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방법 논문

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

10.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52539

⸱

2015년 5월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

유전자 타겟팅은 현대 생물 의학 연구에서 유전자 기능을 특성화하기위한 중요한 방법입니다. 그러나, 인간의 세포에서 표적 유전자의 효율은 원하는 속도로 인간 세포주의 생성을 방지, 저왔다. 지난 2 년은 CRISPR (Interspaced 짧은 회문 반복 정기적으로 클러스터) / CAS (CRISPR 관련) 시스템으로 게놈 편집 도구에 의해 유전자 조작의 효율성을 향상에 신속한 진행을 목격했다. 이 원고는 상동 재조합 지원 CRISPR / CAS 시스템을 사용하여 혈통 특정 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기자를 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다. , CRISPR / CAS 시스템을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만들기 위해 필요한 구성 요소를 획득 타겟팅 벡터 및 RNA는 단일 가이드의 구조에 초점을위한 절차가 설명된다. 이 프로토콜은 hiPSCs에서 플랫폼 구축 돌연변이 보정을 확장 할 수있다.

서론

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템은 다른 게놈 편집 도구와 함께 최근 몇 년 동안 인간 게놈 조작에 혁명을 일으켰습니다1-7. CRISPR/Cas9 시스템의 주요 구성 요소는 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 Cas9입니다. Cas9은 RNA 유도 II형 DNA 엔도뉴클레아제입니다. 여기에는 HNH와 RuvC라는 두 개의 뉴클레아제 도메인이 있으며, 이는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 7-10 옆의 특정 게놈 영역에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 만드는 역할을 합니다. sgRNA는 박테리아(예: 연쇄상구균 화농성체)와 고세균에서 확인된 두 개의 적응 면역 RNA 분자인 crRNA와 tracrRNA의 기능을 결합하여 외인성 소스의 DNA 침입에 맞서 싸웁니다9-11. 적절하게 설계되어 포유류 세포에 동시 도입되면 sgRNA는 PAM 염기서열을 인식하고, 표적 DNA의 상보적 가닥과 염기쌍을 이루고, Cas9를 유도 및 transactivate하여 PAM7의 바로 상류에 있는 두 DNA 가닥을 절단합니다. 그 후, DSB를 복구하기 위해 상동 유도 재조합(HDR, 표적화 벡터가 있는 경우) 또는 비상동 말단 결합(NHEJ)이 발생합니다. cDNA, 리포터 카세트 또는 항생제 내성 단편과 같은 전이유전자를 통합하고 형질전환 또는 넉인 라인을 만들 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 시스템은 매우 효율적이고 비교적 특이적이지만, 바람직하지 않은 off-target 활동이 보고되었습니다12-15. off-target 이벤트를 최소화하기 위해 Cas9 nickase (Cas9n)도9,10,14,16,17로 엔지니어링되었습니다. Cas9n(Cas9 D10A 또는 Cas9 H840A)은 두 개의 뉴클레아제 도메인 중 하나에 돌연변이가 있는 Cas9 효소로, DNA의 한 가닥에서만 흠집을 유발합니다. 두 가닥에서 절단을 달성하기 위해 두 개의 sgRNA는 두 개의 서로 다른 DNA 가닥의 가까운 loci에서 별도로 절단하는 한 쌍의 nickase를 안내하도록 설계되었습니다. "더블 니킹(double nicking)" 전략은 기존 Cas9 플랫폼보다 더 엄격한 설계가 필요하며, 유전자 편집 실험을 위한 높은 효율성과 높은 특이성을 제공합니다.

