방법 논문

조작 및

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⸱

DOI:

10.3791/52496

⸱

2015년 2월 9일

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

이 논문에서

요약

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

초록

양서류 알은 배아 발달을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 초기 배아 발달은 난자 형성 동안 축적된 모계에 저장된 요인에 의해 주도됩니다. 초기 배아 발달에서 이러한 모계 요인의 역할을 연구하기 위해서는 배아 발달 초기부터 그 기능을 조작하는 것이 바람직합니다. 기존의 유전자 간섭 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고) 또는 mRNA를 수정란에 주입하여 특정 단백질의 과소 발현 또는 과발현을 각각 가능하게 합니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 단백질 발현이 영향을 받을 때까지 몇 시간 이상이 걸리므로, 초기 배아 단계에서는 유전자 기능의 간섭이 효과적이지 않습니다. 여기에서는 수정 전에 모계 단백질의 발현 수준을 변경할 수 있는 실험 시스템을 소개합니다. 난소에서 얻은 Xenopus laevis 난모세포는 효소로 배양하여 혈관을 형성합니다. 안티센스 올리고 또는 mRNA는 생식 소포(GV) 단계에서 혈반이 형성된 난모세포에 주입됩니다. 이 난모세포는 중기 II(MII) 단계에서 난자로 체외에서 성숙한 후 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 거칩니다. 이러한 방식으로 ICSI 배아의 최대 10%가 수영하는 올챙이 단계에 도달할 수 있으므로 특정 유전자 녹다운 또는 과발현에 대한 기능 테스트가 가능합니다. 이 접근법은 초기 배아 발달에서 모계에 저장된 요인의 역할을 연구하는 유용한 방법이 될 수 있습니다.

서론

아프리카 발톱 개구리 laevis의 개발 1 연구 널리 사용되는 강력한 모델 생물이다. 제노 푸스 달걀 풍부한 (포유 동물 대응 물에 비해 약 0.1 mm 인에 약 1.2-1.4 mm) 비정상적으로 큰 때문이다. 계란 (4,000-8,000 세포 단계 8-8.5에서 발생, MBT) 중간 포배 전이 될 때까지 배아 발달을 구동하기에 충분하다 모계 합성 및 저장 구성 요소가 포함되어 있습니다. MBT이어서 발전 지시 배아 유전자 산물을 생산 접합체 게놈 활성화를 수반한다.

많은 연구 개발을위한 중요한 산모 요인을 파악하는 것을 목표로. 많은 연구는 단백질의 경우 모계 저하 스테이지 낭배 2-4에서 관찰 될 수있는 수정 된 배아에 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 포함 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (올리고)의 주입에 의존한다. 대안 적으로,이 수정 된 mRNA를 주입하여 EMbryos 유전자 기능을 방해하거나 과발현 단백질의 운명을 추적. 그러나, 하나의 세포 단계 배아 내로 주입 정상적으로 MBT 전에 초기 배아 단계에서 모체 단백질의 발현 수준에 영향을 미치지 않는다.

와일리 Heasman 및 5는이 문제를 극복하기 위해 호스트 전송 방법을 확립. 이들 방법에서, 수동 defolliculated 난자 안티센스 올리고으로 주입되고, 호스트 (6)에 전송 암컷. 초기 배아 발달의 하향 조절 단백질의 역할을 조사 할 수 있도록 단백질을 하향 조절되기 전에 수정된다. 7에서 평가로서이 모체 공핍있어서, 모체 단백질의 몇몇 독특한 역할 발달 식별되었다.

수정 이전의 mRNA의 모성 결핍 또는 과잉 발현이 매뉴얼 defolliculation 및 호스트 전송없이 달성되는이 보고서, 우리는 세부 사항 우리의 최근에 개발 된 방법에서,8. 수동 defolliculation 시간과 호스트의 전송은 종종 많은 따라서 임산부 공핍 방법의 빈번한 사용을 방해하는, 숙련 된 기술과 동물의 수술 별 라이선스를 필요로 요구한다. Defolliculation 및 호스트 전송은 각각 효소 defolliculation 9, 10 및 세포질 내 정자 주입 (ICSI) 11 ~ 13로 치환된다. 계란 ICSI 원래 형질 개구리 (12)를 제조 하였다. 정자와 배아 핵은 체외 성숙 양서류의 난자 11,14,15에 이식했다. 여기, 우리가 있었던 체외 성숙 난자에 정자를 주입하는 단계별 방법을 보여 안티센스 올리고 또는 ​​mRNA의 사전을 주입.

프로토콜

참고 : 개구리 모든 실험이 영국 홈 오피스의 요구 사항에 따라 실시 하였다.

