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방법 논문

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52538

⸱

2015년 2월 18일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

숙주 면역 저항을 연구하기 위해 칸디다 감염 모델을 사용할 수 있지만, 칸디다 감염과 관련하여 T 세포 매개 면역병리학을 연구하기 위한 모델은 없습니다. 여기에서는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 설명합니다.

초록

구인두 칸디다증(OPC) 질환은 숙주 면역 저항이 부족할 뿐만 아니라 감염 유발 면역 병리학의 적절한 조절이 없기 때문에 발생합니다. Th17 세포는 항진균 방어와 관련이 있지만 면역 병리학에서 그 역할은 불분명합니다. 본 연구는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디달 감염과 관련된 구강 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 제시한다. 이 방법은 시험관 배양된 Th17 세포로 림프구감소성 마우스를 재구성한 후 칸디다 알비칸스(C. albicans)로 경구 감염시키는 것을 기반으로 합니다. 결과는 억제되지 않은 Th17 세포가 염증 및 병리학을 유발하고 체중 감소, 전염증성 사이토카인 생성, 혀 조직 병리학 및 사망률을 포함한 여러 측정 가능한 판독과 관련이 있음을 보여주며, 이 모델이 OPC 면역병리학 연구에 유용할 수 있음을 보여줍니다. 조절 세포의 입양 전달(Tregs)은 염증 반응을 제어하고 감소시키며, 이 모델이 구강 염증에 대항하기 위한 새로운 전략을 테스트하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 모델은 다른 구강 질환의 맥락에서 일반적으로 구강 Th17 면역병리학을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

서론

구강 감염 및 염증은 암 및 심혈관 질환과 관련이 있으며 전반적인 인간 건강에 극적인 영향을 미칩니다2,3. C. albicans에 의한 기회감염 및 염증은 원발성 면역결핍증(PID)4,5, 치주염 6,7, 쇼그렌 증후군, 타액선 질환8,9과 같은 염증성 질환, 구강 편평세포암 10-12와 관련이 있습니다. C. albicans는 건강한 사람의 60%의 입에 무증상으로 서식하는 이형성 공생 균류이지만 숙주 방어가 약화될 때 감염을 일으키는 가장 흔한 진균 병원체입니다13-15. 이 질환은 AIDS 및 골반염 환자와 다른 면역 저하 환자에게 재발적이고 만성적인 감염 및 염증을 유발합니다. 공생체로서, 군집화 부하는 전체 구강 마이크로바이옴의 다양성 변화와 관련이 있습니다16. 병원체로서 급성 가성막질, 급성 위축성, 만성 위축성, 만성 비대/과형성 및 각구순염과 같은 여러 형태의 구인두 칸디다증을 유발합니다.

C. albicans에 대한 보호는 숙주 면역 저항뿐만 아니라 칸디다 유도 면역 병리학을 적절하게 조절하는 능력에 의해 결정됩니다. C. albicans와 같은 공생동물은 다른 구강 염증 상태의 조절 및 악화에 기여하지만, 기회감염 중에 dysbiosis가 발생하는 메커니즘은 명확하지 않습니다. C. albicans17에 대한 기억 반응에서 적응 Th17 세포의 알려진 역할 외에도, 만성 감염 중 염증 병리의 시작 및 영속에서의 역할은 불분명합니다. 또한, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 및 치주염(periodontitis)과 같은 구강 염증성 질환은 Th17 매개 병리학과 관련이 있습니다. 흥미롭게도 이러한 질병은 잦은 OPC와도 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 Th17 세포 간의 상호 작용, OPC의 구강 면역 병리학 및 기타 구강 염증성 질환은 연구되지 않았습니다.

구강 칸디다증의 1차 및 2차 감염에 대한 마우스 모델을 사용할 수 있지만, 특히 면역 결핍의 맥락에서 칸디다 감염과 관련된 Th17 염증을 연구하기 위한 마우스 모델은 사용할 수 없습니다. 이 연구는 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 구강 Th17 염증을 확립하는 방법을 제시합니다. 생쥐의 칸디다 감염은 곰팡이 병변, 혀의 염증, 음식 섭취 감소, 체중 감소 및 결국 빈사 상태가 특징입니다. 구강 병리학은 마우스 구강암 모델에서 상피 이형성증뿐만 아니라 만성 칸디드 감염 병변과 유사합니다12,18.

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프로토콜

참고 : 마우스를 사용하여 실험 기관 동물 복지위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라 실시 하였다.

