바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

세포 외 고분자 매트릭스 ^1로 묶인 세포 집합체 - 미생물 표면과 형태의 바이오 필름에 부착합니다. 바이오 필름은 세포 대사 ^2,3 내부 용질의 전송 제한 및 공간 변화의 조합으로 인한 극적인 공간 이질성을 가지고 있기 때문에 바이오 필름은 매우 다르게 각각의 미생물 세포에서 작동합니다. 산소와 영양소 농도는 크게 바이오 필름 ​​및 유체 및 추가 생물막 ² 내에 고갈 얻을 주변 사이의 인터페이스에서 감소. 생물막 호흡과 단백질 합성 공간적 변형, 국소 산소 및 ^영양분이 가능 여부에 대한 응답으로서 일어날 수있다.

수생 및 토양 환경에서 대부분의 박테리아는 생물막에 거. 천연 바이오 필름은 탄소와 질소 순환 및 금속 ^{4,5 감소를} 포함하여 중요한 생지 화학 과정을 수행한다. 임상, 바이오 필름 형성이 응 답이다장기간 폐 요로 감염 ⁶ 지나치지. 바이오 필름에 세포가 자신의 플랑크톤 대응 ^(6)에 비해 항생제에 매우 높은 저항을 가지고 있기 때문에 바이오 필름 ​​관련 감염은 매우 문제가있다. 바이오 필름은 다양한 설정에 중요하기 때문에, 연구의 상당량 생물막 활동 및 생물막 공간적 이질성 및 주변의 미세 환경을 제어하는​​ 환경 적 요인을 이해에 집중되어왔다.

이전의 연구 개발 생물막 강하게 환경 요인들에 의해 조절되는 것을 발견 하였다 : 생물막 다양한 유동 조건 하에서 상이한 모폴로지 개발; 산소와 영양소의 가용성에 영향을 미치는 바이오 필름 형태; 및 유체 전단 응력은 표면에 플랑크톤 세포의 부착과 생물막 ^7-9에서 세포의 분리에 영향을 미칩니다. 또한, 외부 유동 조건은 기판 INT의 전달에 영향을 미친다O 및 바이오 필름 ^​​(10) 내의. 생물막의 성장은 또한 물리적 및 화학적 조건을 둘러싼 바꾼다. 예를 들어, 생물막의 성장은 산소와 ^영양분이 고갈의 로컬 리드; 바이오 필름은 주변 환경 ^{(11)으로부터의} 무기 및 유기 화합물을 축적; 생물막 클러스터는 흐름과 증가 표면 마찰 ^12,13 전환. 생물막들은 매우 복잡한 방식으로 주변 환경과 상호 작용하기 때문에, 동시에 생물막 특성 및 환경 조건에 대한 정보를 얻기 위해 중요하며, 다 분야 접근법 종합적 생물막 인바 상호 작용을 특성화하기 위해 이용 될 필요가있다.

여기에서 우리는 부과 영양 그라데이션에서 단일 종 및 듀얼 종 생물막 내 미생물 성장에 공간 패턴을 특성화하고 지역 화학 및 유체 미세 환경의 결과 수정을 관찰하기 위해 통합 된 방법의 일련을 제시한다. 우리는 전나무ST는 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰하는 최근에 개발 된 이중 입구 미세 유체 흐름 세포의 사용을 기술한다. 우리는 그 다음 영양 조건 범위 하에서 생물막 세균, 녹농균 및 대장균, 두 종의 성장을 관찰하는 미세 유체 흐름이 셀의 사용을 입증한다. 우리는 생물막 식민지에 형광 추적 전파의 현장 시각화 정량적으로 생물막 (biofilm)에 용질 수송의 패턴을 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 초점 현미경 하에서 수행 마이크로 입자 추적 속도계는, 생물막의 주위에 성장하는 지역 흐름 필드를 취득 할 수있는 방법을 보여준다.