아프리카 발톱 개구리의 1. 준비는 난 모세포를 laevis의

  1. 약 일주일 난자 수집하기 전에, 27 G 바늘 1 ml의 무균 주사기를 사용하여 미리 프라이밍을위한 임신 마레 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 150 U 여성 개구리를 주입. 주사 등의 림프 낭 피하 이루어집니다.
    주 : 오랜 시간 동안 알을 낳기하지 않았다 개구리 전에 계란을 마련 적이 없다 (적어도 절반 이상 년) 이상을 사용하는 것이 최적입니다.
  2. (:에, 오후 7시부터 오전 7시까지 : 오프 오전 7시부터 오후 7시까지) 스토어는 빛 제어 방에서 18 ° C로 설정 물 탱크에 개구리를 감작가 미리.
  3. 난자 수집의 날 (DDH 2 O)을 두 번 증류수로 희석하여 10 배 MBS의 주식에서 1X 수정 바스의 솔루션 (MBS)의 1 L를 준비하고 10 ㎍ / ml의 최종 농도에서 페니실린과 스트렙토 마이신을 추가각 (MBS + PS). 10 배 MBS 재고가 880의 NaCl, 10mM의 KCl, 24 mM의의 NaHCO3, 8.2 mM의 황산으로 구성되어 4 2 O .7H, 3.3 mM의 칼슘 (NO 3) 2 .4H 2 O, 4.1 mM의 염화칼슘 2 · 6H 2 O, (100) mM의 HEPES, pH가 7.5.
  4. Tricaine의 메탄 (400 μL)에 120 mg을 피하 주사 (MS222)에 의해 미리 준비하는 개구리 마취. 물을 작은 탱크에서 주입 된 개구리를 유지합니다.
  5. 10 분 후, 성공적으로 마취 된 개구리이 응답하지 않기 때문에 그것을 통해 돌려 마취 된 개구리를 확인합니다. 마취가 불완전하면, 탱크에 얼음을 추가로 10 분 동안 기다린다.
  6. 닦아 습기에 지느러미 드러 누움에있는 작은 탱크와 장소에서 개구리를 선택합니다.
  7. 집게와 작은 수술 가위를 사용하여 피부를 집어 정중선 복부 측면의 하부에 작은 절개 (2cm)을 만든다. 다른 측면에서 또 다른 절개를합니다.
  8. 피부를 절단 한 후, 근육층 위스콘신 리프트일 집게는 근육 층의 절개를합니다.
  9. 근육 층을 절단 한 후 난소를 관찰하고 집게를 사용하여 절개에서 난소를 잡아 당깁니다.
  10. 전송 MBS 용액 50 ㎖ 튜브에 난소를 추출 하였다.
    참고 : 두 절개에서 가능한 한 많은 난소를 수집하려고합니다.
  11. 이후의 적절한 처리를 위해 동결 다음에 일어난 과다 출혈에 의한 여성의 개구리를 버려라.
  12. 피가 씻겨 될 때까지 MBS + PS로 추출 된 난소를 몇 번 씻어. 그런 다음, PS를 MBS를 포함 + 9cm 페트리 접시에 난소를 전송
    참고 :이 시점에서 해부 현미경 난자의 품질을 확인합니다. 난자는 동물의 절반 (그림 1A)에서 고르지 못한 색소와 난자로 분명히 나쁜 품질이 경우, 추가로 처리하고 대신 새로운 난소를 얻을 수 없습니다. 이상적으로, 난자는 동등하게 착색 된 동물 반구가 대략 같은 크기이어야한다.
  13. 작은 조각으로 난소를 애무 해줘(1-2 cm2로) 및 50 ㎖의 새로운 튜브에 난자 5 mL를 수집한다.
  14. MBS + PS와 찢어진 난소 5 ㎖를 몇 번 헹구고 15 ml의 MBS를 + PS를 추가합니다.
  15. 난소 정지에 defolliculation에 대한 효소의 7 단위를 추가 (자료 목록 참조).
    참고 : DDH 2 O의 10 ㎖ (28 단위 / ml)로 동결 건조 효소를 복원합니다. 가끔 부드러운 소용돌이와 얼음에 30 분 동안 유리 병을 놓습니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 250 μL 및 저장.
  16. 부드러운 (약 0.014 XG에 해당하는 15 REV / 분에서 속도) 진탕 기에서 진탕 1 시간 동안 효소 난소 조각을 품어.
    참고 : 모낭 세포, 2 시간 효소가 일반적으로 필요로 분 배양 15 시간 내지 2의 거의 완전한 제거하십시오. 이상 배양 난자 핵 이식 실험을 위해 필요하다 (16).
  17. 1 시간 배양 후, MBS를 포함하는 6cm 페트리 접시에 작은 처리 된 난자의 수 (10-20 난자)과 전송을 픽업 + PS 엑스 테를 확인해부 현미경 defolliculation의 NT. 난자가 서로 분리 적어도 부분적으로 (그림 1B)를 defolliculated하는 경우, 바로 다음 정거장 반응 (18 단계)를 진행합니다. 난자 여전히 무겁게 모낭 세포에 의해 둘러싸여있는 경우, 최대로 15 분 동안 추가로 배양한다.
  18. 반응을 중지하고 상층 액을 제거하기 위해 MBS + PS의 많음을 추가합니다. 10 번 세탁을 반복합니다.
    참고 :하지만 직접 난자에, 50 ML 튜브의 벽에 부어 MBS + PS를 추가합니다. MBS + PS에서 정지 한 후, 작은 미성숙 난자는 세척 버퍼의 상단에 떠과 같은 작은 떠있는 난자를 폐기하는 경향이있다.
  19. 세척 후, PS를 MBS를 포함 + 9cm 페트리 접시로 전송
    참고 :이 단계 이후, 16 ~ 18 ° C에서 가능한 한 많은 난자를 유지에서. 이 온도 제어 무대에서 난자 함유 요리를 유지하여 수행 할 수 있습니다.
  20. 뒤몽의 분류에 따라 단계 VI 난자를 선택MBS + PS 난자 전송을 포함하는 새로운 9cm 페트리 접시에 후속 용도 및 전송을위한 적절한 크기의 팁 (난자 크기보다 더 큰)로 유리 피펫을 사용하여 수행 할 수있다.
    참고 : 좋은 품질의 난자는 동물 반구와 식물 반구 사이의 명확한 대비가 고르게 착색 된 동물 반구가 있어야하고, 약 동등하게 (그림 1C)를 크기 될 수있다. 무대 VI 난 모세포는 완전히 (난자 직경이 약 1.2-1.4 mm이다) 프로게스테론에 응답 할 수 난자를 성장 나타냅니다.

