Method Article

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

DOI:

10.3791/52538

⸱

February 18th, 2015

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

숙주 면역 저항을 연구하기 위해 칸디다 감염 모델을 사용할 수 있지만, 칸디다 감염과 관련하여 T 세포 매개 면역병리학을 연구하기 위한 모델은 없습니다. 여기에서는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

구인두 칸디다증(OPC) 질환은 숙주 면역 저항이 부족할 뿐만 아니라 감염 유발 면역 병리학의 적절한 조절이 없기 때문에 발생합니다. Th17 세포는 항진균 방어와 관련이 있지만 면역 병리학에서 그 역할은 불분명합니다. 본 연구는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디달 감염과 관련된 구강 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 제시한다. 이 방법은 시험관 배양된 Th17 세포로 림프구감소성 마우스를 재구성한 후 칸디다 알비칸스(C. albicans)로 경구 감염시키는 것을 기반으로 합니다. 결과는 억제되지 않은 Th17 세포가 염증 및 병리학을 유발하고 체중 감소, 전염증성 사이토카인 생성, 혀 조직 병리학 및 사망률을 포함한 여러 측정 가능한 판독과 관련이 있음을 보여주며, 이 모델이 OPC 면역병리학 연구에 유용할 수 있음을 보여줍니다. 조절 세포의 입양 전달(Tregs)은 염증 반응을 제어하고 감소시키며, 이 모델이 구강 염증에 대항하기 위한 새로운 전략을 테스트하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 모델은 다른 구강 질환의 맥락에서 일반적으로 구강 Th17 면역병리학을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

Introduction

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구강 감염 및 염증은 암 및 심혈관 질환과 관련이 있으며 전반적인 인간 건강에 극적인 영향을 미칩니다2,3. C. albicans에 의한 기회감염 및 염증은 원발성 면역결핍증(PID)4,5, 치주염 6,7, 쇼그렌 증후군, 타액선 질환8,9과 같은 염증성 질환, 구강 편평세포암 10-12와 관련이 있습니다. C. albicans는 건강한 사람의 60%의 입에 무증상으로 서식하는 이형성 공생 균류이지만 숙주 방어가 약화될 때 감염을 일으키는 가장 흔한 진균 병원체입니다13-15. 이 질환은 AIDS 및 골반염 환자와 다른 면역 저하 환자에게 재발적이고 만성적인 감염 및 염증을 유발합니다. 공생체로서, 군집화 부하는 전체 구강 마이크로바이옴의 다양성 변화와 관련이 있습니다16. 병원체로서 급성 가성막질, 급성 위축성, 만성 위축성, 만성 비대/과형성 및 각구순염과 같은 여러 형태의 구인두 칸디다증을 유발합니다.

C. albicans에 대한 보호는 숙주 면역 저항뿐만 아니라 칸디다 유도 면역 병리학을 적절하게 조절하는 능력에 의해 결정됩니다.

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Protocol

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참고 : 마우스를 사용하여 실험 기관 동물 복지위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라 실시 하였다.

(감염에 세 가지 일 이전) I N 체외 배양 된 Th17 세포와 마우스 - / - 1. 헝겊-1을 재구성

  1. 수용성의 존재에 혼자 U-바닥 96 웰 플레이트, 또는 3 × 104 CD4 + CD25 + Foxp3의 + Tregs과 함께 공동 문화를에서 Th17 세포, 문화 CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- 나이브 T 세포 (× 104 3) 수립 α-CD3 (1 ㎍ / ㎖) α-CD28 (2 ㎍ / ㎖) Th17 조건 하에서 항체 및 항원 제시 세포 (IL-6 (25 NG / ㎖), TGF-의 β를 이용하여 편광 (이 NG / ㎖) , α-IFN-γ (2 ㎍ / ml) 및 α -IL-4 (2 ㎍ / ㎖)) 3~4일 대.
    참고 : 나이브 세포와 T의, 규정 정렬 형광 활성화 된 셀을 사용하여 정렬 된 (FACS)자기 세포 분리 절차 D 배양 앞서 설명한 바와 같이 19-22.
  2. 4 일에, 피펫을 사용하여 Th17 세포를 재 부유 한 후, 문화에서 그들을 수집하고, 멸균 조건을 원심 분리기.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    이 모델에서, 걸 레-1의 칸디다 -infected 마우스 및 감염되지 않은 쥐 모두 - / - 면역 결핍 배경이 적응 적 감염 3-5 일 전에 Th17 세포를 옮겼다. 10-12 마우스의 총 위장 감염이 각 그룹의 생쥐 및 칸디다 감염, 각 그룹에서 4-5으로, 실험에 사용 하였다. 주입 Th17 세포는 각각 (도 1a)을 Thy1.1 또는 CD45.1 염색법을 사용하여 생체 내에서 추적 된되도록 나이브 세포, CD45.1 congenic Thy1.1 또는 마우스로부터 유래 하였다. 공동 양도 된 T는, 규정 CD45.1 Th17 세포로부터 구별되도록 CD45.2 마우스로부터 유도 하였다. 일부 실험에서, CB-17 SCID Thy1.2받는 마우스는 Thy1.1을 Balb / C 마우스 및 congenic Thy1.2 마우스로부터 수득 된 T, 규정에 의한 Th17 공여체 .......