1. 흐름 전지 설치 및 접종

주 :.에 노래 등 기술 이중 입구 미세 유체 흐름 세포를 사용하여 2014 년 ¹⁴ 생물막 성장한다. 이 플로우 셀은 잘 정의 된 매끄러운 화학적 구배를 생성 할 수있다. 플로우 셀 설계는 이전에 설명 된 노래도 1에 도시 된 셀 제조되는 흐름 등., 2014 ^(14). 여기서는 상세히 P. 우리의 방법을 사용하여 녹농균 및 E. 대장균은 바이오 필름을 형성하지만, 다른 종은 너무 적합 할 수있다. 우리는 P. 사용 구성 적으로는 녹농균 생물막 개발 모델 생물로서, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 GFP를 PAO1-. 또한, 우리는 E.을 사용 대장균 DH5α는 P. 혼합 종 생물막 (biofilm)을 형성한다 녹농균. P. 녹농균 및 E. 콜라이 균주를 LB 아가 플레이트상에서 성장시켰다.

1. 에 (PDMS) 결합 흐름 세포 사용하여 폴리 디메틸 실록산을 준비^14에 기술 된 바와 같이 산소 플라즈마 처리를 통해 유리 커버 슬립. 흐름 셀 챔버의 크기는 0.24 mm (길이 × 폭 × 깊이) × 23mm × 13 mm의입니다.
2. 준비 FAB 성장 매체 ^(15)를 수정했습니다. 흐름 세포 내에서 영양 그라데이션에서 바이오 필름의 성장을 관찰하기 위해, 하나의 입구에 0.6 μM 포도당 ¹⁵ 매체 FAB을 수정하고, 다른 입구를 통해 어떤 탄소원없이 FAB 매체를 소개 소개합니다. 소독 필터 (기공 크기 = 0.2 μm의) FAB 매체에 추가하기 전에 글루코스 원액 (60 mm)이다. 또한주기 1 FAB 매체 오토 클레이브 (액체, 15 분 121 ° C, 17 PSI)을 사용하기 전에.
3. 유동 시스템을 소독. 접종하기 전에, 총 흐름 (매체 병, 튜브, 기포 트랩, 유동 세포) 플로우 셀의 상류에 위치 (일회용 및 사전 멸균) 플라스틱 삼방 밸브를 제외하고, 사이클 1을 사용하여 오토 클레이브. (방법 3 밸브는 셀 (C)을 주입하기 위해 사용된다ulture, 형광 추적 및 마이크로 비드.) 조립시 오염을 방지 알루미늄 호일 또는 고압 증기 멸균 전에 오토 클레이브 가방과 함께 모든 튜브 및 커넥터를 막지합니다.
4. 흐름 시스템을 연결합니다. 신중 흐름 전지 시스템의 구성 요소를 조립 (유동 시스템 어셈블리 비디오 참조)과 정밀하게 유량을 제어하는​​ 연동 펌프를 통하여 플로우 셀에 성장 배지를 제공한다.
5. P.의 식민지를 전송하여 접종 세포 배양을 준비 녹농균 또는 E. LB 플레이트에서 3 LB 배지 ㎖의 225 rpm으로 37 ° C에서 문화 O / N을 흔들 대장균. 최종 OD ₆₀₀ 멸균 수 1 ㎖ 중의 O / N 세포 배양을 희석 = 0.01로 접종. (문화 및 오염을 피하기 위해 층류 후드에서 박테리아 희석).
6. 등가 OD _(600)를 1ml 1 = 0.01 각각의 세균에 대해 : 혼합 종 생물막으로 실험을 위해, (1)의 비율로 두 세균 배양 물을 희석.
7. 플로우 셀을 접종한다. 삼방 밸브로부터 플로우 셀 흡입구 균액 1ml를 주입한다. 주입 후, 균체 커버 유리에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 흐름을 일시 정지. (흐름 세포가 일시 중단 세포가 커버 슬립에 정착 할 수 있도록 아래로 커버 슬립면이 배치되어 있는지 확인합니다.)
8. 1 시간 후, 흐름을 재개하고 3 일간 각 입구 0.03 ㎖ / 분의 일정한 속도로 플로우 셀에 성장 배지를 펌핑.

공 초점 현미경을 사용하여 영양소 그라디언트에 응답 2. 특성화 바이오 필름 개발

참고 : P. 녹농균은 구조적으로 발현 GFP 군데 있지만, E. 할 수 있습니다 혼합 종의 바이오 필름에서 대장균이 대조 염색에 의해 촬영해야합니다.

1. 공 초점 현미경을 사용하여 3 일 생물막 (biofilm)을 준수하십시오. 대표 결과, 63X의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 생물막을 관찰합니다. 이미징에 앞서, 마크커버 유리 측의 격자 이중 입구 유동 셀. (이 그리드의 목적은 실험자가 플로우 셀 챔버 내에 이미징 영역을 찾을 수 있도록하는 것이다.)
2. 이러한 STYO (62), 990 μL에 원액 (1 ㎜)의 물을 소독 한 다음 천천히 주사기로를 사용하여 희석 얼룩을 주입 등 녹색 형광 핵산 얼룩 등의 세포 투과 적색 형광 핵산 얼룩의 10 μl를 희석, Counterstain과려면 상류 삼방 밸브로부터 플로우 셀 챔버. 정체 유동 세포를 유지하고 30 분 동안 어두운 데에서, 다음 15 분 동안 결합​​되지 않은 얼룩을 씻어 흐름을 재개.
3. 공 초점 이미징을 수행합니다. 여기에 대한 488 nm의 아르곤 레이저와 GFP (500-535 nm의)과 (녹색 형광 핵산 얼룩에 대한, 650 ~ 750 ㎚) 핵산 얼룩을위한 채널을 수집 방출을 활성화합니다. 밝고 깨끗한 이미지를 가지고 두 채널에 대한 이득 및 오프셋을 조정합니다. 선택 XYZ 동시 영상 모드. IDEN하기 위해 Z-컨트롤 노브를 사용하여필드 생물막의 하단과 상단을 검사에서 발견. 3-D 이미지를 취득하는 스택 0.5 ㎛ 인 Z-단계를 설정한다. (화상 취득 네 라인 평균을 사용하여 높은 화상 품질을 보장​​하기 위해).
4. 세 개에서 공간적 플로우 셀 내의 생물막 개발 패턴 화상 생물막 매핑 자세히 길이 (X) 흐름 세포 유입을 따라 거리를,도 1에 도시 된 바와 같이 세 개의 횡 방향 (y)에, 부과 영양 그라데이션 상대 위치 .

보수적 형광 추적기의 주사 3. 특성화 내부 용질 전송

참고 사항 : Cy5에 같은 보수적 형광 트레이서는, 생물막 내부 용질 수송 패턴을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다.

1. 원액으로 ㎖의 10 ㎎ / 최종 농도 Cy5에 물 (모노 반응성 NHS 에스테르) 녹인다. -20 ° C 냉장고에 Cy5의 주식 솔루션을 저장합니다.
   참고 : Cy5의 빛 - sensit이기 때문에필자, 상점, 희석 어두운 Cy5의 용액을 주입.
2. 형광 탐침의 주사에 앞서, (63X 대물 렌즈)와 공 촛점 현미경으로 3 일 생물막의 3-D 화상을 스택. (생물막 식민지의 넓은 지역 염료 전송의 시계열 관측에 적합하다.) (그림 5A 참조) 또한 이미지에 잘 구분 식민지와 Z 평면을 선택합니다.
3. 각 Cy5에 주입 실험을 위해, 20 ㎍ / ml의 Cy5의 농도를 갖는 주사 용액을 수득 물을 998 μL의 멸균 Cy5의 스톡 용액 2 μl를 희석.
4. 흐름을 일시 중지 및 3 방향 밸브를 통해 주사기를 사용하여 플로우 셀의 상류에 Cy5의 용액을 주입하는 펌프를 중지. (이는 주입하면서 유로 들어가는 기포를 방지하는 것이 중요하다. 버블 트랩 다시 주입 동안 열려 유지되어야한다.)
5. Cy5의 용액을 주입 한 후, 3 방향 밸브를 조정, 거품 트랩을 닫고 다시 시작플로우 셀에 주입 Cy5의 솔루션을 제공하는 펌프.
6. xyt하는 공 초점 영상 모드를 전환합니다. 동시 촬영 모드에서 Cy5에와 GFP 채널을 활성화합니다. (레이저 강도 이득 및 오프셋) Cy5의 강도에 촛점 설정을 조정 정량 중요한 신호를, 포화 방지하기 위해. (높은 시간 해상도는 염료 침투를 가시화하는 것이 바람직하다. 그러나, 빠른 스캔 이미지 품질을 감소시킨다.) 이미징의 시간 해상도 및 화상 품질의 균형을 적절한 주사 속도와 라인 평균을 선택한다. 이 프로토콜을위한 네 가지의 라인 평균 0.15 Hz의 프레임 레이트를 사용한다.
7. (아직 0.03 ㎖ / 분의 유속으로)로 플로우 셀을 제공하는 Cy5의 흐름을 재개. 동시에 시계열 공 초점 영상을 시작합니다.
8. 반경 방향으로 2-D 원형 생물막 콜로니 내에 Cy5의 강도를 평균하여 Cy5의 침투를 정량화. 제 생물막 클러스터의 에지를 식별, 평균 다음 클러스터의 2-D 섹션 거리 맵을 생성그리고 최종적 Cy5의 강도의 평균 반경 패턴 침투 곡선 (도 6 참조)를 생성한다.
   1. 계산 3.8 단계 실현하기 위해, BioSPA (바이오 필름의 공간 패턴 분석) 소프트웨어 패키지 (게시되지 않은, 소프트웨어 패키지 및 수동 요청시 사용 가능) 또는 다른 이미지 분석 프로그램을 사용합니다.
   2. BioSPA를 사용하려면 먼저 BioSPA로 설정 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 이진 이미지를 만들기 위해 GFP와 Cy5의 채널에 대한 적절한 임계 값을 선택합니다. 분석 / 계산 메뉴에서 고급 분석하고 확산 분석을 선택합니다. 클러스터의 에지를 정의하는 관심 영역 (ROI)의 영역으로서 하나의 클러스터를 선택하는 다각형 도구를 사용하여 GFP 채널을 사용한다.
   3. 더블 확산 분석을 수행하기 위해 선택한 생물막 클러스터를 클릭합니다. 확산 분석 결과를 저장하고 검량선을 이용하여 Cy5의 농도와 Cy5의 강도를 교정.
      1. Cy5에의 conce 위에 Cy5의 강도를 측정, Cy5의 농도 검량선을 생성하려면공 초점 현미경 아래 ntration 구배. (Cy5의 강도와 농도는 선형 관계가 있습니다.)

4. 현황 형광 발색 입자의 주변 환경 유동장 특성화

주 : 형광 마이크로 비드와 같은 형광 물질, 생물막 주위 유동장을 특성화하는데 사용될 수있다. 생물막 주위 유동장 입자 유속계 추적 소프트웨어를 사용하여 입자 위치의 시계열 관측치로부터 계산 될 수있다. 여기에 표시된 결과는 스트림 2.02 소프트웨어 패키지 ⁽¹⁶⁾ (소프트웨어 다운로드 및에서 사용 가능한 사용자 설명서 얻었다 http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml ).

1. 0.2 %의 최종 고형분 농도 0.5 ml의 최종 부피의 멸균 형광 마이크로 비드 (직경 ~ 1 ㎛)를 희석. 소용돌이는 마이크로 비드가 있는지 확인잘 분산되어있다.
2. 주입 및 단계 3.3-3.5에서 절차에 따라 유동 셀에 희석 형광 마이크로 비드를 제공합니다. 입자 경로의 정확한 추적이 (이 종이 입자 조회 결과 0.01 ㎖ / 시간) 상대적으로 낮은 유속을 사용할 수있게한다.
3. 하나의 Z-슬라이스에서 입자의 움직임을 추적하고 시계열 이미지를 취할 모드를 xyt에 촛점 설정을 전환합니다. (1 Hz의 프레임 레이트는 본 문서에서 나타낸 대표적인 결과를 사용 하였다.) 반복 입자 주입 및 이미지를 상이한 Z 위치에서 3-D 흐름 필드를 생성한다.
4. 전처리 시계열 (가능한 소프트웨어 다운로드 및 사용 설명서가 ImageJ에 배경 형광 신호 (이미지 세트의 처음에서 취득 된 화상 신호)를 감산함으로써 공 초점 화상 을 http://imagej.nih.gov/ij/ ) 또는 다른 프로그램.
5. ImageJ에에서 이미지 세트의 첫 번째 이미지를 열고 이미지 세트를 가져옵니다. 프로세스에서 / 이미지 칼슘lculator, 이미지 세트로부터 첫 번째 이미지를 뺀다. 사전 처리 된 이미지 설정을 저장합니다.
6. 스트림 2.02의 흐름 벡터, 수입 시계열 공 초점 이미지를 계산합니다. "열기 프로세스보기"에서 선택하고 "입자를 식별"실행합니다. 입자를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 사용합니다. 1 μm의 입자의 최소 및 최대 직경 임계 값 0.5, 5 μm의를 사용합니다.
7. 그런 다음 "열기 프로세스보기"에서 선택하고 입자 경로를 생성하기 위해 "PTV 분석 파이프 라인"을 실행합니다. 그들은 입자의 움직임을 표현 있는지 확인하기 위해 입자 경로를 확인합니다. 마지막으로, 선택하고 흐름 벡터지도를 생성하기 위해 "속도 필드 만들기"를 실행합니다.

이중 입구 마이크로 유체 유동은 유동 셀 챔버 내에 두 용액의 혼합에 의해 형성 잘 정의 된 화학 구배 하에서 생물막의 성장을 관찰 할 수있다. 그 결과 화학 그라데이션 이전 염료 주입에 의해 관찰과 노래 등. (14)에 의해 구체적으로 분석되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이 부드러운 농도 기울기는, 횡 방향으로 형성했다. 농도 프로파일은 입구 근처 험했다 의한 확산 (도 1)의 하류에있어 완화. 영양 그라데이션에서 바이오 필름 개발을 관찰하기 위해, 우리는 유일한 탄소원으로 하나의 입구에 추가 포도당으로 정의 된 최소한의 성장 매체 (FAB 매체)를 사용했다. 다른 모든 영양소가 균일 분산 된 상태에서이 플로우 셀 챔버 내의 포도당 구배를 수득 하였다. P.의 성장 녹농균 PAO1 생물막 강하게 포도당의 로컬 배달 (그림 2)에 상관 관계가 있었다.횡 글루코스 농도 구배 입구 근처 가파른되면서 생물막 바이오 매스 저 포도당 영역 높은 글루코스 영역에서 크게 감소 하였다. 다운 스트림 긴장을 가로 포도당 그라데이션으로, 생물막 바이오 매스는 더 균일하게되었다. 우리는 더 P.의 상호 작용을 연구하기 위해,이 플로우 셀의 사용을 입증 녹농균 및 E. 포도당 그라데이션에서 바이오 필름의 대장균 (그림 3). 그 결과이 두 종은 영양 그라데이션으로 성장 상대적으로 별개의 공간 패턴을 보여, 따라서 별개의 생태 틈새 시장을 점령 것을 보여 주었다 : P. aeruginosa의 높은 포도당 농도와 E와 지역에서 생물막 바이오 매스를 지배 대장균은 낮은 포도당 농도 (그림 3)와 지역에서 지배했다.

생물막의 성장과 주위 환경​​ 사이의 유동 피드백을 이해하기 위해, 우리는 주변 성장 바이오 유동장을 특징으로하는공 초점 현미경에서 형광 입자 추적 유속계에 의한 영화. 주입 형광 마이크로 비드 관찰 이동 1. 지역 흐름 벡터 정보가 스트림 소프트웨어 패키지를 사용하여 입자 속도의 적어도 4,200 이산 측정의 평균으로부터 추출 된 영화에 나타낸다. 유동장의 3 차원 사상은 다중 수직 위치 (도 4)에서 입자를 추적함으로써 얻었다. 바이오 필름 ​​성장에 크게 증가 흐름 이질성 (그림 4). 생물막베이스 근처 흐름이 증가 이질성로 이어지는, 생물막 클러스터 주변 전환 및 속도 (그림 4) 감소했다. 생물막 상단의 흐름은 더 높은 속도를 가지고 있으며 (그림 4) 더 균질.

