별할 수 있습니다. 환자 유래 hiPSC NPC는 유전자 발현 조작의 세포 또는 분자 결과의 경험적 테스트에 이상적인 고유한 플랫폼입니다.

서론

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우리 (1)에 의해 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 시험 관내에서 차별화 된 신경 세포 등, 3의 유전자 발현 연구는 hiPSC 신경 세포가 태아보다는 성인 뇌 조직을 닮은 것을 나타냅니다. 현재, hiPSC 기반 모델은 오히려 늦은 기능, 신경 학적 질병보다에 경향의 연구에 더 적합 할 수있다. 우리는 이전의 NPC 분열증 한 기여 분자 경로를 연구하는데 유용한 세포 유형이 될 수 있다는 것을 나타내는, 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 전구 세포 (NPC들)에 보존되었다고보고했다 . 우리와 다른 비정상적인 이주 증가 산화 스트레스 및 반응성 산소 종, 서브 - 임계 환경 스트레스 및 정신 분열증에서 미토콘드리아 기능 부전의 NPC hiPSC 1,4-6 민감도뿐만 아니라 C를 감소 신경 신고되었습니다연 결 성 및 정신 분열증 hiPSC 신경 5,7-10에서 시냅스 기능. 정신 분열증 hiPSC의 NPC에서 벗어난 마이그레이션 및 / 또는 산화 스트레스에 기여하는 분자 요인 또한 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 감소 된 신경 세포의 연결을 기초 경우, NPC의 질병을 담당하는 메커니즘을 ....

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프로토콜

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1. hiPSC 차별화 신경 전구 세포에

  1. 성장과 인간 배아 줄기 세포에서 hiPSCs을 확장 (HES) 미디어 (표 1) 공동 배양 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 큰 (그러나 subconfluent) 식민지가 배아 체 (EB) 중간 통해 신경 차별화를위한 준비가 될 때까지 세포층에 (그림 2). 루틴 hiPSC 배양 조건은 다른 웰 (16, 17) 기재되어 있고; 3 매 7 일마다 : 잠깐, 합류 할 때까지 MEF 피더 레이어에 HES 미디어에서 hiPSCs 성장, 후 효소 콜라게나 제 (DMEM에 1 ㎎ / ㎖)와 통로는 약 1 확장합니다.
  2. 폴리 -L- 오르니 틴 (유리 표면에 50 ㎍ / ㎖) 플라스틱 표면에 대한 멸균 ㎖ / 10g과 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 플레이트, 코팅 플레이트를 준비하고, 3-24 시간 동안 RT에서 배양. 3-24 시간 동안 실온에서 멸균 PBS에 5g / ml의 라​​미닌과 멸균 후 코트에 한 번 이상 세척 할 것.
    참고 : 플라스틱에 싸여 경우, 플레이트가 될 수 있습니다6 개월까지 -20 ºC 저장.
  3. 1 일에, 효소 DMEM / F12에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV를 사용하여 플레이트 ....

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결과

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신경 로제트는 apico - 기초 극성 (그림 1)와 neuroepithelial 세포의 원형 클러스터로서의 특성 외관에 의해, 시야 현미경을 사용하여, 형태 학적으로 식별 할 수 있습니다. NPC가 매우 높은 세포 밀도에서 일반적으로 배양 있지만, 바로 계대에 따라 약간 피라미드 모양의 소마와 바이폴라 신경 돌기 구조는 볼 (그림 1D)입니다. III-tubulin의 얼룩은 NPC들 중 일부 비율이 지속적으로 문화 (그림 1 층)에서 신경 세포의 분화를 시작하는 것을 나타내는 모든 NPC 인구도 볼 수 있지만 검증의 NPC, 세포의 대부분에 네 스틴 및 SOX2을 표현한다. 이러한 LMX1A 및 FOXA2으로 중뇌 마커 (그림 1G-I)하지 않는 상태에서 이러한 SOX2 및 PAX6, 및 TBR2 같은 전뇌 신경 전구 세포 등의 신경 줄기 세포의 마커는, 또한, NPC들로 표현된다. 크고 평평한 섬유 아세.......

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토론

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우리는 NPC들에 hiPSCs는 신경 세포의 종류가있는 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 보존되고 그 잠재적으로 질병의 발병 기전 (8)에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수있다 구별하는 기준에 방법을 설명했다 (11). 우리가 자세히 것처럼 또한, NPC가 우리가 질병 소인의 분자 생화학 적 연구에 적합 할 수있다 생각 견고 복제 성 쉽게 형질 신경 인구입니다.

우리가 분화하는 상세한 방법 및 배양 전뇌 무늬의 NPC를 갖지만, 그들은 쉽게 다른 세포 운명으로 패터닝의 NPC를 생성하도록 구성 될 수있다. 예를 들어, 부동 사채 먼저 NPC 미디어의 확장과 20 ng의 보충 신경 미디어에서 차별화 할 수 있습니다 0.5 ㎎ / ㎖의 DKK1, 10 mM의 SB431542, 0.5 ㎎ / ㎖ 소량과, 해마의 NPC가 생성됩니다 1mM의 cyclopamine로 치료하는 경우 / ㎖ WN.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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Kristen Brennand는 뉴욕 줄기세포 재단(New York Stem Cell Foundation)의 Robertson 연구원입니다. 브레넌트 연구소는 Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health(NIH) 보조금 R01 MH101454 및 New York Stem Cell Foundation의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F12Life Technologies#11330HES 매체용
DMEM/F12Life Technologies#10565신경 매체용
KO-Serum ReplacementLife Technologies#10828로트 테스트 필요
GlutamaxLife Technologies#35050
NEAALife Technologies #11140
N2Life Technologies #17502-048로트 테스트 필요
B27-RALife Technologies #12587-010로트 테스트 필요
FGF2Life Technologies#13256-029Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech#450-02PBS + 0.1% BSA
GDNF에서Peprotech #450-10PBS에서 재현탁 + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMPSigma #D0627PBS에서 재현탁 + 0.1% BSA
L-아스코르브산Sigma#A0278H20에서 재현탁
STEMdiff Neural Rosette SelectionReagent Stemcell Technologies #05832
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104
Collagenase IVLife Technologies#17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poly-L-OrnithineSigmaP3655
Laminin, Natural Mouse 1 mgLife Technologies#23017-015
BD MatrigelBD#354230차가운 DMEM에서 10 mg/ml로 얼음에 재현탁, 두 개의 6-웰 플레이트 등가물당 1 mg을 사용하십시오
. 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트Corning3506
초저 첨부 6-웰 플레이트Corning3471
염소 anti-Sox2 산타 크루즈sc­ 173201:200
마우스 안티 휴먼 NestinMilliporeMAB53261:200
토끼 안티 -&베타에서 사용; III-튜불린코밴스PRB­ 435P1:500
마우스 안티 베타에서 사용; III-튜불린CovanceMMS­ 435P1:500
마우스 anti-MAP2ABSigmaM14061:200
플레이트 원심분리기Beckman Coulter Beckman CoulterAllegra X-14 (SX4750 플레이트 캐리어 포함)
재현탁;

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneuron....

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hiPSC Derived NPCsNeural Progenitor CellsDual SMAD InhibitionNeural RosettesLentiviral TransductionNeurosphere FormationCell Migration AssayOxidative Stress AnalysisApoptosis MeasurementNestin SOX2 Expression

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