Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
Nåværende ettlagskulturer eller suspensjon cellekultur analyser for legemiddelutvikling er ikke å etterligne den menneskelige mobilmikromiljøet, og derfor føre til en rask dedifferentiation og tap av funksjon i primære humane cellekulturer. Vevsmodeller med høyere fysiologiske relevans for å forutsi effekt og sikkerhet av forbindelser før innrømme dem til kliniske studier. Nylig, standard in vitro cellekultur teknikker har utviklet seg fra to-dimensjonale monolagkulturer mot tredimensjonale flercellede modeller, med formål å etterligne in vivo vev mikromiljøet. Disse systemene har allerede vist store forbedringer mot mer nøyaktig forutsigelse av virkemåten av forbindelsene 1,2. Videre tilpasse in vitro kultur forhold til de svært spesielle behov av cellene er av spesiell interesse.
Under standard in vitro forhold, en rekke viktige Culratur parametere, slik som næringsstoff og oksygentilførsel, fjerning av akkumulerende produkter, og mekaniske kraft som virker på cellene ofte ikke kan kontrolleres nøye i de fleste tilfeller. Mange organer besitter fysiologisk relevante konsentrasjonsgradienter av stoffer og oppløst oksygen. Men de strengt regulerte og optimaliserte forhold er i klar opposisjon til de ukontrollerbare diffusjon gradienter rundt vev under in vitro forhold, som fører til en svært ustabil miljø og begrense cellulær utvikling 3. Således, jevnere og mer spesielt kvantifiserbar in vitro-betingelser er nødvendig for å holde levedyktige celler og differensiert over lengre tidsperioder. Perfuserte systemer, hvor mellom komponenter blir regelmessig fjernet og erstattet, er ofte bedre karakterisert og kontrollerbar enn statiske kulturer knyttet direkte rundt av vev. Under statiske forhold, diffusjon gradienter av celle sekreter og kultur mellom næringsstofferkan omgi dyrkede celler tre. Innføring velkarakteriserte mellomstrømningshastigheter i området rundt vevet tillate celle sekret å blandes med rikt medium gjennom perfusjon. Dette muliggjør generering av definerte cellulære microenvironments, noe som sikrer en stabil celle fenotype og metabolizing enzymet uttrykk gjennom hele analysen varighet 4.
Den siste utviklingen i multi-organ chip (MOC) -baserte systemer kombinerer fordelene ved en kontrollert medium strømmen rundt utviklet vev med de små mellomstore og celle masse kravene til mikroskala bioreaktorer, som fører til en redusert mengde av stoffet som trengs under testing. Flere microfluidic systemer for vevskultur, er blitt beskrevet hittil 5,6. Tissue-til-væske forholdstall mellom disse systemene spiller en spesielt viktig rolle i å simulere fysiologisk relevante mobilcrosstalk. Men på grunn av tekniske begrensninger, for eksempel bruk av eksterne pumper og medie reservoarer, the samlede sirkulerende medievolumet i de fleste systemer er for stor i forhold til vevet volumer. Gruppen av Shuler et al. Var de første til å utvikle et system som sikrer forsvarlig oppholdstider av stoffer innenfor cellekultur avdelinger og in vivo relevant vev-til-væske forholdstall 7,8. Dette ble oppnådd ved å skalere det ytre reservoaret ned til en 96-brønns plate, som også representerer den "andre vev" rommet. For å minimalisere den sirkulerende medievolumet innenfor MOC plattform, integrert vi en peristaltisk on-chip mikropumpe, noe som eliminerer behovet for eksterne media kretser. Denne mikropumpe er i stand til å betjene systemet på en valgbar antall mediestrømhastigheter og skjærspenning priser ni. En mikrofluidkanalsystem på 500 um bredde og høyde 100 jim forbinder to standardiserte vevskultur områder, som hver har en størrelse på en enkelt brønn av en 96-brønns plate. Hvis man følger de størrelser av bransjestandarden godt plates tillater integrering av allerede eksisterende vevsmodeller produsert i transwell-format. Videre er den vertikale posisjonen av Transwell cellekulturinnsatser justerbar, slik at dyrking av vev modeller som ikke bare er direkte utsatt for fluidstrømmen, men kan også løftes opp og skjermet fra den underliggende strøm. Tilsvarende luft-væske-grenseflaten kulturer er mulig ved hjelp av dette systemet.
