고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

요약

여기서 우리는 생활에 초음파 미세 기포 조영제, 고립 늦은 임신 단계 쥐의 배아를 주입하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관류의 매개 변수 및 조영 증강 고주파 초음파 영상을 이용한 혈관 내 배아 분자 마커의 연구를 가능하게한다.

초록

초음파 조영제 강화 이미징은 조직 혈관 및 관류에 관한 필수 정량적 정보를 전달할 수 있으며, 표적 응용 분야에서 분자 수준에서 혈관 바이오마커의 검출 및 측정을 용이하게 할 수 있습니다. 마우스 배아 내에서 이 비침습적 기술은 초기 마우스 순환계와 심혈관 질환의 유전자 모델에서 혈관 발달의 기저에 있는 기본 메커니즘을 밝히는 데 사용될 수 있습니다. 마우스 배아는 또한 혈관 생성 표적(혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2) 또는 α_vβ₃ 포함)에 대한 미세 기포의 접착을 연구하고 분자 초음파의 정량적 특성을 평가하기 위한 우수한 모델로 제시됩니다. 따라서 우리는 살아 있는 고립된 배아의 혈관 구조에 초음파 조영제를 도입하는 방법을 개발했습니다. 이를 통해 주입 제어 및 위치 지정, 장애물 및 움직임이 없는 이미징 평면의 재현성, 단순화된 이미지 분석 및 정량화 측면에서 자유로움을 누릴 수 있습니다. 임신 후기(배아일(E)16.6 및 E17.5)의 쥐 배아를 자궁에서 분리하여 난황낭에서 부드럽게 외부화하고 마이크로버블 조영제를 태반 디스크의 융모막 표면에서 접근할 수 있는 정맥에 주입했습니다. 그런 다음 비선형 조영제 초음파 이미징을 사용하여 여러 가지 기본 관류 매개변수(피크 향상, 세척 속도 및 피크까지의 시간)를 수집하고 엔도글린 마우스 모델에서 표적 미세 기포 결합을 정량화했습니다. 우리는 살아있는 배아 내에서 미세 기포의 성공적인 순환과 배아 혈관 구조 및 미세 기포 행동을 특성화하는 데 있어 이 접근 방식의 유용성을 보여줍니다.

서론

조영 증강 초음파 영상 시각화하고 혈관 환경의 특성을 미세 기포 조영제를 사용한다. 이러한 에이전트는 미세 순환, 혈관 및 심장 혈관 기능의 비 침습적 평가를 할 수 있습니다. 또한, 기포 표면의 개질이 가능 혈관 질환의 분자 초음파 영상을 혈관 신생, 염증 및 아테롬성 경화증의 임상 ^1,2- 애플리케이션에서 입증 된 바와 같이, 내피 표적 바이오 마커에 ​​대한 결합 미세 기포가 발생할 수있다. 콘트라스트 향상 초음파 따라서 혈관 질병과 건강 상태에 ^{영향 3-5} 복잡하고 다양한 환경을 식별하기 위해 사용될 수있다.

년의 과거 수 년, 마이크로 버블 영상의 유용성에 대한 관심이 다양한 마우스 배아 모델을 확장했다. 포유류의 개발 모델로, 배아 미세 기포 맥관계 내로 도입 생리 향상개발 순환 시스템 (예를 들어, 혈류, 심장 출력) 및 형질 전환 사례 및 심장 질환 ^6,7의 대상으로 돌연변이 마우스 모델에서의 연구는 심장 혈관 기능을 변경하는 방법 유전 적 요인에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 사실, 양적 및 질적 2D는 배아 뇌 혈관 분석 이미 ^8을 달성했다. 더욱이, 마우스의 배아는 생체 내에서 혈관 마커 타겟팅 결합 미세 ....

프로토콜

참고 : 본 연구에서 수행 된 실험 절차는 동물 관리 Sunnybrook 연구소위원회 (토론토, 온타리오, 캐나다)에 의해 승인되었다. 동물의 인도적인 처리를위한 절차는 항상 준수해야합니다. 이는 연구자는 초음파 촬상 시스템의 기본적인 동작에 숙련되어있는 것으로한다. 이 프로토콜은 두 사람이 가장 잘 작동합니다.

1. 동물 모델

1. 메이트 CD-1 남성과 여성 뮤스의 musculus는 관류 연구 야생형 배아를 얻었다.
2. Bourdeau 등. ^(14)에 의해 설명 된 바와 같이 분자 영상 연구를 들어, 129 / 안녕 기원의 배아 줄기 세포를 사용하는 동종 재조합에 의해 영어 +/- 마우스를 생성합니다.
   1. 교잡 B6- 영어 ^+/- 마우스는 친절 CD-1 배경에 박사 미셸 Letarte에서 인수했다. 사용 공학과 ^+/- CD-1 backcrossed 배아,뿐만 아니라 영어 ^{+ / +} 한배 새끼 공동ntrols. 배아를 개최 생산하는 마우스 메이트.

2. 실험 준비 ....

결과

전 자궁 마우스 배아에 초음파 조영제의 주입은 주입 및 관련 초음파 영상의 과정을 통해 자궁과 생존의 유지 보수에서 생활, 늦은 임신 단계 배아의 성공적인 분리에 따라 달라집니다. 배아가 표면화하고도 1에 도시 된 바와 같이, 위치되면 배아 혈관에 조영제 주입 조심 가능하다. E17.5 마우스 태아의 전형적인 B 모드 초음파 이미지는도 2a에 도시된다. 미세 기포 및 세척 - 대응 인핸스 대정맥에서, 심장, 뇌, 전체 동물 내함으로써이 기술의 가능성을 보여주는 비선형 콘트라스트 이미징 방법을 사용하여 포착 될 수있다. 개별 시점은도 2b에 도시 된 시간 경과에 콘트라스트의 변화를 표시한다.