난 모세포에 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 mRNA의 2. 사출

참고 :이 섹션의 모든 단계 온도 조절 순환 물 또는 얼음으로 채워진 플라스틱 상자에 장착 된 현미경 무대에서 16 ~ 18 ° C에서 수행해야합니다.

  1. 미세 주입이 수행 될 것이다 MBS + PS 가득 새로운 9cm 페트리 접시로 200-300 선택된 난자를 전송합니다.
    참고 : EAC에서H 조건, 200-300 모세포는 보통 사용된다. 전체적으로, 대략 1,000 난자 한 실험에서 사용된다.
  2. 안티센스 올리고 또는 mRNA를 주입 제조, 마이크로 인젝터의 금속 플런저를 토출.
  3. 주사기를 사용하여 미네랄 오일을 함께 유리 모세관을 채우고 마이크로 인젝터의 금속 플런저에 기름 가득 유리 모세관을 삽입합니다.
    주 : 유리 모세관이 마이크로 피펫 풀러에 의해 당겨진다. 이 바늘 팁을 손상시키지 않고 상자에 보관됩니다.
  4. 가능한 한 주입을위한 작은 직경의 팁으로 목표로하여 현미경으로 작은 수술 가위를 사용하여 바늘의 끝을 잘라.
    참고 : 바늘 끝이 마이크로 단조 또는 마이크로 피펫 beveler을 사용하여 날카롭게 할 수 있습니다. 25 °의 각도로 바늘을 경사지게하면 난자 벽의 관통 능력을 향상시킨다.
  5. 해부 현미경의 스테이지에의 작은 파라 필름 조각을 놓고 안티센스 올리고 또는 mRNA의 용액의 3 방울 μL 분주.
  6. TI 이동용액의 작은 방울로의 주사 바늘 (P)과 용액으로 바늘을 채우기 주입한다.
    주 : 주사 바늘의 선단이 너무 작은 경우, 기포가 금속 플런저의 선단에 표시한다. 그런 다음이 발생하지 않을 때까지 주사 바늘에 더 큰 팁을합니다.
  7. 약 0.5 mm 떨어진 끝에서 주사 바늘을 표시합니다. 이 마크는 주입 깊이의 지표로 사용된다.
  8. 부드럽게 주입 중에 바람직하지 난자 이동을 방지하기위한 포셉 주입 지점에 난자의 반대측 채 (새싹 소포 아래) 난자의 중심점을 목표로 적도 경계를 따라 난자 바늘의 선단을 삽입 .
    참고 : 여포 세포 (그림 1B)의 자유 영역을 찾아도 미세 바늘이 자주 모낭 세포의 층을 통과 할 수 없기 때문에 그 지점에서 바늘을 삽입합니다.
  9. 4.6 NG / 4.6 NL 또는 antis의 9.2 NG / 9.2 NL 꺼내기ense 올리고, 또는 풋 스위치를 이용하여 mRNA를 적절한 부피 (13.8 ng의 250 페이지). 안티센스 올리고 제제의 세부 사항은도 7에 기재되어있다.
  10. 0.1 % BSA와 보충 MBS + PS 가득 6cm 페트리 접시에 주입 된 난 모세포로 이동 (난 모세포 배양 매체, 0.45 μm의 기공 필터를 사용하여 솔루션을 소독).
  11. (16)에서 난자를 품어 ° C 또는 1~2일 18 ° C.
    주 : 주사 된 난자이 경우 4.6 NG 안티센스 올리고의 주사가 바람직하다, 주사 후 체외 몇 시간 숙성을 실시 할 수있다. 일반적인 규칙은 이후의 배아 발달, 더 나은 잠복기가 짧은 것입니다.