이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 리포터를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. CRISPR/Cas 시스템 매개 게놈 편집을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만드는 데 필요한 구성 요소를 얻는 단계가 표적 벡터 및 sgRNA의 구성에 중점을 두고 설명됩니다. 이 프로토콜은 건강한 개인과 CNS 질환 환자로부터 유래한 세포주를 포함한 여러 hiPSC 계통에서 성공적으로 반복되었습니다. 본 연구실에서 표적으로 하는 유전자는 OLIG2, HB9(MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 및 SOD1입니다. hiPSC에서 CRISPR/Cas 시스템 매개 상동 재조합의 표적 효율은 20-40%이며, 이는 이전 보고서1,18,19와 일치합니다. 기존 유전자 표적화 실험에서 1-2%의 일반적인 효율과 비교하여 표적화 효율이 크게 개선되었습니다.

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프로토콜

1. 벡터 타겟팅을 위한 설계 및 벡터 구성

  1. 계통 특이적 마커가 결정되면 유전자의 게놈 염기서열을 찾고 그에 따라 상동성 암을 설계합니다. 5' 상동성 암의 길이는 ~1kb이고 3' 상동성 암의 길이는 ~1.5kb입니다(그림 1).
  2. subcloning을 통해 stop codon 직전의 게놈 염기서열 다운스트림에 리포터 카세트를 순차적으로 태그하여 내인성 발현이 변경되거나 중단되지 않도록 합니다. 리포터 또는 듀얼 리포터 카세트를 자가 절단 2A 펩타이드 서열(F2A, E2A 또는 T2A) 20,21 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 연결합니다.
    참고: 리포터는 GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, 루시퍼라제 또는 형광 단백질과 항생제 내성 카세트의 조합인 항생제 내성 카세트와 같은 형광 단백질을 포함할 수 있습니다. 그림 1에는 EGFP 및 네오마이신 내성 카세트로 태그가 지정된 인간 ALDH1L1 유전자에 대한 표적화 벡터를 구성하기 위한 예가 나와 있습니다.
  3. 리포터의 다운스트림에 포지티브 선택 카세트를 추가합니다. positive selection은 양성 클론을 선택하고 분리한 후 표적 iPSC에서 절제되는 플록스된 항생제 내성 카세트입니다.
  4. 3' homology arm 외부에 negative selection cassette를 포함합니다. 일반적인 음성 선택 카세트는 티미딘 키나아제(thymidine kinase), TK 및 디프테리아 독소 A(diphtheria toxin A, DTA) 22입니다.
  5. 계통 마커의 염기서열을 포함하는 human BAC 클론을 획득하고 PCR 증폭으로 클론을 검증합니다. 재조합(recombinationering)을 사용하여 pKD46에 타겟화 벡터를 구축하여 타겟 부위 23을 풀다운합니다. 필요한 경우 다중 사이트 게이트웨이, 골든 게이트 전략23,24를 적용합니다.

