여기에서는 syngeneic CD4+CD45RBhigh T cell을 T 및 B cell 결핍 수용자로 이식하여 마우스에서 결장 염증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 임상적 및 조직병리학적 특징은 인간의 염증성 장 질환을 모방합니다. 이 방법을 사용하면 결장 염증의 시작과 질병의 진행에 대한 연구를 할
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이 논문에서
요약
초록
인간의 염증성 장 질환 (IBD), 자신의 장점과 단점 각각의 발병 기전을 연구에 사용할 수 많은 다른 동물 모델이 있습니다. 우리는 여기에서 T 및 B 세포 결핍 마우스에게 수신자 동계 비장 CD4 + T CD45RB 높은 세포의 대체 전송에 의해 개시되는 실험적 대장염 모델을 설명한다. 나이브 크게 이펙터 세포로 구성되어 CD4 + T CD45RB 높은 세포군 밀접 인간 IBD의 주요 측면을 닮은, 만성 장염을 유도 할 수있다. 이 방법은 질병의 발병과 진행의 측면을 연구하기 위해 조작 할 수 있습니다. 또한 그것은 장내 염증 즉, 타고난, 적응의 기능 및 규제 면역 세포 인구, 환경 노출의 역할, 미생물을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 단계별 프로토콜 대장염을 유도하는 방법을 설명한다. 이 INCludes 성공적 연구 목적 대장염이 실험 쥐 모델을 개발하기 위해 필요한 키의 기술적 측면에 비디오 데모.
서론
염증성 장 질환(IBD) 크론병과 궤양성 대장염은 숙주 면역 반응, 유전적 감수성, 환경적 요인 및 장 내강 내용물 사이의 불완전하고 복잡한 상호 작용으로 인해 발생합니다1. 최근의 게놈 전반의 연관성 연구는 면역 세포 조절 유전자와 IBD 감수성 사이의 연관성을 보고하고 있습니다2,3. 이러한 연구에서는 선천성 면역 세포 고유 유전자와 적응 면역 세포 고유 유전자가 모두 나타나며, 이는 IBD 발병기전에서 이러한 세포 집단의 중심적인 역할을 나타냅니다.
현재 50개 이상의 인간 IBD 동물 모델이 존재합니다. 인간 IBD를 완벽하게 표현하는 모델은 없지만, 질병의 발병 및 진행, 상처 치유 반응을 포함한 인간 질병의 다양한 측면을 연구하는 데 유용한 모델이 많습니다. 여기에 설명된 방법에서, 장 염증은 T 및 B 세포 결핍 수용 마우스4로 syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cell adoptive transfer로 시작됩니다. CD4+CD45RB높은 T 세포 집단은 주로 만성 소장 및 결장 염증을 유발할 수 있는 활성화 준비가 된 미숙한 T 세포를 포함합니다. 이 방법을 통해 ....
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프로토콜
참고 : 모든 동물의 프로토콜에 의해 실험 동물의 관리 및 사용을위한 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 규정 및 국가 연구위원회의 가이드를 준수 승인되어 있는지 확인합니다. 기증자 마우스는 남성 또는 여성이 될 수 있지만,받는 사람 마우스는 남성이어야한다. 여성 수신자가 사용되는 경우, 도너 5 암컷 쥐이어야한다. 따라서, 마우스 5,6의 대장염 표현형을 이러한 장내 미생물에 영향을 미칠 수 있으므로, 정기적으로, 비 살균 침구 및 비 산성화 된 물을 사용하여 식민지를 유지합니다.
1. 실험 준비
- 얼음처럼 차가운 미디어와 버퍼를 사용합니다. 실험을하는 동안 얼음에 세포를 보관하십시오.
- 멸균 기술을 사용하여 멸균 생물 학적 후드에서 실험을 수행합니다.
비장 T 세포의 격리 2.
- 기증자 마우스 / CO에 마우스 자궁 dislocatio에 의해 2 챔버 따라 안락사N. 70 % 에탄올로 복부 스프레이.