난 모세포의 체외 성숙 (IVM) 3.

  1. 난자의 성숙 실험 저녁에, C 냉동고 °에서 -80 프로게스테론 원액 (에탄올 30 mm)를 가져 룸 템에서 침전물을 용해가끔 소용돌이와 아네트.
    주 : 프로게스테론 스톡은 일반적으로 1 시간 30 분 동안 실온에서 방치한다.
  2. (3 μM에서 프로게스테론의 최종 농도를 성숙 매체)와 동일하게 용액에 프로게스테론을 배포하는 30 분 동안 진탕 기에서 흔들어 MBS + PS 50ml에 프로게스테론 주식의 5 μl를 추가합니다.
  3. 체외 성숙 치료를위한 아가로 오스 코팅 6cm 요리를 준비합니다.
    1. 마그네슘과 칼슘없이 1X MBS의 50ml로 아가로 오스의 1g을 추가합니다.
    2. 전자 레인지에 가열하여 아가 로스 녹여.
    3. 접시의 저면을 덮도록 6cm 요리로 오스 용액의 소량을 붓는다.
    4. 응고 될 때까지 30 분 이상 기다립니다.
    참고 : 아가로 오스 코팅 요리에 난 모세포의 부착을 방지 할 수 있습니다. 일단 단단히 요리에 부착 된 체외 성숙 난자에, 그것은 난자가 창피에서 분리하는 동안받을 수 자극에 의해 활성화 될 것으로 가능성이 높습니다HES.
  4. 성숙 매체의 5-8 ml의 요리를 아가 로스 코팅 및 각 6cm 요리에 200-300 난자를 전송하는 붓고.
    참고 : 난자 배양 매체의 최소한의 양의 난자를 전송하려고합니다.
  5. 16 ° C에서 16 시간 동안 품어.
    참고 : 예를 들어, 오후 5시 치료를 시작하고 다음 날 오전 9시에 마무리합니다.

4. 세포질 내 정자 직접 주입술 (ICSI)

