골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.
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방법 논문
조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용
이 논문에서
요약
초록
초점 현미경은 골수 같은 복잡한 조직 내에서 여러 종류의 세포 편재 분석위한 선택 방법이다. 많은 경우에 따라서 레이터 의존적 바이어스를 도입하고 자간 신뢰성을 감소의 위험을 담지 수동 계산에 의존하지만, 셀룰러 편재 및 정량 분석이 어렵다. 세포 유형은 그 발생 빈도의 차이가 특히 강하게 또한, 임의 위치로부터의 결과 두 셀 간의 공동 지역화 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 여기서, 골수 세포 공동 편재 편견 정량 방법이 도입된다. 프로토콜은 골수를 포함한 전체 뮤린 긴 뼈의 조직 학적 섹션을 획득하기 위해 사용되는 샘플 제조뿐만 아니라, 염색 프로토콜과 고해상도 화상의 취득을 설명한다. 조혈 및 비 hemat의 인식에서 스패닝 분석 워크 플로우이들 셀 사이의 직접적인 접촉의 정량화 2 차원 (2D) 골수에서 이미지 opoietic 세포 유형이 제공된다. 이것은 또한 특정 세포 유형을 둘러싸 세포 미세 환경에 대한 정보를 얻기 위해, 이웃 분석을 포함한다. 두 종류의 세포 공동 지역화 랜덤 셀 위치의 단순한 결과 또는 셀 간의 우선 연결을 적용할지 여부를 평가하기 위해, 조혈뿐만 아니라 간질 세포의 경우,이 가설을 시험하기에 적합하다 시뮬레이션 도구이며, 사용. 이 방법은 골수에 한정되지 않으며, 조직 학적 데이터의 재현성, 정량 분석을 허용하기 위해 다른 조직으로 확장 될 수있다.
서론
인해 광학 현미경 이미지 등을 포함한 최근의 급속한 기술 발전에, 조직 전체의 문맥 내에서 세포의 분석은 면역학 점점 접근되고있다. 서스펜션에서 단일 세포의 특성은 세포 및 분자 기능을 이해하는 귀중한 불가결 방법을 나타냅니다. 그러나, 그들의 (마이크로) -anatomical 환경 내 세포의 분석은 면역 반응의 개발과 같은 복잡한 공정에서 공동 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 필수적이다.
현미경 학자, 이미지의 정 성적 정보를 획득하는 것이 상대적으로 용이하지만, 그것은 부분적으로는이 분야의 분석 방법은 화상 획득 가능한 것과 비교 뒤쳐져 있다는 사실, 이들 데이터를 정량화 할 과제로 남아. 많은 연구자들은 여전히 시간 소모적 그들의 조직학 이미지에서 수동 세포 카운팅에 의존따라서 다른 평가자 사이에 바이어스를 도입하고 다른 그룹에 의해 복제를 방해. 때때로, 하나의 대표 이미지는 하드 독자가 이러한 경우의 통계적 관련성을 판단 할 만들기, 책에서 휴대 전화 위치 또는 공동 현지화에 문을 강조하기 위해 선택된다.
함께 화상 데이터의 전체 정보 콘텐츠가 거의 이용되지 않는다는 사실과, 이는 더 빠르고 편견 광범위한 조직 학적 방법이 이미지를 분석 할 필요성을 강조한다.....
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프로토콜
동물 실험은 동물 복지 (Landesamt에 대 한 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0194 / 11)에 따라 수행되었다.
형광 골수 키메라 마우스의 1 세대
주 : 9 전에 설명한 바와 같이 골수 간질 세포를 시각화하기 위해 형광 골수 키메라 마우스의 생성이 행해진 다.
- 델-Cre 호텔이 조사를 위해 준비하기 (탠덤 적색 형광 단백질 (tdRFP) 도처 11-13을 표현 마우스) ROSA-tdRFP 마우스를 X 치료를 시작합니다. 또한, 형광 단백질의 유비쿼터스 식으로 다른 변형을 사용합니다. 이일 조사 전에 마시는 물을 통해 네오 마이신의 1 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / 비타민 ml의를 (A, D3, E, C) 관리합니다.