2. CRISPR/Cas9 시스템용 sgRNA의 설계 및 벡터 구성.

  1. 리포터를 만들기 위해 대상으로 할 계보별 마커를 결정합니다. NCBI 데이터베이스에서 cDNA 염기서열을 복사합니다. human BLAT 검색으로 이동하여 게놈 DNA 정렬을 획득합니다.
  2. "브라우저" 탭을 클릭하면 유전자의 조립을 볼 수 있습니다. "보기" 탭에서 "DNA"를 클릭하여 FASTA 형식의 전체 게놈 DNA 염기서열을 얻습니다.
  3. DNA 염기서열 내에서 정지 코돈을 찾으면 2A 염기서열과 리포터 카세트가 태그됩니다.
  4. stop codon의 vinicity(~100bp 측면 영역) 내에서 protospacer 인접 모티프(PAM, 즉 NGG)를 검색합니다. 두 가닥을 모두 스캔하여 적절한 NGG 염기서열을 찾습니다. 잠재적인 off-target 이벤트를 피하기 위해 업스트림 염기서열의 특이성을 고려하십시오. BLAST 및 CasOT와 같은 오픈 소스 도구를 사용합니다(자세한 내용은 5단계 참조).
  5. NGG 바로 업스트림에 있는 20개 염기의 염기서열을 복사하여 웹 디자인 도구인 ZiFit에 붙여넣어 human-gRNA-expression vector(U6 promoter 포함) MLM3636와 호환되는 돌출부가 있는 oligo를 설계합니다.
  6. 정방향 올리고와 역방향 올리고를 모두 합성합니다 7.
  7. 이중 가닥 sgRNA를 만들려면 70°C에서 15분 동안 두 올리고를 모두 변성시키고 점차적으로 RT로 냉각합니다. 50 μl 반응의 경우, 각각 22.5 μl의 정방향 및 역방향 올리고(스톡 농도는 0.1 mM)와 5 μl의 어닐링 완충액(100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0)을 첨가합니다.
  8. 2.7단계에서 얻은 올리고를 BsmBI 분해된 human-gRNA-expression vector(U6 promoter 포함) MLM3636와 혼합 및 접합합니다. 20 μl 반응의 경우, Step 2.7의 올리고 1 μl, MLM3636 100 ng 및 T4 리가제 1 μl(400 U)를 추가합니다. RT O/N에서 배양합니다.
  9. 42°C에서 30초 동안 열 충격으로 결찰 산물로 DH5α 수용 세포를 형질전환시킵니다. 37°C O/N에서 LB 한천 암피실린(100 μg/ml) 플레이트에서 박테리아를 성장시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid miniprep을 위한 3~5개의 콜로니를 선택합니다. 플라스미드 DNA의 염기서열을 분석하여 상용 공급업체를 사용하여 확인합니다. Maxiprep은 제조업체의 프로토콜에 따라 올바른 플라스미드를 사용합니다.
  10. T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석으로 sgRNA를 평가합니다(자세한 내용은 4단계 참조). plasmid 및 sgRNA를 transfection하면 MLM3636 backbone에 내장된 U6 promoter에서 발현됩니다(자세한 내용은 6단계 참조).

3. Cas9n Double Nickase sgRNA의 설계 및 구성

  1. 이중 니카제 Cas9n D10A 벡터 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)을 얻습니다.
  2. 각 표적 궤적에 대해 한 쌍의 정방향 및 역방향 올리고를 설계합니다. 2단계에서 설명한 대로 NGG의 바로 업스트림에 있는 20개 염기의 염기 염기서열을 복사하여 웹 디자인 도구 ZiFit에 붙여넣습니다
    3. .
  3. pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)과 호환되는 돌출부가 있는 올리고를 얻으려면 ZiFit 설계 도구에 표시된 정방향 및 역방향 올리고의 첫 번째 베이스와 마지막 베이스를 제거합니다.
  4. 정방향 및 역방향 올리고 합성7. 이러한 올리고의 이름을 타겟 부위의 한쪽에 있는 PAM의 경우 f(n)-F, f(n)-R, 타겟 부위의 다른 쪽에 있는 PAM의 경우 r(n)-F, r(n)-R로 지정합니다. 이 중 n은 서로 다른 PAM을 지정하는 숫자이고, 소문자 f와 r은 센스(f) 또는 안티센스(r) 가닥에서 PAM의 위치를 나타내고, F와 R은 순방향 및 역방향 올리고를 나타냅니다.
    1. T7E1 assay(4단계 참조)를 사용하여 여러 쌍(예: r5 및 f2)을 테스트하여 Cas9n에 사용할 최적화된 sgRNA 쌍을 식별합니다.
  5. 이중 가닥 sgRNA를 만들려면 70°C에서 15분 동안 두 올리고를 모두 변성시키고 점차적으로 RT로 냉각합니다. 50 μl 반응의 경우, 각각 22.5 μl의 정방향 및 역방향 올리고 (스톡 농도는 0.1 mM)와 5 μl의 어닐링 버퍼 (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0)를 첨가한다.
  6. 3.5단계에서 얻은 올리고를 BbsI-digested pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)과 혼합 및 접합합니다. 20 μl 반응의 경우, Step 3.5의 sgRNA 1 μl, Cas9n (D10A) 100 ng, T4 ligase 1 μl (400 U)를 첨가합니다. RT O/N에서 배양합니다.
  7. 42°C에서 30초 동안 열충격으로 DH5α 수용 세포를 결찰 산물로 형질전환시킵니다. 37°C O/N에서 LB 한천 암피실린(100μg/ml) 플레이트에서 박테리아를 성장시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid miniprep을 위한 3~5개의 콜로니를 선택합니다. 플라스미드 DNA의 염기서열을 분석하여 상용 공급업체를 사용하여 확인합니다. Maxiprep은 제조업체의 프로토콜에 따라 올바른 플라스미드를 사용합니다.
  8. T7E1 assay로 sgRNA를 평가합니다(자세한 내용은 Step 4 참조). plasmid 및 sgRNA를 사용한 transfection hiPSC는 Cas9n(D10A) backbone에 내장된 U6 promoter에서 발현됩니다(자세한 내용은 6단계 참조).