MOC plattformen er fremstilt av en polydimetylsiloksan (PDMS) lag 2 mm høye og et mikroskop-objektglass med en grunnflate på 75 x 25 mm 2, som er permanent bundet ved lavtrykksplasmapålegging oksydasjon for å danne fluidtett mikrofluidkrets. PDMS lag som inneholder de respektive kanaler og cellekultur avdelinger er produsert av standard myk litografi og kopi støping 9. Microfluidic utformingen av MOC brukt under denne studien besto av to separate microfluidic kretser per brikke, hver med to celle cruk avdelinger sammenkoblet med et kanalsystem 100 mikrometer høy. Dette tillot avspilling av to individuelle to dels cocultures ved hjelp av en multi-organ chip. Pumping frekvensene ble justert for å gi mellomstrømningshastigheter på 40 mL / min.
Denne to-vev MOC design gir muligheten til å coculture en lever spheroid og en hud punsj biopsi i egne kultur mellomrom, om enn i en kombinert media krets under fysiologiske strømningsforhold. Differensiert HepaRG celler ble samlet sammen med humane hepatiske stel celler (HHSteC) ved et forhold på 24: 1 for å danne homogene kuler. Dette forholdet ble funnet å være optimal, som observert i tidligere eksperimenter 10, selv om, nesten det dobbelte av antallet av hepatocytter ble anvendt i forhold til in vivo-situasjonen. Huden ble dyrket på en luft-væske-grensesnittet inne i en transwell cellekulturinnsats, og dermed gjør aktuell substans eksponering. Disse vevsmodeller ble cocultivated for 28 days i MOC å demonstrere helheten av dette systemet. Videre er mikrofluidkanal krets av flisen ble fullstendig dekket med human dermal mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) å nærmere simulere det vaskulære system.
MOC plattform beskrevet her representerer en stabil og kraftig verktøy for å dyrke vev av forskjellig opprinnelse på dynamiske mellomstrømningsforhold over lengre kultur perioder 10,16. I dette eksempel ble det brukt til å dyrke primære celler (HDMEC), vevsekvivalenter generert fra en cellelinje (lever aggregater), og en coculture av den ovenfor nevnte med en vevsbiopsi. MOC var i stand til å opprettholde tre-vev coculture i inntil 28 dager i en kombinert medium krets. Til det beste av forfatternes kunnskap, er dette første gang en multi-vev coculture inkludert biopsier, primære celler og cellelinjer har blitt utført over fire uker.
En av de store ulempene ved microfluidic systemer er affiniteten av små molekyler til å følge overflatematerialet av fluidkretsen. Ettersom overflaten til volumforholdet er spesielt høy i microfluidic systemer, blir denne effekten enda mer uttalt 17 </sopp>. Den stabile HDMEC dekning av kanalene, innføres her, kan fungere som en biologisk barriere forhindrer adhesjon av molekyler med MOC. Videre kan det tjene som en hemocompatible fartøy for hele blodsirkulasjon, hindre blodkoagulering. Imidlertid er bruken av helblod som medium substitusjon ikke gjennomførbart som en full vaskularisering av organ ekvivalenter ennå ikke er blitt oppnådd. Eksisterende arbeid på vaskularisering av in vitro dannede vev er lovende og guider til rette for videre studier 18,19.