- 세슘 137 감마선 조사 장치 위스콘신 3.8 회색으로 두 번 쥐를 조사3 시간의 간격 얇은. 이를 위해, 각각의 조사 장치에 적합한 조사 파이 케이지에 마우스를 놓습니다.
참고 : 마우스의 조사의 경우, 우리 연구소는 마취가 필요하지 않습니다. 조사를위한 마취에 대한 지역 기관 정책을 따릅니다....
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결과
카와 모토 테이프 방법 undecalcified 뼈의 저온부를 절단 골간뿐만 아니라 함께 골단 영역 모두에서 전체 뼈 여전히 광물 뼈에 부착 내막 영역의 골수, 손상 부분으로 절단되도록 그들의 소주 골의 고밀도 (도 1). 섹션들의 핵 염색 제조에 작은 균열이 완전히 회피 될 수 없지만, 동맥 정현파의 구조뿐만 아니라, 실질의 망상 네트워크를 그대로 유지하는 것이 알 수있다.
적색 형광 키메라 골수의 면역 형광 염색의 예와 그 이후의 분석으로, 호산구에 대한 염색 (주요 기본 단백질, MBP)와 PC (κ와 λ 경쇄)와 B 세포 (B220)가 표시됩니다. 마우스는 명반 IP 닭 γ 글로불린 (NP-CGG)에 결합 된 100 μg의 4- 히드 록시 -3- 니트로 페닐 합텐 4 주 후에 면역화 된재구성 21 일 후 PBS 정맥에서 NP-CGG의 50 μg의 접종 및 부스트 후 30 일째에 분석했다. 자동화 된 이미지 분석은 또한 망상 프로세스 매우 .......
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토론
현대 광학 묘화 법의 진보에도 불구하고, 데이터의 조직 학적 분석은 여전히 종종 적절한 정량 도구와 방법의 부족 또는 관심사 작은 영역에 집중 편향된 분석에 의해 방해된다. 여기에 제시된 시너지 효과는 이미지 전체 골수 영역을 커버 분석, 자동 분할 및 다양한 조혈 및 간질 세포 유형, 공동 현지화 분석의 물체 인식, 새로운 관례가 제공하는 비 무작위로 발생하는 접점의 마지막 유효성 검사 도구를 결합 설계 시뮬레이션 소프트웨어.
골수를 포함하는 전체 뼈의 조직 학적으로 인해 하나의 섹션에 존재하는 다양한 조직 밀도에 수행 할 어려웠다 - 한 손으로 열심히, 광물 뼈에 쉽게 절단 중단되는 반면 충격에 골수에 함께 뼈. 대안, 뼈 부분 대가 절단 테이프 방법으로서ented 여기 14,15는 그대로하여 (도 1) 엔도 영역을 떠나, 조직 안정화 이점을 갖는다. 조골 세포에서 풍부한되고 게다가, 이러한 분야는 줄기 세포의 유지 <.......
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공개 사항
Juan Escribano Navarro는 독일 뮌헨에 있는 Wimasis GmbH와 제휴하고 있습니다. 다른 저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 가치있는 토론 안드레아스 Radbruch 감사합니다. 우리는 우수한 기술 지원을 동물 관리 및 로버트 귄터에 대한 지원은 Gruczek, 패트릭 Thiemann와 마뉴 엘라 Ohde을 사빈에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 원고의 교정에 대한 조직 학적 샘플의 평가와 랜디 린드 퀴 스트에 대한 우리의 훈련 된 평가자 로라 Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, 카트린 로스, 피렌체 Pache와 카타리나 혼 감사합니다. 우리는 MBP-특이 항체에 대한 J. 및 N. 리, 메이요 클리닉, 스코 츠 데일, 애리조나, 미국 감사합니다.
