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방법 논문

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52542

⸱

2015년 3월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Bioengineering, Clemson University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 배양된 HL-1 심방 세포 단층에서 이중 채널 광학 매핑을 수행하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 고유한 프로토콜을 사용하면 배양 단층의 전기생리학적 특성을 자세히 감지하고 분석하기 위해 동일한 영역에서 칼슘(Ca) 및 전압(Vm) 활성을 동시에 시각화할 수 있습니다.

초록

광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.

서론

고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다.

배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다.

이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.

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프로토콜

1. 솔루션 준비

  1. 노르 에피네프린 (NP) 솔루션
    1. . 정제 밀리-Q (MQ) 물 25 ㎖에 30 mM의 아스코르브 산 (0.1475 g의 아스코르브 산 25 ml의에 순이익 40 mg을 녹이고 노르 에피네프린 (NP)은 민감한 빛 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오.
    2. 0.22 μm의 주사기 필터 NP 용액 필터. -20 ° C에서 1 ml의 멸균 마이크로 튜브에 솔루션 및 저장 나누어지는. 냉동 후에, NP는 한 달 동안 안정하다.
  2. 보충 세척 및 최종 Claycomb 미디어
    1. Claycomb 매체 43.5 ㎖로 시작하여 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖, 페니실린 / 스트렙토 마이신을 0.5 ㎖, NP 0.5 ㎖의 1로 보충 : 최종 보충 Claycomb 배지 50 mL로 L 글루타민 희석 100. Claycomb 매체가 빛에 민감하기 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오.
    2. 한모금과 동일한 조리법을 사용하여 세척 Claycomb 매체를 준비제외 대상으로 실시 Claycomb 매체는 5 % FBS를 추가하고 NP 및 L 글루타민 요소를 생략.
      참고 : 직사광선에 노출하지 않고 4 ℃에서 저장 될 때 보충 최종 워시 Claycomb 미디어는 2 주 동안 좋다.
  3. 콩 트립신 억제 솔루션
    1. 칼슘 - 무료 및 마그네슘이없는 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎖ (PBS)로 대두 트립신 억제제의 25 mg을 녹인다.
    2. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터.
      참고 : 4 ° C에서 저장 될 때 멸균 솔루션은 1 개월 안정적이다.
  4. 젤라틴 / 피브로넥틴 요리 코팅 용액
    1. 0.02 % 젤라틴 있도록 MQ 물 500 ㎖ 중에 젤라틴 0.1 g을 녹이고.
    2. 오토 클레이브 후, 0.02 % 젤라틴 199 ㎖ 중에 1 ml의 피브로넥틴을 희석하고 부드럽게 혼합한다.
    3. 나누어지는 -20 ° C에서 젤라틴 별도의 튜브에 솔루션 및 저장의 6 ml의.
  5. 행크스 '소금 솔루션
    1. 파문을 사용하여판은, 염화나트륨 (136.9)의 KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0.4409)의 NaH 2 PO 4 (0.4000), 황산 (0.8142), D-Glc를을 MQ 물 (밀리몰 / L)에 다음과 같은 염을 용해 (5.051)의 NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), 염화칼슘 2 (1.261).
  6. 칼슘에 민감한 염료 (Rhod2) 솔루션
    1. Rhod2는 -20 ° C에서 원액 저장을 염색 할 DMSO 20 % 플루로 닉 F-127의 400 μL에 Rhod2 건조 분말 1 mg을 희석.
    2. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 1000 행크스 '소금 용액이 원액 1을 희석.
  7. 전압에 민감한 염료 (Rh237) 솔루션
    1. -20 ° C에서 원액 및 저장을 할 DMSO 2 ㎖로 Rh237 5 ㎎을 희석. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 용액을 만들기 위해 1000 행크스 식염수 : 원액 1 희석.

& #(160); 참고 : 1-4 솔루션은 약간의 수정과 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜을 기반으로합니다.

2.과 Passaging 및 배양 HL-1 심방 근육 세포 Coverslips는 상

참고 : HL-1 세포 박사 Claycomb (루이지애나 주립 대학)에서 얻을 수 있습니다.