4. T7 Endonuclease1 (T7E1) Assay에 의한 sgRNA 평가

  1. 24웰 플레이트 1개의 경우, 웰당 2 x 105 293FT 셀을 하루 전(-1일) 플레이트
    2. 화합니다.
  2. transfection 당일(day 0)에 293FT 세포를 sgRNA plasmid 및 Cas9 발현 벡터와 함께 transfection합니다. sgRNA 벡터 0.5μg, Cas9 발현 벡터 JDS246(Cas9-003) 0.5μg, Lipofectamine 2000 1.5μl를 추가합니다.
    1. negative control의 경우, sgRNA 벡터 대신 0.5 μg의 GFP 발현 벡터(예: pcDNA3 backbone에서 CMV promoter driven GFP)를 추가합니다.
  3. 72시간(3일차) 후 DNA 빠른 추출 완충액 100μl를 첨가하고 격렬하게 분쇄하여 세포를 수확합니다.
  4. 혼합물을 68 ° C에서 15 분 동안 배양 한 다음 95 ° C에서 8 분 동안 배양합니다. 이것은 후속 PCR 실험을 위한 템플릿입니다.
  5. PAM을 둘러싸고 있는 염기서열을 증폭하기 위해 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 모두 설계합니다. 일반적으로 표적 PCR 산물의 길이는 약 400-500bp입니다. 올리고를 합성한다7.
  6. 50μl PCR 반응의 경우 Step 4.5의 템플릿 1μl, Herculase II 0.5μl, DMSO 0.5μl, 5x 완충액 10μl, dNTP 믹스 0.5μl, 정방향 및 역방향 프라이머 믹스 1μl를 추가합니다.
  7. 다음 PCR 매개변수를 사용하십시오: 98°C에서 2분 동안 2회, 98°C에서 20초 동안 35회, 59°C에서 20초 동안 59°C, 72°C에서 1분 동안 최종 연장
    참고: 여기에 설명된 PCR 매개변수는 테스트된 여러 유전자에 대한 특정 산물을 생성합니다. 그러나 이러한 조건은 사용자가 선택한 관심 유전자에 따라 다릅니다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR은 종종 여분의 밴드가 나타나지 않도록 최적화해야 합니다. 이러한 여분의 띠는 T7E1 분석 후 절단 산물과 혼동될 수 있습니다.
  8. A260에서 분광계를 사용하여 PCR 산물의 DNA 농도를 측정합니다.
  9. 400ng의 PCR 산물을 2μl의 Digestion buffer 2에 추가합니다. 19 μl의 최종 반응 부피에 ddH2O를 추가합니다. 끓는 물에서 5분 동안 배양합니다. 반응을 벤치에 놓고 RT(45-60분)로 자연스럽게 식힙니다.
  10. T7E1 1 μl(10 units/μl)를 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 6x DNA 로딩 염료와 혼합된 0.25 M EDTA 2 μl를 첨가하여 반응을 중지합니다.
  11. 아가로스 파우더 2.5g을 1xTAE 100ml에 녹입니다. 혼합물을 전자레인지에 넣고 젤 상자에 젤을 붓습니다. 젤이 형성될 때, 2.5% 아가로스 젤에 전체적인 20 μl 반응을 적재하십시오. 젤을 100-150V에서 30분 동안 실행합니다.
  12. 자외선 아래에서 젤을 검사합니다(그림 3). T7E1은 일치하지 않는 부위를 절단합니다. 비상동성 말단 결합을 일으킨 sgRNA의 경우, PCR 산물은 음성 대조군(4.3단계에서 설명)에 비해 추가로 빠른 이동 대역(더 작은 크기)을 보여줍니다.
  13. Image J 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 비교하여 sgRNA 절단 효율과 삽입 및 삭제 비율(indel%)을 추정하고 순위를 매깁니다.
    1. 젤에서 실행되는 각 샘플에 대해 젤 밴드를 자르지 않은 밴드, 절단 밴드 1 및 절단 밴드 2로 지정합니다.
    2. 소프트웨어 핸드북에 따라 ImageJ를 사용하여 각 대역의 밀도를 측정합니다.
    3. 다음 공식을 사용하여 f컷을 계산합니다: fcut = (컷 밴드 1 + 컷 밴드 2) / (비컷 밴드 + 컷 밴드 1 + 컷 밴드 2)
    4. Indel=1- √(1-fcut) 공식을 사용하여 Indel%를 계산합니다.