이 작품은 생체 내에 현미경 지미-DFG의 핵심 시설 네트워크 연구비에 의해 DFG HA5354 / 4-1에 의해 지원되었다 TRR130 / TP17 및 DFG는 AEHSZ에 2165 (HA5354 / 6-1) 국제 막스 플랑크에 의해 지원되었다 감염증 및 면역학 (IMPRS-IDI), 베를린 (Berlin) 학교.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 네오마이신 |  Sigma | N6386 SIGMA | 네오마이신 트리설페이트 염수화물, EU 위험물질 분류코드: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml에는 다음이 포함됨: 50,000 I.E. 레티닐 팔미테이트, 5,000 I.E. 콜레칼시페롤, 30 mg 토코페릴 아세테이트, 100 mg 아스코르브산, 1 mg 소브산, 200 mg 폴리옥실 35 카스터 오일, 0.5 mg 프로필 갈레이트 | |
| 트랜스퍼 버퍼 (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml 페니실린/스테프토마이신) | Sigma | P4333, H3375 | |
| 닭 감마 글로불린에 결합된 4-하이드록시-3-니트로페닐아세틸 헴텐 | |||
| 닭 감마 글로불린 (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | |
| 20% 파라포르말데히드 용액 (EM 등급) | Science Services | 15713 | EU 위험물질 분류코드: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-자당 | Carl Roth | 4621.1 | |
| 드라이아이스 | |||
| 아세톤 | Sigma-Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU 위험물질 분류코드: GHS02, GHS07 |
| 헥세인 | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU 위험물질 분류코드: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek 크라이오몰드 (표준) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | |
| 카와모토의 SCEM 매립 매체 | Section-Lab, JP | ||
| 카와모토의 크라이오섹션 제작 키트 | Section-Lab, JP | ||
| 카와모토의 크라이오플림 타입 2C(9) | Section-Lab, JP | ||
| 마이크로톰 블레이드 MX35 프리미어 플러스, 로우 프로파일 | Thermo Scientific | 3052835 | L × W: 80 × 8 mm (31.5 × 3.13인치), 두께: 0.25 mm (0.01인치) |
| 다클론 항-RFP 토끼 항체, 바이오틴화 | Rockland | 600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 스트렙타비딘 | Life Technologies | S-32355 | |
| 쥐 항-MBP | J. and N. Lee | 미국 애리조나주 스코츠데일에 위치한 메이요 클리닉의 J. and N. Lee로부터 제공 가능, 클론 MT-14.7 | |
| 염소 항-쥐-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | |
| 쥐 항-B220 - Alexa Fluor 594 | 내부에서 제조 및 결합 (DRFZ), 클론 RA3.6B2, Alexa Fluor 594은 Life Technologies 제품 | ||
| 쥐 항-l1 경쇄 -FITC | 내부에서 제조 및 결합 (DRFZ), 클론 LS136 | ||
| 쥐 항-k 경쇄 - FITC | 내부에서 제조 및 결합 (DRFZ), 클론 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-다이아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드) | Sigma | D9542 SIGMA | |
| 형광 마운팅 매체 | DAKO | S3023 | |
| 커버 슬립 (24 × 24 × 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | |
| 수퍼프로스트 슬라이드 유리 (75 × 25 mm) | VWR | 48311-703 | |
| 레이저 스캐닝 공초점 현미경 | 405, 488, 561, 594, 633 nm 레이저 라인과 20X/0.8 NA 공기 대물렌즈를 장착함. 우리는 Zeiss LSM710 및 Zen 2010 버전 6.0 소프트웨어를 사용함. | ||
| 골수용 자동 이미지 분석 도구 | Wimasis, 뮌헨 | 세포 접촉 도구 및 세포 인접 도구는 요청 시 Wimasis에서 제공 가능함. | |
| VC2012 런타임 | Microsoft | 무료 다운로드 | |
| 무작위 세포 배치 시뮬레이션 도구 | 요청 시 제공 가능 | ||
| 이미지 분할 기능이 있는 이미지 분석 소프트웨어 | 골수의 조혈 세포 유형의 세포 크기 분포 측정을 위해 Volocity (Perkin Elmer)를 사용함 (그림 5). 대안으로는 Definiens Image Analysis (Definiens) 또는 Cell Profiler (무료 다운로드)가 있음. | ||
| Fiji 이미지 분석 소프트웨어 | 무료 다운로드. 훈련된 평가자가 수동 세포 계수를 위해 Fiji를 사용함 (그림 3). |
참고문헌
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2....
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재인쇄 및 허가
