형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

Summary

제브라 피쉬는 만성 신장 질환 (CKD)을 모델로 인기있는 도구입니다. 그러나, 작은 크기 것이 불가능 전통적인 방법을 이용하여 신장 기능을 평가한다. 우리는 CKD에 제브라 피쉬의 신장 기능의 정량 분석을 할 수있는 형광 염료 신장 클리어런스 분석 ^{한 설명합니다.}

Abstract

제브라 피쉬 배아 형성기를 공부하고 인간의 유전 질환을 모델로 다루기 쉬운 모델을 제공합니다. 그 단순함에도 불구하고, 제브라 피쉬의 신장 개발 및 인간과 거의 같은 방식으로 작동합니다. 인간 신장의 구성에 큰 차이를 갖는 두 지브라 피쉬 비교 네프론 수백만의 존재이다. 그러나, 기본 기능 단위로 같은 복잡한 시스템을 단순화하면 신장이 개발하고 운영하는 방법에 대한 우리의 이해를 도왔습니다. 제브라 피쉬에서 사구체에있는 중간 선은 배설강에서 서로 융합하기 전에 배아 축 아래로 양측 실행 분기 두 pronephric 세관에 초기 혈액 여과를 담당합니다. pronephric 세관은 크게 마지막으로 배설강 ^2-4로 종료하기 전에 다양한 용질의 교환을 허용, 분할 가느 다란 관을 따라 여과 액의 이동을 용이하게 운동성 섬모에 의해 채워집니다. CKD, INC에 대한 책임을 많은 유전자ciliogenesis에 관련된 사람들을 luding, 제브라 피쉬 ^(5)에서 연구되고있다. 그러나, 주요 연신 다시 유전자 조작 후에 지브라 피쉬 신장 기능 평가에있어서의 어려움이 있었다. 인간은 주로 자신의 수중 환경과 작은 크기로, 제브라 피쉬의 비 번역을 입증 한 전통적인 분석은 신장 기능 장애를 측정합니다. 예를 들어, 배아 및 우레아 크레아티닌 함량의 분석을 위해 준비된으로부터 물고기가 너무 작을 경우, 혈액을 추출하기 위해 물리적으로 불가능하다. 또한, 제브라 피쉬는 종종 초기 환자 시험 중에 수행되는 간단한 단백뇨 '봉'에서 테스트에 대한 충분한 소변을 생산하지 않습니다. 우리는 신기능 ^1,6-9에서 판독을주고, 혈관계로부터 밖으로 신장을 통해 정량적으로 시간이 지남에 따라 형광 염료의 간극을 모니터링 지브라 피쉬의 광학적 투명성을 이용하여 형광 분석법을 설명한다.

Introduction

인간의 신장은 혈액에서 신진 대사 폐기물을 필터링 및 세포의 항상성을 유지하는 데 필요한 용질을 복구하는 데 중요한 역할을한다. 신장 기능 장애를 일으킬 인간 유전 질환들이있다. 가장 흔한 유전 신장 질환은 신장의 세뇨관 내에 채워진 유체 주머니의 발달을 특징으로 염색체 우성 다낭성 신장 질환 (ADPKD)이고; cystogenesis에 의한 피해는 신장 기능 ^(10)에 해로운 것입니다. 800-1 : ADPKD 1의 발생을 갖고 1000 8 차지하고 - 말기 신부전 (ESRF) ¹¹ 명 중 10 %. 여러 유전자는 약 85 % 각각 ^{12, 13의} 경우 15 %를 차지, polycystin-1 (PKD1) -2 (PKD2)를 포함 ADPKD 원인이 연루되어있다. 또한, 유전자 PKD1을위한 제품과 -2는 섬모에 지역화 및 ciliogenesis ^{(14, 15)의} 기초입니다. 로 알려진 인간의 유전 질환의 인식 가족은 지금이섬모 기능에 영향을 CKD ^(16)이 발생할 ciliopathies.

섬모 개발 및 기능에 영향을 미치는 인간의 유전 질환의 증가는 한번 고려 흔적 세포 기관의 글로벌 관심을 끌고있다. 섬모, 머리와 같은 세포 돌기, 수용체....

Protocol

윤리 문 : 동물 관리, 축산 및 절차는 동물 (과학적 절차) 법 1986 모든 동물 실험은 생물을 준수 내무 장관 (PIL 번호 7천8백92분의 70)에 의해 부여 된 라이센스에 따라 수행 된에 ​​의해 정의 및 제어 서비스 관리 그룹 및 생물학적 서비스 윤리위원회, SGUL, 런던, 영국. 모든 노력은 사용되는 동물의 수를 감소시키고 복지 고통을 최소화하고 강화하기 위하여 두 절차 및 사육을 구체화 하였다.