5. 잠재적인 Off-target Site의 In Silico 예측

참고: Perl 기반 프로그램인 CasOT17이라는 온라인 오픈 소스 도구를 사용하여 잠재적인 오프 타겟 사이트를 예측할 수 있습니다.

  1. Windows 시스템의 경우 CasOT 프로그램과 인간 게놈 데이터베이스 파일을 로컬 하드 드라이브에 다운로드합니다.
  2. 설계된 sgRNA의 타겟 파일을 FASTA 형식으로 준비합니다.
  3. "casot"라는 파일을 엽니다. 명령 창이 나타납니다. 지금은 그대로 두십시오.
  4. "opt-generator"라는 파일을 열어 옵션 문자열을 생성합니다. 대상 파일의 경로와 이름을 "-t" 또는 "-target" 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다.
  5. 게놈 염기서열 파일의 경로를 "-g" 또는 "-genome" 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다.
  6. 입력 값은 –s 또는 –seed(기본값은 2) 및 –n 또는 -nonseed(기본값은 255)입니다. 옵션 문자열이 생성되고 페이지 맨 위에 있는 상자에 나타납니다.
  7. 옵션 문자열을 복사하여 5.3.
    단계에 설명된 CasOT 명령 창에 붙여넣습니다. 참고: 옵션 및 사용하는 컴퓨터에 따라 CasOT 프로그램을 실행하는 데 30-90분이 걸릴 수 있습니다. 완료되면 '--'라는 폴더가 생성됩니다. 이 폴더에는 통계를 설명하는 ".stat" 파일과 자세한 검색 결과가 포함된 .csv(쉼표로 구분된 값) 파일의 두 파일이 포함됩니다.
  8. 스프레드시트 프로그램으로 .csv 파일을 엽니다. 염색체 및 게놈 위치, 부위 서열, 불일치(Mm) 유형, 불일치 염기의 총 수, 오프 타겟 부위와 관련된 엑손 정보와 같은 정보가 모든 오프 타겟 부위에 대한 파일에 제공됩니다.
  9. 시드 또는 비시드 염기서열에서 <2mm가 있는 부위에 대한 PCR 프라이머를 설계합니다.
  10. 다음 조건을 사용하여 선택된 양성 hiPSC 클론에 대해 PCR을 수행합니다: 98°C에서 2분 동안, 98°C에서 20초 동안 35회, 59°C에서 20초 동안, 72°C에서 1분 동안 72°C에서 5분 동안 최종 연장.
    참고: 여기에 설명된 PCR 매개변수는 당사 실험실에서 테스트한 여러 유전자에 대한 특정 산물을 생성합니다. 그러나 이러한 조건은 사용자가 선택한 관심 유전자에 따라 다릅니다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR은 종종 여분의 밴드가 나타나지 않도록 최적화해야 합니다.
  11. PCR 산물의 염기서열을 분석하고, 염기서열분석 결과를 예측된 염기서열과 정렬하고, 돌연변이를 검색합니다. 돌연변이가 존재하면 off-target 이벤트가 식별됩니다.