  1. T25 플라스크에 HL-1 세포 성장과 매일 보충 Claycomb 중간의 5 ml로 공급. 통로는 T25에서 세포 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜 (후술) (10)에있어서 5 일마다 형틀.
  2. 24 시간 T25 플라스크에서 세포 전에 12-well 배양 판에 장소 라운드 된 커버 (20mm 직경) 계대 배양 한 다음 37 ℃에서 하룻밤 젤라틴 / 피브로넥틴로 된 커버를 커버 할 완전히 합류와 준비가되어 있습니다.
  3. 다음 날, 기음과 문화 판에서 젤라틴 / 피브로넥틴을 취소하고 잘 각각 보충 최종 Claycomb 매체의 1.5 ml로 교체합니다.
  4. T25의이 배양에서 분할 세포대기음이 합류 문화를 포함하는 T25 플라스크 매체는 37 ° C에서 PBS 짧게 문화를 씻어 하루 5에서 전체 합류에 도달 한 후 전자 플라스크.
  5. PBS 및 기음 셀과 직접 접촉을 피하기 위해 T25 플라스크의 바닥에 트립신 / EDTA를 피펫 팅하여 37 ° C에서 3 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가한다. 1 분 동안 37 ° C에서 품어.
  6. 흡인에 의해 트립신 / EDTA를 제거하고 T25 플라스크 당 다른 트립신의 1.3 ㎖ / EDTA를 추가합니다. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 현미경으로 검사하고 세포가 여전히 플라스크에 부착하는 경우, 완전히 남아있는 세포를 이동시키다 누릅니다.
  7. 15 ㎖의 원심 분리 관으로 플라스크에서 세포와 세포를 전송에 대두 트립신 억제제의 1.3 ML을 추가합니다. 워시 Claycomb 매체의 5 mL를 빈 플라스크를 씻어. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포에 린스를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기.
  8. 조심스럽게 뜨는을 기음과 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 다시 중단보충 최종 Claycomb 배지 6 ㎖ 중의.
  9. 세포 계대의 세포 현탁액 0.5 ml로 12- 웰 플레이트의 각 웰을 시드. 매일 신선한 보충 최종 Claycomb 매체와 세포를 공급.
    주 : 밀접 세포의 성장을 모니터링 전형적 세포 단층을 4 일째에 합류 상태에 도달하고 자발적인 활동이 계속 표시. 이후, 배양 된 단층은 하루 4-5 광학 매핑을위한 준비가 될 것입니다.

셀 3.로드 칼슘 및 전압에 민감한 염료

  1. 광학적 맵핑 연구 부드럽게 12 웰 세포 배양 플레이트로부터 커버 슬립을 제거하고 행크스 식염수로 세정.
  2. 칼슘 민감성 염료 Rhod2으로 세포를 염색하기 위해, 3 ㎖와 커버 슬립에서 세포 단층을 부화 산소를 30 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 Rhod2 작업 용액 (5 % CO 2 / 95 % O 2 가스로 버블 링) .
  3. V m에 민감한 염료와 세포를 얼룩Rh237는 또 다른 15 분 동안 수조에서 37 ° C에서 산소화 Rh237 작업 용액 3 ㎖에 Rhod2로드 셀 단층 몰입.