  1. 냉동 정자 재고 준비
    참고 : 다음 정자 준비가 난자 성숙 실험을 시작하기 전에 완료해야하며, 냉동 정자 주식 ICSI에 대한 -80 ° C로 유지된다.
    1. 지방 당겨을 제외하고, 단계 1.11 1.4에 따라 남성 개구리에서 고환을 수집하고 절개 집게를 사용하여 지방에서 고환을 제거으로부터 고환.
    2. 1X 마크의 수정 링거 (MMR, 100 mM의 NaCl을, 2 mM의 KCl을, 1 mM의 황산, 2 mM의 염화칼슘 2, 5 mM의 HEPES, 산도 7.4)에 고환을 씻으십시오.
    3. 지방 제거집게를 사용하여 남아있는 혈관을 제거한 후 깨끗한 티슈 페이퍼에 씻어 고환 압연에 의해 D 혈관.
    4. 1X MMR 1 ㎖를 포함하는 3.5 cm 페트리 접시에 각각의 고환을 놓습니다.
    5. 미세 가위로 길이 방향으로 잘라, 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 집게로 작은 조각으로 찢어.
    6. 피펫 최대 1 ml의 플라스틱 누구의 끝 절단 팁 및로드 유리 균질에 짓 눌린 고환 액 1ml를 사용하여 아래로.
    7. 2-3 뇌졸중에 의해 그들을 균질화 한 다음 15 ml의 원심 관의 상부에 부착 된 50 μm의 세공 필터 상 용액을 붓는다. 이 솔루션은 필터를 통과하도록 허용합니다.
    8. 1X MMR 1 ㎖의 나머지 컷 고환을 재 부유하여 단계를 반복 4.1.7. 마지막으로, 1X MMR으로 균질 몇 번을 씻고 필터를 통해 전달합니다.
    9. 반복 한 15 ㎖의 원심 분리 관에 다른 고환과 풀 두 고환을위한 4.1.8 4.1.5 단계를 반복합니다.
    10. 4 800 XG에 세포를 스핀6; 20 분 동안 C.
    11. 뜨는을 취소하고 1 배 MMR 2 ㎖로 펠렛 세포를 재현 탁. 이어서, 새로운 튜브로 옮긴다.
      참고 : 눈에 보이는 혈액 세포가 존재하지 있는지 확인합니다.
    12. 14 ml의 매우 명확한 원심 분리 관에 단계 구배를 준비합니다. 바닥층 : 30 % iodixanol 4ml의. 제 2 바닥 층 : 20 % iodixanol 1 ㎖. 셋째 바닥층 : 12 % iodixanol 5 ㎖. 상층 : 1X MMR 2 ㎖로 세포를 정소. (아래 단계를 방해하지 천천히 오버레이) 1 ml의 피펫 팁 매우 부드럽게 그라데이션을 오버레이.
      참고 : 30 % iodixanol 그냥 하나의 계층은 단지 정자를 분리에 대한 작동합니다.
    13. (쉬지 않고 감속) 15 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에 초 원심 분리기를 사용하여 SW40 로터의 회전.
    14. 부드럽게 초 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 구배의 각 층과 하단 펠렛 간의 인터페이스를 확인한다.
    15. 펠렛의 정자 분수를 수집합니다.
    16. 정자 화소를 재현 탁iodixanol을 세척을 위해 1X MMR에서 할 수 있습니다. 20 분 4 ° C에서 800 XG에 스핀.
      참고 : 정자의 많은 여전히​​ 4 ° C에서 3,220 XG에 뜨는 20 분 동안 스핀, 다시 회전 후 정지에 남아 펠렛 정자를 풀 경우.
    17. 뜨는을 취소하고 1 배 핵 준비 버퍼의 1 ml의 정자 펠렛을 재현 탁 (NPB 250 mM의 자당, 0.5 mM의 스퍼 미딘의 trihydrochloride, 0.2 mM의 페르 민에 tetrahydrochloride, 1 mM의 EDTA, 15 mM의 HEPES, 산도 7.7) 13. 그런 다음, 에펜 도르프 튜브로 옮긴다.
    18. 50 ㎎ / ㎖에서 1 배 NPB (DMSO에 재현 탁 토닌 분말 (50) 10 mg을 μL / ㎖ 토닌 솔루션을 추가하고 -80 ° C에서 분주 동결. 전에 사용, 10 mg의 50 ㎎ / ㎖ 나누어지는을 희석 / ㎖와 1 배 NPB. 10 ㎎ / ㎖ 토닌 냉동 및 -20 ° C 및 재 사용) 정자 솔루션 ml의 1에 저장 될 수있는 사용하지 않은.
    19. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
    20. DAPI 염색 (FINA 0.3 ㎍ / ㎖의 DAPI하여 투과성으로 속도를 확인L 농도). 세포의 95 % 미만이 투과 가능하게하는 경우 조금 더 배양한다.
      주 : 너무 많은 정자 세포 (정자 여러 정소로부터 수집 특히) 동시에 배양 때때로 경우가이 경우에 그것은 토닌의 추가의 소량을 첨가 할 필요가있을 수 Permeabilize 하시려면 어렵다; 정자의 20 %가 투과 가능하지 않는 경우, 예를 들어 토닌의 20 μL를 추가로 첨가한다.
    21. 3 % 최종 농도 10 %의 BSA를 첨가하여 투과성으로 중지.
    22. 4 ° C에서 세포를 스핀.
      주 : 5 분 동안 100 XG로 시작하여 가능한 한 작은 원심 분리 속도를보십시오. 충분하지 않으면, 속도 및 / 또는 시간을 증가시킨다.
    23. 단계 맨 위] 4.1.22와 같은 속도로 0.3 % 1X NPB에서 BSA와 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 한편, 정자 저장 버퍼 준비 (SSB 단계; NPB의 2 배 ㎖, 10 % BSA, 글리세롤 멸균 1.2 ㎖, H 2 O의 680 μL를 120 μL).