6. 신경 계통 리포터를 만들기 위한 hiPSC의 전기천공법

  1. Geltrex 코팅 접시에 TeSR-E8 배지의 배양 hiPSC. 전기천공법 2일 전에 배지를 MEF-CM(Mouse embryonic fibroblasts conditioned medium) 배지로 변경합니다. 2ml의 Accutase에서 5분 동안 배양하고 세포를 수집합니다.
  2. 다음 조건을 사용하여 선형화된 표적화 벡터, Cas9-003 발현 벡터 및 sgRNA 벡터로 hiPSC를 전기포공합니다: 1 x 107 hiPSC, 2.5 μg의 sgRNA, 2.5 μg의 Cas9 및 50 μg의 표적화 벡터를 co-transfection합니다. 이중 nickase 전략의 경우, 50 μg의 표적화 벡터, 각 sgRNA 2.5 μg을 추가합니다(벡터에 의해 동시 발현된 Cas9n 포함).
  3. 설명된 대로 positive 및 negative selection으로 클론을 선택합니다24,25.
  4. Southern Blot Analysis 또는 장거리 게놈 PCR24,25로 양성 클론을 식별합니다.

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결과

상동성 팔(homology arms), 리포터 카세트, 양성 및 음성 선택 카세트를 포함한 모든 필수 구성 요소를 갖춘 타겟팅 벡터를 제작합니다 (그림 1). 내인성 게놈 유전자좌를 기반으로, 여러 개(2~3개)의 sgRNA(Cas9 시스템 사용 시) 또는 sgRNA 쌍(Cas9n 이중 니카제 전략 사용 시)을 설계하여 인간-gRNA-발현 벡터 MLM3636 또는 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) 백본에 삽입하여 제작합니다 (그림 2). hiPSC에 형질전환시키기 전, 293FT 세포에서 T7E1 분석을 통해 sgRNA를 평가합니다 (그림 3). 오프타겟(off-target) 부위를 예측합니다. in silico 과정(단계 5)을 통해 예측된 잠재적 오프타겟 부위가 적고, 절단 효율이 적절한(indel%가 10-30% 사이인) sgRNA를 사용하여 전기천공법으로 hiPSC에 형질전환시...

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토론

유전자 표적화는 유전자 기능을 특성화하는 데 필수적인 도구입니다. 그러나 상대적으로 낮은 효율성으로 인해 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리는 작업이 필요합니다. 최근에는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR 연관) 시스템과 같은 게놈 편집 도구의 개발로 표적화 효율성이 크게 향상되었습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 리포터를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. CRISPR/Cas 시스템 매개 게놈 편집을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만드는 데 필요한 구성 요소를 얻기 위한 단계가 설명되며, Cas9 및 Cas9n 이중 니카제 시스템 모두에 대한 표적 벡터 및 단일 가이드 RNA의 구성에 중점을 둡니다.