(감염에 세 가지 일 이전) I N 체외 배양 된 Th17 세포와 마우스 - / - 1. 헝겊-1을 재구성

  1. 수용성의 존재에 혼자 U-바닥 96 웰 플레이트, 또는 3 × 104 CD4 + CD25 + Foxp3의 + Tregs과 함께 공동 문화를에서 Th17 세포, 문화 CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- 나이브 T 세포 (× 104 3) 수립 α-CD3 (1 ㎍ / ㎖) α-CD28 (2 ㎍ / ㎖) Th17 조건 하에서 항체 및 항원 제시 세포 (IL-6 (25 NG / ㎖), TGF-의 β를 이용하여 편광 (이 NG / ㎖) , α-IFN-γ (2 ㎍ / ml) 및 α -IL-4 (2 ㎍ / ㎖)) 3~4일 대.
    참고 : 나이브 세포와 T의, 규정 정렬 형광 활성화 된 셀을 사용하여 정렬 된 (FACS)자기 세포 분리 절차 D 배양 앞서 설명한 바와 같이 19-22.
  2. 4 일에, 피펫을 사용하여 Th17 세포를 재 부유 한 후, 문화에서 그들을 수집하고, 멸균 조건을 원심 분리기.
    1. 자신의 생존과 표현형에 대한 검사 이러한 세포의 작은 나누어지는 가져 가라. 요오드화 프로피 듐 (중에는 200ng / ㎖)를 첨가하고, 유세포 분류법으로 즉시 평가 생존, R​​PMI 배지 500 μL에이를 재현 탁. restimulation 후 IL-17A 생산의 평가 유동 세포 계측법에 의해 표현형을 수행합니다 (6.3 절 참조).
  3. 달리 명시하지 않는 한 모든 원심 분리 단계에서 39 ° C에서 6 분 동안 480 XG에 멸균 PBS에서 세포 주 벌크 씻는다.
  4. 6~8주 된 CD45.2 Rag1에 입양 전송을 위해 이러한 세포를 사용하여 - / - 면역 결핍 쥐.
    1. 찬 멸균 PBS를 사용하여 1 × 10 7 세포 / ㎖의 세포 밀도로 세포를 재현 탁.
    2. intrap에 의한 세포의 100 μl를 주입eritoneal 주사 한 마우스가 1 × 10 6 세포를 수신하도록, 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기에 25 G 바늘을 사용. 일부 마우스는 PBS 또는 Th17 세포를 받게됩니다, 다른 마우스는 TREG 세포와 공동 배양 Th17 세포를 받게됩니다.
      참고 : 무균 모든 단계를 수행합니다.

2. C. 성장 감염 알비 칸스 (일일 감염 이전에)

  1. 접종 전에 CAF2-1 C. 다섯 식민지를 분산 알비 칸스 실험실 멸균 PBS 현탁액 100 ㎕의 변형 및 멸균 국물에 서스펜션을 추가합니다.
  2. C. 5 식민지를 접종 효모 질소 염기의 50 ㎖에 칸디다 알비 칸스 (아미노산없이 YNB) / 펩톤 / 덱 스트로스 브로 쓰 배지 및 130 rpm에서 15 내지 18 시간 동안 30 ℃에서 진탕 배양기에서 배양한다.
  3. 즉, 균류의 성장을 표시 한, 백탁 국물 용 모니터.

3. 칸디다수확과 (감염의 날) 계수 절차

  1. 15 ml의 튜브에 칸디다 균 배지 10 ㎖를 수집합니다. 큰 볼륨의 경우, 50 ㎖ 튜브에 칸디다를 수집합니다.
  2. 달리 명시하지 않는 한 모든 단계에서 RT에서 5 분 동안 1,900 XG에 blastospores 원심 분리기. 상등액을 제거하여 원심 분리를 blastospores 펠렛.
  3. 하나 이상의 튜브가있는 경우, 펠릿 멸균 PBS를 첨가 다중 튜브의 칸디다 blastospores 수영장 카운팅 및 PBS 10 ㎖로 재현 탁 그들을.
  4. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 blastospores의 20 μl를 타고 배 파라 포름 알데히드의 20 μl를 추가하고 15 ~ 20 분 동안 실온에서 품어. 현미경으로 혈구를 사용하여 고정 blastospores를 계산합니다.
    참고 : 파라 포름 알데히드는 발암입니다. 만 흄 후드의 원액을 엽니 다.
  5. 한편, t를 원심 분리하여, 두 번 이상 반복 세척 blastosporesPBS에서 밑단하고 blastospores을 펠렛. 감염에 대한 준비, ABSL1 후드, RT에서 15 ml의 튜브에 펠릿을 유지합니다.
  6. 감염 blastospores을 재 부유에 대한 RT에서 일부 멸균 PBS를 남겨주세요.
  7. 카운팅 한 후, 효모 세포 / ml의 X10이 8 blastospore 효모의 세포 수를 조정할 blastospore 펠렛을 멸균 PBS를 추가한다. 이는 쥐를 감염 사용될 blastospore 현탁액이다.
    참고 : 무균 모든 단계를 수행합니다.