4. 듀얼 채널 광학 매핑

  1. 거꾸로 형광 현미경에 순환 챔버로, V의 m과 칼슘 염료로 두 번 스테인드 세포 단층을 놓습니다. 35 ± 1 ℃에서 셀 챔버의 온도를 유지하기 위해 가열 된 순환 시스템을 사용한다. 챔버에 걸쳐 조심스럽게 0.3 ° C의 구배를 방지하기 위해 상기 챔버를 통해 순환하는 흐름의 속도를 조절하여 관류 액의 온도를 제어한다.
    1. V의 m / CA 신호를 기록하기 전에, 이전의 염색 공정에서 잔존 염료를 제거하기 위해 약 5 분 동안 신선한 행크스 용액으로 세포 단층을 세척한다.
  2. 행크스 염 용액과 SILV 가득 유리 피펫으로 이루어지는 쌍극 전극을 이용하여 페이스 건강한 세포 단층어 이전으로 피펫 팁 주위 코일 와이어 12,17 설명했다.
  3. 약 1 MV를 서성 거려 임계 값을 기대 2 밀리의 200 ~ 500 밀리 초 펄스 폭의 사이클 길이의 페이스 건강한 세포 단일 층.
    주 : 단층 배양의 각 배치에 대해 적어도 2 개의 비 처리 된 단층은 셀 배치의 조건을 검사하는 데 사용되어야한다. 건강한 제어 단일 층은 200 ~ 500 밀리의주기 길이에 전기 페이싱에 의해 포착 할 수 있어야합니다. 제어 단층 전기적으로 진행되어야하지 않으면,이 셀 전체 일괄 광학적 맵핑 실험에 적합하지 않을 수 있다는 것을 시사한다.
  4. V의 m 및 CA 민감한 염료 모두를 여기 시키는데, 여기 필터 (파장 510 ㎚ / 40) 및 다이크로 익 미러 (561 ㎚)과 결합 된 LED 광원 (520 nm 파장)를 사용한다.
    1. V m을 구성 요소로 다이크로 익 미러 (594 ㎚)과 칼슘 성분과 40X 목표 및 분할을 통해 세포에 의해 방출되는 형광 신호를 수집합니다.대역 통과 필터와 칼슘 채널에서 긴 통과 필터 (700 ㎚) 및 출사 광 V의 m 채널에서 방출 된 광을 필터 (40분의 585 ㎚).
    2. 두 개의 CCD 카메라 (; RedShirt 이미지 80 X 80 픽셀, 1000 FPS)를 사용하여 필터링 된 형광 빛을 수집합니다.
    3. 염료 광표백을 방지하기 위해, 노광 시간을 제한하기 위해 각 시야마다에 2 초 미만에 대한 기록을 만든다. 여기에, 일반적으로 이미지를 각각의 단층에 대 한 4 개의 서로 다른 영역.

V m 또는 칼슘 녹음 5. 데이터 처리

  1. 모두 V의 m 및 CA 신호 (80 X 80 픽셀)의 경우, 배경 잡음을 줄이기 위해 다른 기록 시점에서 1 휘도 값으로 강도 스물 다섯 (5 × 5)의 값이 인접한 화소의 평균.
    주 : 데이터를 평균화 한 후, 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 각 기록 시점 평균화 × 16 16 강도 값들을 평균화 포함하는 데이터 매트릭스 (수득50 ㎛의 공간 해상도와 데이터 채널).
  2. V m의 기록 또는 CA 신호의 활성화 시간 (AT)를 정의.
    1. 전술 한 바와 같이 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 활성화 시간 (AT)를 정의하기 위해, V의 m 또는 주문품 MATLAB 기반 알고리즘을 사용하여 칼슘 신호의 피크 진폭의 50 %의 시간을 결정한다. (12)
    2. 수동으로 프로그램 분석 중 발생할 수있는 오류를 제거하기 위해 분석의 AT를 교정.
    3. 행렬에서 정의 저장소 사용되는 소프트웨어에 각각 기록 된 활동 전위 칼슘 과도의 (16 × 16 데이터 채널 평균).
  3. 이전에 약간의 수정과 함께 설명 된 바와 같이 12, 18, ​​20, 22 필드 벡터 분석 방법을 사용하여 AT 행렬에 활동 전위 또는 칼슘 과도 전도 속도 (CV) 벡터를 계산한다.
    1. (5 × 데이터를 그 지점에서 주변에 데이터 채널의 상대적인 CV 벡터를 계산; 도 5는 이웃 MATLAB 프로그램 (12, 18) 내에서 최소 제곱 알고리즘을 이용하여) 표면 AT 활성화 시간 (다항식의 매끄러운 표면을 시뮬레이션하기 위해) 데이터 채널을 평균화.
    2. 아래의 수식을 사용하여 전도 벡터를 계산
      포뮬러 1 :
      figure-protocol-1
      화학식 2 :
      θ θ를 (DY / dT를) / (DX / dT를)]
      주 : Ve로는 X 축 및 Y 축에 투영 CV 벡터이고; DX / dT를는 X 축에 CV 벡터의 투영이고; DY / dT를는 Y 축에 CV 벡터의 투영이다. T는 AT면이고; X, Y 좌표의 2-D 참조; X = T ∂T / ∂x는 X에 대해 T의 편미분이고; T의 Y = ∂T / ∂y는 Y에 대하여 T의 편미분이고; CV θ는 벡터의 최종 방향이다.
    3. 나침반에 10도 섹터를 커버 각각 36 경로,에 AT 행렬의 그룹 모든 벡터.
    4. (36) 전도 경로 중 CV 벡터의 최대의 인구를 포함하는 경로를 선택합니다. 단일 층의 CV를 나타 내기 위해이 경로의 평균 CV를 계산합니다.

웨이브 프론트 전파 6. 시각화

  1. MATLAB 소프트웨어를 사용하여 피크 값에 대해 상이한 기록 된 시점에서 각각의 활동 전위 또는 CA 과도의 신호 강도를 정규화한다.
  2. 일시적 사용 MATLAB 소프트웨어의 16 × 16 매트릭스의 강도에 기록 된 모든 시점의 정규화 된 강도 데이터를 저장한다.
  3. surf.m 기능을 사용하여 각 기록 시점의 저장 강도 매트릭스에서 색상 코딩 된 강도 맵을 구축합니다.
    참고 : 강도지도에서 빨간색 V m 또는 칼슘 신호의 높은 강도를 나타내며, 파란색 형광 신호의 낮은 강도를 반영한다.
  4. avifile.m 기능을 사용하여 .avi 파일을 만듭니다.
  5. 모든 I 절감addframe.m 함수를 사용하여 활동 전위 또는 CA 과도 상이한 기록 시점에서지도 ntensity.
    주 :이 시점에서, V의 m 및 CA 전파 개의 분리 AVI 파일이 생성 될 것이다.

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결과

영화 1에서 입증 된 바와 같이 배양 합류 단층는 일반 고유 리듬을 나타낸다. 우리는 다음 완전히 합류 HL-1 단층에서 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑을 수행 하였다. 그림 1a는 기록 하나에서 V의 m과 칼슘 신호의 예 흔적을 보여줍니다 이길. 균일하게 전파 V의 m 및 듀얼 채널 광 매핑 시스템을 이용하여 칼슘 신호의 대표적인 등시성지도는도 1b 및도 1c에 도시되어있다. 균일 활동 전위 전파 및 CA 과도의 대표적인 이미지는 연대순 동일한 HL-1 단층 배양에서 얻었다. 마지막으로, 영화 2와 3은 HL-1 융합 단층에 균일하게 전파 활동 전위 (영화 2) 칼슘 과도 (동영상 3)의 애니메이션 예를 제공합니다.

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토론

이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다.

성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균일하게 세포를 분산해야합니다. 이 가장 전기 페이싱에 응답으로 항상 완벽하게 성장하고 완전하게 융합 세포 단일 층을 매핑합니다. 이는 염료를로드하는 동안 산소 세포를 유지하는 것도 중요하지만, 산소 버블이 죽이거나 커버 슬립에서 그들을시키다 수 있으므로 셀과 직접 접촉해서는 안된다. 염료 concentrati을 증가시키면서, 염료 농도를 낮추고 신호 크기를 감소시키고 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 것이다 광 강도를 감소온 신호 크기를 증가시킬뿐만 아니라, 소음을 증가 광 강도를 강화. 이 때문에, 형...

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다.

이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 & 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연​​구 개발 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Rhod2 건조 분말AAT Bioquest21062
pluronicAAT Bioquest20050
DMSOSigma276855
Rh237InvitrogenS-1109
NaClSigmaS7653
KClSigmaP3911
KH2PO4SigmaP0662
NaH2PO4SigmaS9638
MgSO4SigmaM7506
D-GlucoseSigmaG8270
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
HEPEs시그마H3375

참고문헌

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