CRISPR/Cas9 시스템은 hiPSC의 다양한 유전 공학 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 녹아웃 및 노킨(예...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 신경외과, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, 휴스턴에 있는 University of Texas Health Science Center의 Bentsen Stroke Center 및 Mission Connect TIRR Foundation의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pStart-K애드진20346
pWS-TK6 애드진20350
pKD3 Addgene45604
pKD46대장균 유전자 재고 센터, CGSC7634
PGK-neo-bpA 서열 Addgene13442
표적 유전자의 인간 BAC 클론 
JDS246 (Cas9-003), 포유류 코돈에 최적화된 연쇄상구균 화농성 Cas9-3X 플래그Addgene43861
MLM3636, U6 프로모터를 가진 Human-gRNA-ExpressionVector 추가진43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)추가진42335
sgRNA 설계, ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/
Off 표적 예측 도구 CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA 프라이머 합성시그마
원샷 Top10 Electrocomp E. Coli 유능 세포생명 기술C4040-50
AccuPrime Pfx SupperMix생명 과학 기술12344-040
제한 효소NEB와 Life Technologies
Zymoclean 젤 DNA 회수 키트Zymo ResearechD4007
DNA 빠른 추출 버퍼 진원지QE0905T
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent Technologies600675
Digestion buffer 2New England Biolab
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC MaintenanceStem Cell Technologies05940
UltraPure Agarose Life Technologies16500-100
50xTAELife TechnologiesB49
필수 8 중간 라이프 테크놀로지A1517001
Dulbecco' 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 Life TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 with Glutamax Life Technologies10565018
Glutamax와 D-MEM Life Technologies10566040
Fetal Bovine Serum-ES 세포 인증 Life Technologies10439
Knockout 세럼 교체품 Life Technologies10828010
2-메르캅토에탄올 1000X Life Technologies21985023
비필수 아미노산 생명 기술11140050
Stempro Accutase 라이프 테크놀로지A1110501
디스파스 Life Technologies17105-041
0.25% 트립신- EDTA 솔루션 라이프 테크놀로지25200-056
겔트렉스 라이프 테크놀로지     12760-013
ROCK 억제제 Y-27632Millipore    SCM075
SMC4 시약 BD354357
네오마이신 저항성 MEF MilliporePMEF-NL
하이그로마이신 저항성 MEF MilliporePMEF-HL
G418 (Geneticin)LifeTechnologies11811
Hygromycin B Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil  Moravek 생화학 및 방사성 화학 물질    M251
Electroporator: 유전자 펄서 Xcell Bio-Rad
0.4cm 전기천공법 큐벳 Bio-Rad165-2088
DIG-High prime DNA 라벨링 및 검출 스타터 키트 II Roche11585614910
혼성화 변성 솔루션 VWR82021-478
PCR DIG 프로브 합성 키트 Roche11636090910
DIG 워시 세트 Roche11585762001
Anti-Digoxigenin (DIG-AP)Roche11093274910
CSPD 화학발광 시스템 Roche11755633001
DIG 세척 및 블록 버퍼 세트 Roche11585762001
50X TAE 버퍼 Life Technologies24710030
블로팅 버퍼 (25 mM Tris pH 7.4,  0.15 M NaCl,  0.1% Tween20)
Hoefer Ultraviolet Crosslinker 피셔 사이언티픽03-500-308
스페르미딘 FisherAC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7.5)VWR    200064-506
덴빌 사이언티픽 블루 바이오 필름 8x10 Fishernc9550782
DNA 분자량 마커 II (DIG 라벨링)Roche11218590910
Amersham 블로팅 멤브레인 Hybond-N+ Roche95038-400
Pyrex 유리 건조 트레이 Fisher15-242A
Kimberly-Clark C-fold 종이 타월 Fisher06-666-32B
Whatman 3MM 종이 (26X41)Fisher    05-713-336
혼성화 백 Roche11666649001
혼성화 튜브 Fisher13-247-300
하이브리드화 오븐 로티세리 쉐이크 'n' 스택 피셔HBMSOV14110
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참고문헌

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