4. 마우스 감염 (셀 전송 후 3 ~ 5 일)

주 : 앞서 설명 된 바와 같이 19,23-25 ​​기본적인 감염 과정이 수행된다.

  1. - / - PBS 3 일 이전에 세포를받은 쥐 헝겊-1의 무게.
  2. 자신의 체중을 이용하여 마취제의 용량을 계산합니다. INTR에 의해, 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기에 25 G 바늘을 사용하여, 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 혼합물 (16.1 ㎎ / ㎖ 및 1.6 ㎎ / ㎖)을 투여하여 쥐를 마취aperitoneal 주입.
    1. 체중 10g 당 50 μL를 관리. (즉, 케타민 0.8 mg의 체중의 자일 라진 / 10g 또는 0.08 mg의 케타민과 80 mg의 체중 kg 당 자일 라진 8 mg을 각각). 발가락 핀치 응답을 마취 후 매 15 분을 준수하십시오.
      참고 :이 투여 량은 감염 과정에 대한 충분한 마취의 60 ~ 90 분을 유도 할 것이다.
    2. 건조로부터 각막을 방지하기 위해 마우스의 눈 안과 윤활유 연고를 적용합니다. 눈의 윤활유가 건조 수있는 바와 같이, 안과 윤활마다 45 분을 반복합니다.
  3. 마취 중 마우스의 재수 화를 돕기 위해 앞다리 피하 후면에 인접한 식염수 (0.9 %의 NaCl) 1ml를 주입한다.
  4. 새로운, 깨끗한 케이지를 얻습니다. 일단 감염 새로운 케이지에 각 마우스를 배치, 한 번에 감염 절차를 하나의 마우스를 따르십시오. 제 PBS / 가짜 감염을 수행 한 다음 칸디다 감염 촉진제로 진행업.
  5. 마취 마우스를 들고 혀의 기지를 공개하는 넓은 입을 엽니 다.
    1. 설하 90 분 동안 구강, PBS 또는 blastospore 현탁액 50 μL로 포화 3mm 직경 목화 공을 놓습니다. 코튼 볼이 움직이지 않는 것을 보장, 폐 울혈을 방지하기 위해 다시 쥐에게 15 분마다 전면 플립합니다.
  6. 구강에 가짜 또는 칸디다 균 접종 90 분을 보장하기 위해 모든 마우스에 대한 타이머를 설정합니다.
  7. 가열 램프 (4피트 거리)에서 케이지, 열 젤 패드에 각 마우스에 보관하십시오.
  8. 혀는 혀를 lacerating 치아를 방지하기 위해 치아 내부와 멀리 철회되어 있는지 확인합니다.
  9. 90 분의 끝에서 마우스의 입에서 면봉을 제거한다. 75분보다 빨리 마​​취에서 회복 수있는 마우스 시계. 이러한 경우에, 단지 케타민 (40 ㎎ / kg)으로 다시 마취.

5. 포스트 Procedur전자 (90 분 마취시) 모니터링

  1. 90 분 마취 중 열 젤 패드를 사용합니다.
    1. 체온을 유지하고 질식을 방지하기 위하여, 생쥐는 보통 옥수수 냉이 마우스 침구에 복구 할 수 없다.
  2. 마취에서 회복 한 후, 뒷면에 두 개의 위치에 멸균 0.9 % 염화나트륨 피하의 추가 1 ml에 관리 할 수​​ 있습니다.
  3. 다섯 PBS (가짜) 케이지 당 접종 한 마우스에 계속. 케이지 당 하우스 만 1-2 감염된 쥐.
  4. 습관과 전반적인 건강을 정리, 체중의 변화를주의하는 것이 시술 후 매일 이니셜 절차 카드를 작성합니다.