    24. 정자에 SSB의 500 μl를 추가펠렛. 위아래로 피펫 여러 번 세포를 손상하지 않도록 절단 팁 재현 탁합니다.
    25. 4 ℃에서 하룻밤 평형을 허용합니다.
    26. 위로 컷 팁 여러 번 아래로 세포를 피펫.
    27. 혈구를 사용하여 세포를 계산하는 10 배 1 배 MMR 또는 1X PBS에서 마이크로 리터의 몇 가지를 희석.
    28. 단일 사용 씩에 -80 ° C에서 30,000 정자 / μL (또는 그 이상) 직접 -80 ° C에서 저장에 분주로 동결.
  2. 시험관에 ICSI는 난자를 성숙
    참고 : 난자를 포함한 모든 프로세스가 16 ~ 18 ℃에서 수행해야합니다.
    1. 성숙 난자를 전송하기위한 유리 피펫을 준비합니다.
      참고 : 유리 피펫은 충분히 넓은 압박하지 않고 난자를 수용 할 수 있어야한다.
    2. 여섯 시간 프로게스테론 함유 매체에 난자를 이동 한 후, 전송 세척 MBS + PS 가득 6cm 아가로 오스 코팅 접시에 난자를 성숙.
      참고 : 중요한 것은, matured 난자는 매우 신중하게 처리해야합니다. 난자의 거친 치료는 정자 주입 전에 자발적인 활성화를 유도 할 수있다.
    3. 새싹 소포 고장 (그림 2)를 의미 흰 반점의 모양을 확인하여 성숙 된 난자를 계산합니다. 성숙 율이 80 % 미만이면, 추가의 분석을 위해 배아 생존 수를 충분히 얻기 어렵다.
      참고 : 남은 여포 세포는 난자의 ​​성숙 후 박리 (그림 2).
    4. 주입 매체로 채워진 새로운 아가로 오스 코팅 6cm 접시에 MBS 세척에서 전송 난 모세포 (: 피콜 (6 %)의 30g, 20 배 MMR ㎖의 1,000 배 PS 주식의 500 μL 500 ml의 준비).
    5. ICSI를 시작하기 전에 적어도 30 분을 품어.
    6. 단계 2.2-2.4에 설명 된대로 마이크로 인젝터를 설정합니다.
      주 : 주사 바늘의 팁 크기는 단계 2.6에 기재된 절차에 따라 가능한 한 작게 유지된다. 직경20-40 μm의 바늘이다. 효율적으로 주입 할 수 있도록 단계 2.4에 기재된 바와 같이 바늘 끝을 경사지게.
    7. 정자 나누어 가져 오기 및 정자 희석 버퍼 (SDB 250 mM의 자당, 75​​ mM의 KCl을, 0.5 mM의 스퍼 미딘, 0.2 mM의 페르 민, 200 μM HEPES의 pH 7.5)에 정자 서스펜션을 희석.
      주 : 바늘 크기 등에 따라 희석을 변화시킬 수있다. 초기 시도로 30,000 정자 / μL 주식의 120 배 희석하고 필요한 경우 추가로 조정합니다.
    8. 해부 현미경의 무대에 파라 필름의 작은 조각을 놓습니다. 피펫으로 정자 주사액을 혼합하고 정자 용액 몇 방울을 분사 μL.
    9. 바늘로 희석 정자 서스펜션을 빨아 현미경 슬라이드에 0.3 ㎍ / ㎖의 DAPI를 포함하는 10 연속 하락으로 4.6 NL을 주입하고, 신속하게 형광 현미경에 주입 당 전달되는 정자의 수를 계산합니다.
      참고 : 주입 당 1-2 정자를 목표로하고 있습니다. 필요한 경우, 더 많은 정자 주사액 희석및 원하는 농도를 달성 할 때까지 다시 분사 당 정자의 수를 확인한다.
    10. 테스트 주입 솔루션을 꺼내고 적절한 농도의 새로운 정자 주입 솔루션을 입력합니다.
    11. 100 성숙 난자에 정자 솔루션의 4.6 NL을 주입한다.
      참고 : 지속적으로 솔루션을 주입하는 것이 중요합니다. 우선 4.6 NL (통상 1-2 초)를 토출하는데 필요한 시간을 결정한다. 다음과 같은 과정을 반복; 난자에 주입, 난자에 주입 몇 초 동안 기다린 주사액에서 바늘 및 모의 분사를 제거, 몇 초 동안 기다립니다. 이러한 연속 주사는 바늘 끝의 차단을 방지 할 수 있습니다. 대안 적으로, 펌프를 사용하는 방법은 13 사용될 수있다.
    12. 후 약 100 주사, 나머지 정자 솔루션을 꺼내고 (분배하기 전에 아래 같은 정자 솔루션을 사용하지만, 피펫) 정자 솔루션을 다시 입력합니다.
      주 : 바늘 잘 정자 용액을 빨아 않으면 필요성 팁을 잘라르. 이 상황이 개선되지 않는 경우, 새로운 바늘을 준비한다.
    13. 모든 난자가 주입 될 때까지 주입 과정을 반복한다.
      주 : 난자 품질이 좋은 사출이 완료되면, 주입 된 난 모세포의 수축은 분사 시간 20 분 이내에 보인다.
    14. 16 ° C 또는 (18)에 주입 된 요리를 이동   C 배양기를 °.
    15. 4 ~ 5 시간 주사 후, I​​CSI 배아의 분열 속도를 확인합니다.
      참고 : 그 배아의 벽개 고랑 정상 수정 된 배아의 것과 명확하지 않을 수 있습니다. 일부 배아는 여러 정자 주입에 의해 야기 될 수있는 비정상적인 분열을 보여줍니다.
    16. 배양 매체에 비정상적으로 절단 된 배아를 포함하여 전송 절단 배아 (500 ml의 준비 : 피콜 (4 %), 5 배 MMR ㎖의 1,000 배 PS 주식의 500 μL의 20g).
    17. (16)에 하나의 배아를 품어   하룻밤 ° C, 18 ° C에서 인큐베이터.
    18. 다음날 아침, 전송 엠브리그리고 0.1X의 MMR에 OS는 배아를 생존 계산합니다.
    19. 평균적으로, 정자 주입 된 난자의 약 10 %가 수영 올챙이 단계 (그림 3A)을 개발할 수 있습니다.