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    이 모델은 경구 C. 유도에 기초 알비 칸스 (Candida albicans) 감염 따라 Th17 염증. 때문에 T의, 규정의 부재로, Th17 세포에 의한 염증은 무제한이며 제대로 해결 면역 병리로 연결됩니다. 시험관이 Th17 세포가 입양 전송에 사용했다 편광 순진한 CD4 세포를 유도. 40 - 배양 된 CD4 + 세포의 50 %가 약 3 일 검출 가능한 IL-17A 식 (Th17 세포)를 보여 주며, 따라서 마우스에서 주사에 사용 하였다. 모델의 주요 이점은 Th17 세포가 효율적으로 T의 레지 주입으로 개선 될 수있는 특정 면역 병리 감염을 야기한다는 것이다. 따라서 모델은 양성 대조군으로 T의 레지 분사 면역 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다. 염증은 쉽게 감염 마우스의 Th17 세포에 의한 체중 감소, 조직 병리학 점수 및 염증성 사이토킨 생성에 기초하여 평가된다.

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    유세포 분석기를 사용할 수 있게 해주신 Dr. Helene Bernstein에게 감사드립니다. 또한 유세포 분석 서비스에 대해 CFAR 유세포 분석 시설에 감사드립니다. 이 프로젝트는 CTSC 핵심 활용 기금과 PP에 대한 STERIS Corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases 보조금의 일부 지원을 받았습니다.

    ....

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    CAF-2University of Pittsburgh (Sarah Gaffen)-칸디다 문화
    U-bottom 96 웰 플레이트 Fisher055588세포 배양
    a-CD3에 사용됩니다.eBiosciences16-0031-85Th17 조건 a-CD28에 대한 세포의 분극;
    eBiosciences16-0281-85Th17 조건으로의 세포 편광
    m-IL-6Bio BasicRC232Th17 조건
    h-TGF-b 로의R& D240-BTh17 조건
    a-IFN-g 에eBiosciences16-7311-85Th17 조건
    a-IL-4 에eBiosciences16-7041-85Th17 조건으로의 세포 분극
    &-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82세포 배양에 사용 - 1:50
    α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41세포 배양에 사용 - 1:100
    α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82세포 배양에 사용 - 1:50
    YNB w/o 아미노산)/펩톤/덱스트로스 브로스 매체 바이오 베이직S507. SIZE칸디다 성장을 위한 메디움
    셰이커 인큐베이터 New Brunswick ScientificInnova 4300칸디다
    15 ml 튜브Bio BasicBT888-SY세포 배양 및 칸디다 성장에 사용
    50 ml 튜브Bio BasicCT 788-YS세포 배양 및 칸디다 성장에 사용
    탁상용 원심분리기VWR International LLC82017-654칸디다 펠릿화용 -900 g
    Allegra 원심분리기Beckman Coulter392302세포 배양 - 480g
    1.5ml 에펜도르프 튜브Bio BasicBT620-NS칸디다의 최종 농도 준비
    2x 파라포름알데히드전자 현미경 과학15710계수용 칸디다 고정
    혈구계VWR International LLC15170-172셀
    계수 PBS - 인산염 완충 식염수바이오 베이직PD8117완충액
    케타민/자일라진의 제조 Case Western Reserve University - 동물 자원 센터-ARC에서 승인한 마취
    안과 윤활제 연고에 대한 프로토콜 획득 건조를 방지하기 위한 동물용Allergan-Eye
    식염수 (0.9% NaCl)G Biosciences786-561탈수 방지를 위해 동물에게 투여됨
    3mm 직경의 솜털 공 VWR International LLCBP7603칸디다 감염용 3mm 공
    히트 젤 패드케이스 웨스턴 리저브 대학교 - 동물 자원 센터-체온 유지 및 빠른 회복을 위해
    헤마톡실린과 에오신 염색Histoserv - MD-조직 조직학
    10% 포르말린 전자 현미경 과학JC1111/MC조직 조직학
    70% 에탄올 VWR International LLC97064-490살균 목적
    PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP1585-1MG세포 복원
    IonomycinLife Technologies124222 1mg세포 복원
    고정 투과 가능성 키트eBiosciencesE16913-106유세포 분석
    투베르쿨린 주사기용 고정 세포BD Biosciences309659마우스 주입
    25 G x 3/8 바늘BD Biosciences309626마우스 주입
    Rag1 -/- 마우스Jackson laboratories재고 번호: 002216수령인 마우스
    CD45.1 congenic 마우스Jackson laboratories재고 번호:002014 공여체 Th17 세포
    CB17-SCID 마우스잭슨 연구소재고 번호: 001303수혜자 마우스
    Balb/c 마우스잭슨 연구소재고 번호: 000651기증자 Th17 세포
    세포 편광; 대한 세포의 분극; 대한 세포의 분극;용 배양 성장 연고

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Allam, J. P., et al. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).
    2. Loesche, W. J.

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    Th17 Inflammation ModelOropharyngeal CandidiasisImmunodeficient MiceAdoptive T Cell TransferCandida Albicans InfectionFlow Cytometry AnalysisImmunohistochemistry AnalysisTreg Cell TransferWeight Loss MeasurementTongue Histopathology

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