Det er velkjent at hepatocytter har en tendens til å miste sine leverspesifikke funksjoner over tid i henhold til statiske to-dimensjonale in vitro dyrkningsbetingelser 20. Enzymer, så som cytokrom P450-familien, er av spesiell betydning hvis metabolismen av et bestemt medikament som skal studeres. Cytokrom P450 3A4, et enzym som er relatert til biotransformasjon av mange xenobiotika og cytokrom P450 7A, wjør er involvert i gallesyresyntese, ble uttrykt i lever aggregater dyrket i MOC over 14 dager. Dette indikerer bevaring av et metabolsk aktiv fenotype, noe som åpner for narkotika metabolismestudier. Den økte albumin produksjonsrate på aggregater i MOC i forhold til statiske kulturer er en ekstra indikasjon for tilstrekkelige dyrkningsforhold. Albumin produksjonsrater observert i løpet av denne studien var sammenlignbare eller enda høyere enn tidligere rapporterte verdier oppnådd ved microfluidic chips inkludert HepG2 celler 21-23, men verdiene ikke nådde de av primære humane hepatocytter kulturer 24. Videre er MOC-system, i den midlertidige layout, ikke tillater en separat atskillelse av galle. Celler i det samlede polariserte og dannet galle canaliculi-lignende strukturer, som vist av MRP-2-farging. Imidlertid ble de canaliculi ikke koblet til et teknisk kanal samle galle. Dette ufysiologisk mixing av galle med blodet rommet må tas opp i en fremtidig redesign av systemet.
Justeringen av strømningsegenskapene er av stor viktighet 25, særlig med hensyn til vev som er følsomme for skjærspenning, slik som leveren. Mengden av skjærspenning oppfattes av vevet kan modifiseres på to måter: For det første, kan lufttrykket som benyttes til å presse ned membraner av pumpen senkes, reduseres peak skjærspenningsverdier i systemet. For det andre kan vevene være innleiret i en ekstracellulær matriks lagdeling eller dyrket i transwelldyrkningsinnsatser. Sistnevnte skjerme vev fra den underliggende strøm med en porøs membran. Disse justeringene må utføres på individuell basis for hvert organ tilsvarende før du starter MOC eksperiment. Ved en pulserende drift av 2,4 Hz, for eksempel, som svarer til et høyt, men likevel fysiologiske, hjertevirksomhet på 144 slag / min hos mennesker, skjærspenningen målt ikanaler av mikrovaskulær kretsen når omtrent 25 dyn / cm2. Dette tilsvarer en fysiologisk skjærspenning ved den høyere enden av skalaen i mikrovaskulaturen, og er derfor godt anvendelig for eksperimenter, inkludert en endotelialisering av kanalene. Men som den nåværende microfluidic utformingen av MOC system presenteres består av bare én medie krets som forbinder de to organ avdelinger, en pumpehastighet og skjærspenning rate har å bli valgt for hele systemet. Derfor, er en nøyaktig justering av strømningskarakteristikker til behovene i hvert enkelt organ ikke alltid gjennomførbart.
Videre omsorg har å bli tatt i å justere cellene til felles medium. Celler blir dyrket i MOC i en kombinert mediekrets derfor ingen individuell cellekulturmedier kan anvendes for hvert vev modell, som er standard for in vitro cellekultur. En minimal kombinerte medier formuleringen må være definert på forhånd og than celler må justeres trinnvis til denne nye medier. En justering Måten fra 80% / 20% gamle til nye medier i to dager, deretter 50% / 50% fulgt av 20% / 80%, og en fullstendig utveksling alltid ført til en rimelig cellenes levedyktighet og funksjon av kulturer i våre hender.
Den nåværende microfluidic utformingen av MOC systemet tillater coculture på opp til tre vev. En coculture av minst ti viktigste organene i menneskekroppen er nødvendig for å nå homeostase. Derfor er systemet presenteres i stand til å forutsi spesifikke vev-vev interaksjoner, men ikke den sanne systemisk respons til et stoff. En videreutvikling av MOC å inkludere flere organ hulrom er tenkt. Videre er gyldigheten av systemet som skal vises ved hjelp av et sett av referanseforbindelser. Fortrinnsvis forbindelser som har mislyktes i kliniske studier (for eksempel Troglitazone) skal testes for deres prestasjoner i MOC. Mens, er en sann validering av slike komplekse systemer fortsatt hindret by mangelen på standardisering vedrørende biomarkører og endepunkter for en undersøkelse, samle flere data på den toksikologiske utførelsen av dette og lignende systemer vil utvide deres pålitelighet og anvendelsesområde.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet har vært finansiert av det tyske føderale departementet for utdanning og forskning, GO-Bio Grant nr 0315569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |