자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

요약

기아 패드(중앙 공동이 있는 현미경 슬라이드에서 아가로스와 수돗물의 혼합물)를 사용하여 Penicillium chrysagenum의 자가포식을 연구하는 편리하고 강력한 방법이 여기에 제시

되어 있습니다.

초록

세포 품질 관리 시스템에 대한 연구는 현대 연구에서 매우 역동적이고 관련성이 높은 분야로 부상했습니다. 세포가 핵산, 지질 및 단백질과 같은 생물학적으로 관련된 분자의 손상에 대한 여러 방어선을 가지고 있다는 것이 분명해졌습니다. 소기관 역학(융합/분열/운동성/유전)과 엄격하게 제어된 단백질 분해 효소 활성 외에도 자가포식(세포 '자가 먹기')에 의한 잉여, 손상 또는 손상된 소기관의 분해는 과학계에서 많은 관심을 받고 있습니다. 자가포식의 조절은 매우 복잡하며 유전적 및 환경적 요인에 따라 달라지며, 그 중 많은 부분이 지금까지 규명되지 않았습니다. 여기에서는 사상균 Penicillium chrysogenum의 자가포식을 편리하게 연구할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이는 재현 가능한 방식으로 자가포식을 자극하기 위해 소위 '굶주림 패드(starvation pads)'에서 곰팡이의 성장을 기반으로 합니다. 샘플은 현미경으로 직접 분석하고 자가포식 유도/진행을 평가합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 P. chrysogenum에 사용하도록 제한되지 않으며 다른 사상균에 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

서론

사상균은 발달 과정의 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 싼 재배, 자손 유전 적 접근성의 높은 번호와 같은 몇 가지 실험적인 혜택을 제공합니다. 마지막 포인트는 다양한 세포 메커니즘에 대한 이제까지의지지 않은 유전자의 중요성을 조사 허용 형질 전환 체의 건설을위한 특별한 관련이있다. 사상 균류는 잉여 및 / 또는 장애 세포 구성 요소의 제거를 위해 미토콘드리아 무결성과 자식 작용을 유지하고 유지하기위한 몇 가지 요소와 비정상적인 단백질, 미토콘드리아 역학의 분해 단백질 분해 효소 활동 등 셀룰러 품질 관리 경로의 메커니즘의 해명을위한 수단이되었습니다 기아 ^1,2,3 번에서 세포 생존 능력.

사상 균류 ² 자식 작용의 연구에 사용할 수있는 여러 가지 실험 기법이있다 : 공포의 (ⅰ) 조사 전프로테아제는 투과 전자 현미경 ^(4)에 의해 억제 될 때 F 이들은 치밀 포식 체를 포함하는, (II)의 형광 염료 monodansyl의 카다를 이용하여 형광 현미경 ^5,6- 산성화 autophagosomal 구조 (III) 검출을 통해 GFP-Atg8 병소 모니터링함으로써 autophagosomes 가시화 ^7.

프로토콜

P. 1. 준비 chrysogenum 기아 실험에 대한

1. P. 경우 관심 chrysogenum 변형이 쌀 ( '녹색 쌀')에 보관되어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균사체를 포자 덮여 2-3 쌀 곡물을 배치합니다. 500 μL의 YGG (10g / L의 KCl, 20g / ℓ의 포도당 10g / L 효모 질소베이스, 5g / ℓ K ₂ HPO _4, 20g / ℓ 효모 추출물)로 채 웁니다.
   1. 포자 효율적 벼에서 분리 할 수​​ 있도록 30 초 동안 와동 튜브.
   2. 실온에서 1 날 (예를 들어, 20 내지 25 °의 C)에 대해 튜브를 부화.
   3. 멸균 수돗물이 포자 현탁액의 1/50 희석을 준비, 잘 섞는다.
2. P. 경우 관심 chrysogenum 균주 한천 플레이트 (예 YGG 한천 플레이트)에 보관하고, 400 μL 무균 수돗물 약 100 mg을 GL을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 균사체의 작은 조각을 전송할멸균 된 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 엉덩이 구슬.

결과

P.에 퍼 옥시 저하 위에 설명 된 프로토콜의 유틸리티를 설명하기 위해 chrysogenum 변형 Ws54-1255 (GFP-SKL)을 분석 하였다. 이 변형에서 GFP-SKL은 일반적으로 퍼 옥시 솜 ^(9)로 가져옵니다. 시료를 형광 현미경을 통해 분석 될 때 여러 구형의 모양을 초래한다. 자식 작용이 발생하는 경우, 액포는 확대. GFP-SKL은 자식 작용 (pexophagy)에 의해 공포에 통합된다. 인해 GFP는 액포 프로테아제 분해에 대한 저항성이 있다는 사실 이들 소기관 ^{열 라벨.} 따라서 액포이 변형, 공포의 확대 및 GFP-SKL의 현지화 자식 작용 (pexophagy)를 관찰하기위한 두 개의 매개 변수가 편리 형광 현미경으로 모니터링됩니다.

배양 20 시간에서, GFP가 액포 (도 1)에서 관찰되지 않는다. 또한, 공포의 확대가 이루어지고 있지 않습니다. 그러나.......

토론

여기에 제시된 방법은 P.에서 자식 작용의 편리하고 재현성 연구를 할 수 있습니다 chrysogenum. 예를 들면, 곰팡이는이 아닌지의 자식 작용 반응을 조절할 수있는 여부를 다양한 화합물의 효능의 스크리닝에 사용될 수있다. 라파 마이신과 결과는 TOR 신호 전달의 억제는 P.에서 자식 작용의 뚜렷한 유도에 이르게 입증 chrysogenum 다른 생물 ^(11)에 대한 입증 된.

그것은 더 정교한 현미경 (예, 공 초점 레이저 주사 현미경) 분석에 대한 고갈 균사 성장 패드를 사용하는 것이 가능하다. 이 샘플은 목적 (반전 현미경) 위의 목적 아래에 배치되어 있는지 여부를 중요하지 않습니다. 특정 구획을 대상으로 다양한 형광 단백질은 자식 작용하는 동안 다른 세포 소기관의 운명 (예를 들어, 미토콘드리아 모니터링하는 데 사용할 수있는 -> mitophagy.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
중앙 캐비티가 있는 현미경 슬라이드	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	세척 후 여러 번 사용할 수 있습니다.
유리 구슬	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	직경 : 0.25 - 0.50 mm