1. 악기, 마취의 준비, 형광 염료

1. 마이크로 피펫 풀러와 (필라멘트없이) 붕규산 표준 벽의 모세 혈관에 미세 주입 (그림 1A)에 적합한 길이의 바늘을 끌어 사용.
2. 심낭 (그림 1B)에 쉽게 주입 배아의 방향에 대한 아가로 오스 금형을 확인합니다. 접착제 약 10 유리 현미경 SL함께 십오 오프셋 슬라이드 '계단'을 형성한다. 최상의 결과를 위해, 각 슬라이드의 중심에 신속한 세트 에폭시 수지 접착제의 드롭을 사용한다.
3. 제거, 분젠 버너 가열 메스를 사용하여 두 개의 10 ml의 플라스틱 피펫을 통해 길이의 중간에 약 78mm의 일부를 잘라 피펫은 적절하게 끝납니다. 부착하고 적층 유리 슬라이드에 접착....

Results

전 세계적으로 ¹⁶ 16만명 : Bardet-Biedl 증후군 (BBS)는 약 1에 영향을 미치는 희귀 이종 ciliopathy입니다. 다낭성 신장을 포함하여 관련된 문제의 번호와 현재의 환자는, 이후 환자는 자주 신장 투석 또는 이식 ^(24)를 필요로한다. ESRF CKD ^16은 현상 환자의 약 30 %로, BBS에서 사망의 가장 흔한 원인이다. 현재, 20 비 관련 유전자는 게시 된 유전자형 - 표현형 협회 BBS에 연루되어있다. BBS 단백질은 환자의 특성 특성과 함께, ciliopathy 진단을 추론, 섬모와 기초 단체 내에서 일반적인 단백질 현지화 도메인을 공유 할 수 있습니다. BBS9 함께 다른 BBS와 (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) 단백질이 주 섬모 ^(24)의 형성에 BBSome 복잡한 책임의 핵심을 형성 Parathyoid 호르몬 응답 B1 (PTHB1) 단백질을 암호화한다. BBS (c)의 6 %.......

Discussion

Zebrafish의 인간의 유전 질환을 모델링하는 유용한 도구를 제공하고, 생체 내 연구를위한 과학적인 도구로서 자신의 사용은 신장을 포함한 많은 생물학적 시스템의 유전자 분석의 상세한 연구를 활성화. 대부분은 지금 제브라 피쉬 신장 개발 및 기능을하는 방법에 대해 알 수있다. 인간의 nephrogenesis과 질병의 원인 유전자 ^(21)와 동성에 눈에 띄는 유사점 이해하는 기초가 얼마나 제브라 피쉬의 도시가 얼마나 신장 질환의 병리에 유전자 기능 리드의 결함. 사실, 유전자 조작 여유롭게 안티센스 모르 폴리 노 녹다운 기술 또는 TALENS 또는 CRISPR 같은 고급 대상으로 게놈 편집 도구를 사용하여 제브라 피쉬에 달성 될 수있다. 의심 신장 질환의 원인 유전자 최저의 또는 돌연변이 모델을 만들기 질병 발현에서의 참여를 이해하는 첫 번째 단계입니다. 신장 기능에 대한 신뢰성 분석 받고자 이렇게하려면후보 유전자가 환자에서 관찰되는 병리에 대한 가능성이 책임이 있는지 여부를 나타냅니다. <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown 타입 마이크로피펫 풀러	Intracel	P-97
보로실리케이트 표준 벽 모세관	Harvard Apparatus	30-0017
유리 현미경 슬라이드	VWR International	631-0109
에폭시 수지 접착제	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW 라벨 Dextran	Life technologies	D-1824
N-페닐티오우레아	시그마-알드리치	P7629
메틸렌 블루	Sigma-Aldrich	M9140
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염	Sigma-Aldrich	A5040
메틸셀룰로오스	Sigma-Aldrich	M0512
공기 압축기	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	파커 인스트루먼트	051-0500-900
컴팩트 3축 제어 마이크로매니퓰레이터	마르자우저	MM33
실체 현미경	Nikon	SMZ1000
마이크로로더 팁	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 펜치 해부	Sigma-Aldrich	F6521
스테이지 마이크로미터	Pyser- SGI	02A00404