전체 세척 -에 기록 및 세척 아웃으로 O마이크로 버블 루스 F를 관류 다양한 파라미터를 측정 할 수있다. 오프라인 분석에서 대조 영역 추적 도구는 배아 좌우 뇌 반구의 ^{관심.......}

토론

초음파 조영제가 말기 임신 마우스 배아 및 비선형 대비 이미지로 주입 하였다는 관류 매개 변수를 측정하기 위해 취득 및 바인딩 마이크로 버블을 대상으로 하였다. 배아의 혈관계 내의 미세 기포 성공적인 이미징은 다수의 인자, 제 인 배아 생존에 의존했다. 모든 장치 및 장치가 분사의 시작에서 배아의 자궁 분리에 필요한 시간을 최소화하기 위해 사전에 준비 하였다. 쥐 배아 마취 단일 또는 반복 노출의 효과를 상세하게 연구되지 않았으므로, 어머니 마취 사용 전에 회피 ^16을 희생시켰다. 배아 분리 동안, 난황의 손상을 방지하고, 배아 자주 리프레쉬 배아 매체에서도 항상 냉장 보관 하였다 보장하기 위해 중요하다. 주사 전에 피닝 동안 배아 exteriorizing 때 주요 난황 혈관 likelihoo를 제한 하였다 회피치명적이 될 수 출혈, d의. 우리는 배아를 되살리는 때, 처음 앞뒤로 움직이는 태아에 초음파 젤을 적용하고 집게로 어떤 큰 거품을 제거하기 전에, PBS와 태반 다음 배아를 충당하기 위해 최선의 것.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
항체 (biotinylated, eBioscience) — 항체 선택은 실험에 따라 다릅니다
rat isotype IgG2 control	eBioscience	13-4321-85	이 항체/마이크로버블 조합은 종종 실험 대조군으로 필요합니다
biotin anti-mouse CD309	eBioscience	13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 항체 마우스 엔도글린에 대한 항체	집 내 하이브리도마		외부 항체도 적절할 수 있습니다: 우리는 과거에 eBioscience (13-1051-85)를 사용했습니다.
증류수
Embryo media
500ml Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 포도당이 높은 매체	Sigma	D5796
50 ml 소 태아 세럼	ATCC	30-2020	lot #
7592456 Hepes	Gibco	15630	5 ml, 1 M
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μ g 스트렙
에탄올, 70%
Ice
파라포름알데히드	시그마	76240	4%
인산염 완충 식염수 [1x]	Sigma	D8537	1x, 염화칼슘 및 염화마그네슘
없음 임산부 마우스, CD-1	Charles River Laboratories Inc.
0.9% 염화나트륨(식염수)	Hospira	0409-7984-11
초음파 조영제, 표적 준비 및 비표적	MicroMarker; 비주얼소닉스 Inc.
초음파 젤 (Aquasonic 100, 무색)	CSP Medical	133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100  엑스  20  mm	Fisher Scientific	08-772-22
세포 배양 플레이트 (12) : 60  엑스  15  mm	Sigma	D8054
원심분리기	Sorvall Legend RT 원심분리기
원뿔형 튜브, 50ml BD Falcon	VWR	21008-938
희석제	Beckman Coulter	Isoton II 희석제, 8448011
해부 가위 (Wagner)	Fine Science	Tools Wagner 14068-12
집게 (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm)	Fine Science Tools	11200-33
집게, 파편	VWR	25601-134
유리 비커, 2 L (Griffin 비커)	VWR	89000-216
유리 모세관, 1 x 90  필라멘트가 있는 mm GD-1	Narishige	GD-1
유리 바늘 풀러	Narishige	PN-30
장갑	Ansell	4002
총 해부학 프로브	Fine Science Tools	10088-15
핫 플레이트	VWR	89090-994
얼음 양동이	Cole Parmer	RK 06274-01
이미징 플랫폼	: VisualSonics Inc.	통합 철도 시스템
광원, 광섬유	Fisher Scientific	12-562-36	이상적으로는 조정 가능한 암
Luers (12), 폴리 프로필렌 가시 암컷 ¼ -28 UNF 스레드	Cole Parmer	45500-30
마이크로 초음파 시스템, 고주파	VisualSonics Inc.	Vevo2100
바늘, 21 게이지  (1인치)	VWR	305165
입자 크기 분석기	Beckman Coulter	Multisizer 3 Coulter 카운터
천공 스푼 (Moria)	Fine Science Tools	MC 17 10373-17
핀 (6), 검은색 양극 산화 minutien 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Pipettors [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1,000 μ l]	Eppendorf	Research Plus  조절 가능한 3120000038;             3120000054;
피펫터 팁 [2-200  μ 엘, 50-1,000  μ l]	Eppendorf	epT.I.P.S.                                    22491334;
가위
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Corning
Tubing, Tygon 실험실 1/32 "x 3/32"	VWR	63010-007
나무 애플리케이터 스틱 (면봉, 면 머리)	VWR	CA89031-270
수술용 현미경 5-8X 배율	Fisher Scientific	Steromaster
주사기, 1 ml Normject	Fisher	14-817-25
주사기 (10개), 30 ml	VWR	CA64000-041
주사기 주입 펌프	바이오 링크스	NE-1000
온도계, -20-110  ° C	VWR	89095-598
타이머	VWR	33501-418
튜브, Eppendorf	VWR	20170-577
튜브 랙 (3)	VWR	82024-462
초음파 변환기, 20 MHz	VisualSonics Inc.	MS250
Vannas-Tubingen, 앵글업	파인 사이언스 도구	15005-08

3120000062022491351