결과

체외 성숙 난자에 사용 ICSI 배아의 배아 개발 (그림 3A)를 조사 하였다. MII 단계에 GV 난자의 성숙 속도는 가변적 크게 난자의 품질에 따라 달라집니다. 좋은 실험에서, GV 난자의 거의 100 %가 마침내 MII 단계에서 계란되고, 난자의 성숙의 프로게스테론과 쇼 징후에 응답합니다. 모든 성숙 된 난자는 ICSI를 실시하고 주입 절단 계란의 약 25 % (그림 3A, N = 제어 (13)는 올리고 주입 난 모세포를 스크램블 N = 더 올리고 주입 난 모세포 7) 하였다. 약 60 % 또는 제어 올리고 주입 난 모세포 또는 비 - 주입 난 모세포로부터 생성 된 절단 배아의 80 %는 각각, 포배 / 스테이지 낭배 도달. 포배 / 낭배 배아의 82 %를 n에 좋은 품질의했다 반면 포배 / 낭 배기 배아 중 올리고 주입 시료에서 배아의 약 절반 (이상 분열 및 세포 사멸의 거의 흔적) 좋은 품질했다에 주입 된 샘플 (도 3A). 비 주입 시료에서 60 % 및 절단 배아의 29 %는 (그림 3A)를 한 동안 마지막으로, 41 % 및 올리고 주입 시료에서 절단 배아의 11 %는 각각 근육 반응과 수영 올챙이 단계에 도달했다. 이 ICSI 배아는 정상 및 비정상 배아 (그림 3B)의 혼합물이다. 그들 중 일부는 변형을 거쳐 개구리 8 성숙 개발한다. 이러한 결과는 IVM과 ICSI 다음 GV 난자에 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 주입, 효율적인 초기 배아 발달을 허용하는 것이 좋습니다. 안티센스 올리고 자체의 주입 배아 개발을 감소하지만, 우리는 여전히 성장 발달 검사로 많은 실험을 위해 충분한 배아를 획득 할 수 있으며, RT-PCR, 등등 웨스턴 블롯합니다.

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무화과 우레 1 : 아프리카 발톱 개구리의 전형적인 예는 체외 성숙 실험을위한 좋은 품질 또는 나쁜 품질의 난자를 laevis의. (A) 나쁜 품질 난자의 예. 예를 들어, 곳곳에 색소 침착을 보여주는 난자 후속 실험에 사용되지 않습니다. 각 Xenopus의 난자는 직경 약 1.2-1.4 mm이다 laevis의. (B) 부분 defolliculated 난자. 난자의 우측 절반은 혈관의 존재에 의해 식별 될 수있는 모낭 세포에 의해 덮여있다. 화살표는 모낭 세포의 자유와 주사 바늘이 주입된다되는 영역을 도시한다. (C)의 동일한 크기이며 동물 반구 및 식물성 반구 사이에 명확한 명암 고르게 착색 동물 반구 표시 양질 난자의 예.

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그림 2 :. Xenopus의 전과 후 성숙 난자를 laevis의 난자 성숙 후, 분명 흰색 반점 동물 반구 모낭 세포의 상단에 나타납니다 박리된다. 각 아프리카 발톱 개구리 laevis의 난자는 직경이 약 1mm이다.

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그림 3 : 체외 성숙 난자에에서 생산 ICSI 배아의 개발. 각 단계에 ICSI 배아의 (A) 개발이 요약되어있다. 컨트롤이 IVM과 ICSI 다음 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (제어 올리고 주입) 또는 주입 (비 주입)을하지 않고, 스크램블와 난 모세포가 주입되었다. 각 단계에서 배아의 해당 번호는 바 위에 표시됩니다. ± SEM이 표시됩니다 의미. N = 4-13 독립적 인 실험 / 다른 Females. (B) ICSI 배아 생존의 예. 이러한 tailbud 단계 배아 약 200 난자 출발 물질로서 사용 된 하나의 실험 제작 하였다.