6. 염증 평가

6.1) 체중 감소

  1. 감염 절차 이전에 하루에 시작, 감염 동안 매일 마우스의 무게를.
    참고 : 일반적으로, Th17 세포없이 T의, 규정에 주입 된 면역 결핍 마우스 (20)에 굴복인해 -30 %의 중량 손실은 19 진균 부담 증가 및 염증을 악화.

혀의 6.2) 조직학 득점

  1. 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식하여 쥐를 희생.
  2. 턱을 열고 가위와 집게로 혀를 해부하다. 혀를 잡아 무딘 집게를 사용하고, 가위 입의 뒤쪽으로 다가 사용하는 혀의 뒤쪽 끝을 절개.
  3. 면역 세포 화학 헤 마톡 실린 및 에오신 혀 조직의 (H & E) 염색의 경우, 얼음 차가운 PBS와 혀의 조직을 씻어. 15 ml의 튜브 / N을 2-3 방언을 10 % 포르말린 5 mL를 추가하고 O를 수정.
    1. 다음날, 포르말린을 제거하고, 하이퍼 고정을 방지하기 위해 70 % 에탄올 5 ml의 조직 몰입. 단면 및 파라핀 섹션의 염색, 파라핀 삽입을 계속 상용 서비스로 보내십시오.
      참고 : 상업 조직학 서비스는 다음 단계를 수행하는 데 사용됩니다.
  4. 슬라이드 다시 상업 조직학 서비스에서 일단, 학년 광학 현미경 조직 절편을 관찰하여 염증.
    1. 0은 염증 되 않으며, 5 가장 심한 염증 인 상태 0-5 점수. 표 1을 사용하여 염증 점수.

Th17 세포에 의해 6.3) 사이토킨 생성

참고 : 과도한 TNF-α 생산은 과도한 면역 병리의 판독 중 하나입니다. 마우스를 적응 적 Th17 세포 만 전송되면, 그것은 Th17 세포에서 과도한 TNF-α의 생산과 관련된 면역 병리 발생된다.

  1. 전술 한 방법을 사용하여 비장 19,26, 경부 림프절, 겨드랑 lymphnodes, 혀에서 단일 세포 현탁액을 수집.
  2. Brefeldin A (10 ㎍ / ㎖)으로 4 시간 동안 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (50 NG / ml) 및 이오 노마 이신 (500 NG / ㎖)와 함께 세포를 Restimulate는 L 첨가대서양 표준시 2 시간. PBS로 세포를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 상용 고정 / 투과성으로 키트를 사용하여 고정한다.
  3. 앞서 설명한 바와 같이 19를 형광 접합 된 항 TNF-α, IL-항 17a 및 ROR - γt 항체를 이용하여 세포 내 사이토 카인 염색법을 수행한다.
  4. / ml의 최종 농도 3 μg의 - 간단히, 항 TNF-α, IL-항 17a 및 ROR - γt 항체, 각각의 AT (2) 항체의 칵테일 (1X)의 투과성으로 버퍼에 세포를 재현 탁.
  5. RT에서 1 시간 동안 세포를 배양한다.
  6. 배양 후, 1X의 투과성으로 버퍼로 세포를 씻어.
  7. 유세포 분석을 0.5 % 소 혈청 알부민 500 μl의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁.

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결과

이 모델에서, 걸 레-1의 칸디다 -infected 마우스 및 감염되지 않은 쥐 모두 - / - 면역 결핍 배경이 적응 적 감염 3-5 일 전에 Th17 세포를 옮겼다. 10-12 마우스의 총 위장 감염이 각 그룹의 생쥐 및 칸디다 감염, 각 그룹에서 4-5으로, 실험에 사용 하였다. 주입 Th17 세포는 각각 (도 1a)을 Thy1.1 또는 CD45.1 염색법을 사용하여 생체 내에서 추적 된되도록 나이브 세포, CD45.1 congenic Thy1.1 또는 마우스로부터 유래 하였다. 공동 양도 된 T는, 규정 CD45.1 Th17 세포로부터 구별되도록 CD45.2 마우스로부터 유도 하였다. 일부 실험에서, CB-17 SCID Thy1.2받는 마우스는 Thy1.1을 Balb / C 마우스 및 congenic Thy1.2 마우스로부터 수득 된 T, 규정에 의한 Th17 공여체 ...