- 복부에 수평 절개를하고 복막을 노출 피부를 벗겨. 멀리 집게와 내부 장기에서 복막 잡고 노출과 비장을 절제하....
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결과
약 성체 C57BL / 6 마우스 공여체 비장에서 10 내지 10 × 106 CD4 + CD45RB 높은 T 세포를 확실하게 분리된다. 이 숫자는 나이와 변형 기증자 마우스 및 연구자의 능력에 따라 달라집니다. 때 4 × 6 CD4 + CD45RB 높은 T 세포는 C57BL / 6 Rag1로 전송됩니다 / 10 5 C57BL - / -받는 사람 마우스, 질병의 임상 증상은 주 5 사후 충만 주위에 등장 또는 마우스 (더 심각한 질병에 유 전적으로 취약 빨리 경우 도 2, 3) (11, 12). - / - CD3 + T 세포는 Rag1의 콜론에 축적 볼 수 있습니다받는 사람을 일찍 삼주 (그림 3A) 12.
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토론
여기에서 우리는 면역 결핍 쥐에 CD4 + CD45RB + T 세포의 입양 전송에 의해 쥐에서 대장 염증을 유발하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 받는 사람 마우스 다른 균주 있지만 (예를 들어, BALB / C, 129S6 / SvEv, 비만이 아닌 당뇨병 (NOD)) 면역 결핍과 유전 적 모델 (예를 들어, SCID, Rag2 - / - 우리는 C57BL / 6 기증자 비장과 동계 Rag1을 사용 - / -)도 4,14-16 사용될 수있다. 그것은 잘 배경 변형 쥐 1의 실험 성 대장염의 중증도에 영향을 미치는 것으로 설정됩니다. 또한, 쥐 인구의 장내 미생물은 심지어 같은 기관 6,17 내에서 그 사이에, 시설 사이에 널리 다릅니다. 그림 2와 3은 Rag1에 대장염의 개발을 표시하지 않지만
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 미국 소화기 학회 (AGA) 연구 학자 상과 크론과 미국 (CCFA) (ECS에) (SZS에) 경력 개발 상, NIH NIDDK의 F30의 DK089692의 대장염 재단과 위장 생물 노스 캐롤라이나 센터의 대학에 의해 지원되었다 과 질병 부여 P30의 DK34987 (조직학 코어). UNC 유동 세포 계측법 핵심 시설은 UNC Lineberger 종합 암 센터 NCI 센터 코어 지원 그랜트 (P30CA016086)에 의해 부분적으로 지원됩니다. 우리는 조직 병리학 적 분석과 면역 조직 화학 그의 도움을 동물 용 의약품의 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 누가 B. BORST 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약/장비 회사 | 이름 카탈로그 번호 | 설명/설명 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200075 | |
| 12mm x 75mm 둥근 바닥 튜브 | Falcon | 352052 | |
| 15ml 원뿔형 | Corning | 430790 | |
| 26G x 3/8 Needle | BD Biosciences | 305110 | |
| 50ml 원뿔 | 코닝 | ||
| 70 μ m Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1% 펜/스트렙, 10% FBS, 0.0004% &베타;-ME | ||
| FACS 튜브 + 스트레이너 | BD Falcon | 352235 | |
| 유리 현미경 슬라이드 | Fisherbrand | 12550A3 | |
| 열 비활성화 FBS | Gemini | 100-106 | |
| 라벨링 버퍼 | 1x PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA | ||
| 용해 버퍼 | 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | Beckman Coulter | ||
| 마우스 CD4 T 림프구 농축 세트 - DM | BD Biosciences | 558131 | |
| 마우스 IgG2a-PE | BD 파미노겐 | 553457 | |
| 마우스 IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액, 100X | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| [header] | |||
| Petri Dish | Fisherbrand | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| 워시 미디어 | RPMI-1640, 1% 펜/스트렙, 0.0004% β-ME |
참고문헌
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011). <....
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재인쇄 및 허가