바이오 필름 내에서 제한 용질 수송에 의한 내부의 이질성을 이해하기 위해, 우리는 공 초점 현미경으로 바이오 필름 내에서 Cy5에의 이동을 관찰했다. 시계열 침투Cy5에의 생물막 클러스터로 Cy5의 농도 프로파일의 1-D 확산 모델을 피팅하여 계산되었다 영화 3 생물막 Cy5에의 유효 확산 계수에 도시 영화 2. 시계열 Cy5에 침투 곡선에 나타내

여기서 C는 형광 강도로부터 산출 방사상 Cy5의 평균 농도이고, 생물막 (17) 내로의 거리이다. Cy5의 벌크 흐름에 가장 높은 농도를 보였고, 생물막 (그림 5)를 입력에 따라 급격하게 감소 하였다.

1. 두 번 입구 미세 유체 흐름 셀을 그림. 부드러운 글루코스 구배 헵 (탄소원으로 두 유입구 FAB 매체를 도입하여 챔버 내에서 유동 만들어진 SE)는 하나의 입구 만 구비. 음영에 의해 표시되는 유동 셀 내의 포도당의 패턴을 생성. 어두운 그림자가 높은 포도당 농도를 나타냅니다. 공 촛점 이미지는 세포 유동 아홉 위치에서 수행되었다. 2 및 3 위치를 참조 도면에 제시된 결과는도 1-9 번호. 이 수치는 노래 등 알 후 수정됩니다. (2014),도. 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

포도당 그라디언트 아래 그림 2. PAO1 생물막 성장. 3 일 PAO1 생물막은 그림 1의 9 위치에 몇 군데 있었다. 격자 간격 = 이미지 1-8 18 μm의 이미지 9 24 μm의.g "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. P.의 개발 녹농균 및 E. 포도당 그라디언트에서 대장균 듀얼 종 생물막. P. 녹농균은 구성 적 GFP를 발현하고, 바이오 필름은 일반적인 핵산 얼룩이다 SYTO 62 의해 대조 하였다. 여기에 표시된 이미지는 GFP (녹색)과 SYTO 62 (적색) 채널의 오버레이입니다. P. aeruginosa에 따라서 녹색 또는 노란색 (녹색 + 적색), 및 E. 나타납니다 대장균이 빨간색으로 나타납니다. 스케일 바는 47 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 유속 벡터 필드에서 Z = 4, 10, 생물막 약 16㎛, 클러스터. 화살표의 길이가 유속의 크기를 나타낸다. 저 유량 속도는 생물막베이스 (Z = 4, 파란색 화살표)를 보여줍니다. 흐름 생물막 상단 (Z = 16, 빨간색 화살표) 근처 더 균일하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이오 필름에 그림 5. Cy5에 침투. t = 190 초에서 생물막 클러스터로 Cy5에 부분적으로 침투를 보여주는 Z = 18 μm의에서 (A) 공 초점 현미경 사진. 스케일 바는 10 ㎛, =. (B) Cy5의 농도 맵 패턴을 생성. (C) Cy5의 농도 프로파일 하나 생물막 클러스터. 602fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 절차 그림 Cy5에 침투 프로파일을 생성하기 위해 왼쪽 :. 2-D 생물막 클러스터를 포함하는 투자 수익 (ROI)을 선정. 중동 : 생물막 클러스터의 거리지도. 오른쪽 : 방사형 평균 Cy5의 강도 프로파일. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1 : 생물막 클러스터 주변에 주입 된 형광 입자의 운동 (공 초점 영상).

영화 2 : 생물막 클러스터로 Cy5에의 전파 (공 초점 영상).

저자는 공개할 것이 없습니다.