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토론

이 모델은 경구 C. 유도에 기초 알비 칸스 (Candida albicans) 감염 따라 Th17 염증. 때문에 T의, 규정의 부재로, Th17 세포에 의한 염증은 무제한이며 제대로 해결 면역 병리로 연결됩니다. 시험관이 Th17 세포가 입양 전송에 사용했다 편광 순진한 CD4 세포를 유도. 40 - 배양 된 CD4 + 세포의 50 %가 약 3 일 검출 가능한 IL-17A 식 (Th17 세포)를 보여 주며, 따라서 마우스에서 주사에 사용 하였다. 모델의 주요 이점은 Th17 세포가 효율적으로 T의 레지 주입으로 개선 될 수있는 특정 면역 병리 감염을 야기한다는 것이다. 따라서 모델은 양성 대조군으로 T의 레지 분사 면역 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다. 염증은 쉽게 감염 마우스의 Th17 세포에 의한 체중 감소, 조직 병리학 점수 및 염증성 사이토킨 생성에 기초하여 평가된다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

유세포 분석기를 사용할 수 있게 해주신 Dr. Helene Bernstein에게 감사드립니다. 또한 유세포 분석 서비스에 대해 CFAR 유세포 분석 시설에 감사드립니다. 이 프로젝트는 CTSC 핵심 활용 기금과 PP에 대한 STERIS Corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases 보조금의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CAF-2University of Pittsburgh (Sarah Gaffen)-칸디다 문화
U-bottom 96 웰 플레이트 Fisher055588세포 배양
a-CD3에 사용됩니다.eBiosciences16-0031-85Th17 조건 a-CD28에 대한 세포의 분극;
eBiosciences16-0281-85Th17 조건으로의 세포 편광
m-IL-6Bio BasicRC232Th17 조건
h-TGF-b 로의R& D240-BTh17 조건
a-IFN-g 에eBiosciences16-7311-85Th17 조건
a-IL-4 에eBiosciences16-7041-85Th17 조건으로의 세포 분극
&-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82세포 배양에 사용 - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41세포 배양에 사용 - 1:100
α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82세포 배양에 사용 - 1:50
YNB w/o 아미노산)/펩톤/덱스트로스 브로스 매체 바이오 베이직S507. SIZE칸디다 성장을 위한 메디움
셰이커 인큐베이터 New Brunswick ScientificInnova 4300칸디다
15 ml 튜브Bio BasicBT888-SY세포 배양 및 칸디다 성장에 사용
50 ml 튜브Bio BasicCT 788-YS세포 배양 및 칸디다 성장에 사용
탁상용 원심분리기VWR International LLC82017-654칸디다 펠릿화용 -900 g
Allegra 원심분리기Beckman Coulter392302세포 배양 - 480g
1.5ml 에펜도르프 튜브Bio BasicBT620-NS칸디다의 최종 농도 준비
2x 파라포름알데히드전자 현미경 과학15710계수용 칸디다 고정
혈구계VWR International LLC15170-172셀
계수 PBS - 인산염 완충 식염수바이오 베이직PD8117완충액
케타민/자일라진의 제조 Case Western Reserve University - 동물 자원 센터-ARC에서 승인한 마취
안과 윤활제 연고에 대한 프로토콜 획득 건조를 방지하기 위한 동물용Allergan-Eye
식염수 (0.9% NaCl)G Biosciences786-561탈수 방지를 위해 동물에게 투여됨
3mm 직경의 솜털 공 VWR International LLCBP7603칸디다 감염용 3mm 공
히트 젤 패드케이스 웨스턴 리저브 대학교 - 동물 자원 센터-체온 유지 및 빠른 회복을 위해
헤마톡실린과 에오신 염색Histoserv - MD-조직 조직학
10% 포르말린 전자 현미경 과학JC1111/MC조직 조직학
70% 에탄올 VWR International LLC97064-490살균 목적
PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP1585-1MG세포 복원
IonomycinLife Technologies124222 1mg세포 복원
고정 투과 가능성 키트eBiosciencesE16913-106유세포 분석
투베르쿨린 주사기용 고정 세포BD Biosciences309659마우스 주입
25 G x 3/8 바늘BD Biosciences309626마우스 주입
Rag1 -/- 마우스Jackson laboratories재고 번호: 002216수령인 마우스
CD45.1 congenic 마우스Jackson laboratories재고 번호:002014 공여체 Th17 세포
CB17-SCID 마우스잭슨 연구소재고 번호: 001303수혜자 마우스
Balb/c 마우스잭슨 연구소재고 번호: 000651기증자 Th17 세포
세포 편광; 대한 세포의 분극; 대한 세포의 분극;용 배양 성장 연고

참고문헌

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면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델
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