토론

우리는 여기에 세부 산모의 요인을 고갈하거나 수정하기 전에 외생 적 요인을 과발현하는 새로운 방법. 이 시스템은 두 microinjections 필요하지만, 대신에 호스트 전송 방법에 사용 7,17 개구리 수술을 건너 뛴다. 그것은 동물 보호의 관점에서 개구리 수술 단계를 제거하는 최적이다. 또한, 우리는 우리가 실험의 성공에 영향을 미치는 하나의 생물학적 요인을 제거 할 수 있다는 것을 의미, 전송 실험에 대한 호스트 여성 개구리의 품질을 고려 할 필요가 없습니다. 따라서이 시스템에 PMSG 감작 개구리에서 얻은 난자의 질이 성공적으로 실험을위한 핵심 주요 생물학적 요인이다. 난자의 품질은 난소 또는 후 defolliculation의 수집 후 판단 할 수있다. 어떤 이상이 이러한 단계에서 관찰되는 경우, 새로운 개구리에서 다른 난소를 수집하는 최적이다. 당신이 난자의 품질을 확인하는 또 다른 점은 난자의 성숙 후입니다. progesteron의 경우 80 % 미만전자 처리 된 난자가 성숙의 징후를 보여, 당신은 더 분석을위한 배아의 충분한 수를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 효소 defolliculation 대​​신 수동 defolliculation의 사용은 또한 defolliculation 필요한 시간을 삭감하는 본 시스템의 또 다른 장점이다. 그러나, 수동 defolliculation 효소 처리가보다 나은 개발을 줄 수 있다는 것을 여전히 가능하다.

도 3에 도시 된 바와 같이, 시험 관내에서의 거의 10 %가 수영 올챙이 스테이지에 도달 할 수 난자 성숙. 이 자료는 8 및 새로운 주입 실험에서보고 된 13 개의 독립적 인 실험에서 수집됩니다. 호스트 전사 방법은 전사 난자 30-60 %의 neurula 스테이지 (17)에 도달 할 수 있기 때문에 의미있는 데이터를 얻기위한 각 난자 75-150 치료를 필요로한다. 우리의 방법은 일반적으로 절단 배아의 약 40-60%가 도달 할 수 있기 때문에 각 실험군에서 200 ~ 300 난자로 시작근육 응답 무대. 이러한 데이터는 두 가지 방법이 합리적인 개발 속도를 지원하는 것이 좋습니다. 우리는 지금까지이 방법은 변형을 통해 개발을 지원하는 것을 나타내는,이 기술을 사용하여 제어 mRNA의 주입 및 제어 안티센스 올리고 주입 된 난자에서 10 살아있는 개구리를 얻었다.

우리 난자 조작-ICSI 방법 곧 수정 후, 초기 배아 발달 동안 모체 인자의 역할을 테스트 할 수있는 기회를 제공한다. 또한, 수정 전에 염색질 수정 인자의 과발현은 가능한 개발에 필요한 산모의 염색질 상태를 이해하기위한 수정하기 전에 산모의 염색질을 개조 할 수 있습니다. 이 전략은 또한 이들도 수정하기 전에 표현 될 수 있기 때문에 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN) 18, 19 및 CRISPR / CAS9 (20, 21)로 현재 유전자 편집 시스템과 잘 작동 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 새로운 접근 방식은 potenti가알은 미래 많은 응용에 사용될 수있다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

유용한 토론을 해준 Gurdon 연구실 구성원들에게 감사드립니다. K.M.은 Wolfson College의 연구원이며 Herchel Smith 박사후 연구원과 영국 사사카와 재단의 지원을 받고 있습니다. Gurdon 실험실은 Wellcome Trust(RG69899)와 MRC의 보조금으로 J.B.G.에 지원됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu 주입 용액 용 분말 및 용제
에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트 염 (MS222)시그마A5040마취 용
Liberase TM 연구 학년Roche05 401 127 001난모 세포 혈관 형성. -20 에서 저장 °씨.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206마이크로인젝
유리 캐필러리용 알파 연구소7" Drummond #3-000-203-G/XL마이크로인젝
마이크로피펫 풀러 SUTTER 계기모델 D-97마이크로주입용
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500in vitro 성숙 및 ICSI
14 ml 초투명 원심분리기 튜브용 Beckman Coulter United Kingdom Ltd344060정자 정화용
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)SigmaD1556정자 정화용
DigitoninSigmaD141세포 투과화 시약
ShakerHybaid HB-SHK-1난모 세포 defolliculation
해부 현미경 (스테레오 줌 현미경)ZEISSSemi SV6난모 세포 수집 및 미세 주입
50 μ m pore filterCellTrics04-0042-2317정자 정화용
초원심분리기Beckman CoulterOptima L-100XP정자 정제용
50ml 원심분리기 튜브Cellstar Greiner Bio-One227261 또는 210261난자 세포 수집 및 혈관
15ml 원심분리기 튜브FALCON352097정자 정화용
90mm 페트리 요리 Thermo Scientific101VR20/C
Easy-Grip 세포 배양 접시, 60  엑스  15mmFALCON353004
Easy-Grip 세포 배양 접시, 35  엑스  15mm팔콘351008
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참고문헌

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