차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

요약

이 프로토콜의 목표는 유방 종양 형성을 연구하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비할 수 있습니다. 폐 전이를 연구하기 위해 폐 추출 프로토콜이 포함되어 있습니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다.

초록

유방 종양 형성에서 질병의 전이 단계는 영향을 받는 개인에게 가장 큰 위협이 됩니다. 유전자형이 변형된 정상 유방 세포는 이제 다른 조직에 침입하여 생존할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비합니다. 이 절차에서 분리된 세포는 유전자 프로파일링 실험에 사용할 수 있습니다. 성공적인 전이를 위해서는 이러한 세포가 혈관 내 침투할 수 있어야 하고, 순환 중에 생존할 수 있어야 하며, 멀리 떨어진 장기로 유출할 수 있어야 하며, 새로운 장기 시스템에서 생존할 수 있어야 합니다. 폐는 유방암 전이의 전형적인 표적입니다. 폐로의 전이의 선택성을 매개하는 일련의 유전자가 발견되었습니다. 여기에서는 유전자 조작 마우스 모델에서 폐 전이를 연구하는 방법을 설명합니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다. 동일한 동물 유형의 MEF 세포는 비암 세포 유전자 발현의 단서를 제공합니다. 이러한 기술은 함께 마우스 유방 종양 형성, 관련 신호 전달 메커니즘 및 배아 내 이상 경로를 연구하는 데 유용합니다.

서론

전이는 유방암 진행의 마지막 단계입니다 ¹. 이는 악성 세포가 원발성 종양에서 방출되어 다른 장기로 전파되는 일련의 단계를 포함한다 ². 세포는 혈관 내 침투할 수 있어야 하고, 순환 속에서 생존하며, 멀리 떨어진 장기로 유출할 수 있어야 하고, 새로운 장기 체계에서 생존할 수 있어야 한다 ³. 종양 형성의 각 단계는 다양한 유전적 및 후성유전학적 변화를 통해 세포에 의해 엄격하게 제어됩니다 ⁴. 유방암 종양형성의 기전을 연구하기 위해 짧은 수명, 작은 크기 및 빠른 번식 시간으로 인해 마우스 모델 시스템이 활용되었습니다. 암 연구에서 마우스 모델을 사용하는 것의 몇 가지 주요 이점은 인간과 공유하는 분자 및 생리학적 유사성입니다 ⁵.

확립된 마우스와 인간 세포주는 유방암 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 이러한 세포를 사용하여 전이 단계에 대한 일부 정보를 얻을 수 있지만, 종양 억제 인자/종양 유전자를 이용한 유전자 조작 동물 모델은 배아 단계부터 시작되는 종양 발달 및 전이에 대해 훨씬 더 많은 정보를 제공할 것입니다. 따라서 이러한 마우스 모델을 통해 종양 성장의 유전적 및 발달적 조절을 얻을 수 있습니다. 또한, 종양 미세환경은 종....

프로토콜

모든 마우스 실험은 의학의 LSU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 악기는 해부하기 전에 멸균해야합니다.

마우스 유방 종양에서 일차 전지 1. 준비

1. 유전자 이전 ⁶ 설명한 바와 같이 자발적 종양을 개발하는 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT 유전자 변형 마우스)로 설계 한 마우스 모델을 사용합니다.
2. 아이소 플루 란 (99.9 %)와 쥐를 희생하고 무균 환경 (그림 1A)을 보장하기 위해 75 %의 에탄올을 스프레이.
3. 가위로 목 요도 구멍의 영역으로부터 피부를 엽니 다. 기관 (도 1b)에 쉽게 접근 할 수 있도록 피부 아래에 핀.
4. 유방 유방 종양을 분리하고 차가운 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) (PH 7.4) (그림 1C)로 씻는다.
5. 에 종양 이동멸균 10cm 조직 배양 판은 약 1mm ³ 개에 멸균 면도날과 가위로 잘라합니다. 후속 단계는 무균 층류 후드에서 수행되어야한다.
6. 37 ° C에서 2 시간 동안 로커에서 1 ㎎ / ㎖의 최종 농....

결과

동물을 희생에서 종양의 진행 단계는 특정 연구 및 IACUC 지침에 따라 달라집니다. 그림 1A, 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT)와 100 일된 C57BL / 6 마우스의 세 개월에 희생되었다. 피부 위 목 요도 오리피스의 영역으로부터 개방하고 피부는도 1b에 나타낸 바와 같이 기관에 쉽게 액세스 할 수 있도록 아래로 고정 하였다. 이는도 1C에서 얻어진 종양에 쉽게 접근 할 수 있었다. 종양에서 얻은 일차 전지는 그림 1D으로 시각화된다. 많은 유전자가 폐 ^한 유방암의 전이를 매개하기 때문에, 우리는 전이 과정을 연구하기 위해 폐 (도 2A)을 추출 하였다. 폐는 Z-수정과 팽창 종양 결절을 시각화하는 인도 잉크 (그림 2B)로 염색 하였다. 그림 3은 마우스.......

토론

이 프로토콜은 신선한 마우스의 종양에서 일차 전지를 분리입니다. 이 방법에서 준비 해물 단백질, DNA와 RNA를 분석하는 데 유용합니다. 기본 유방 종양에서 암 세포들은 뇌, 폐, 뼈 ^1로 전이. 포함 된 전이의 검출을위한 폐를 추출하는 기술이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이 잉크 얼룩 폐 염색하여 종양 결절의 시각화를 허용한다. Z-수정 용액에 폐를 고정하는 것은 우리가 폐의 섹션을 확인하고 전이 메커니즘을 연구에 적합한 항체로 염색 할 수 있습니다. 또한 마우스 배아 섬유 아 세포의 분리를위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이것은 동일한 종류의 동물의 배아 섬유 아세포와 일차 종양 세포의 유전자 발현을 비교하는 데 유용하다.

일차 전지와 MEFs에의 제조에서, 가장 중요한 단계는 재료의 닦지이다. 보라, 적절한 고장없이w 세포 수를 달성 할 것이다. 낮은 세포 카운트가 달성되는 경우, 프로토콜은 여전히​​ 따라야 할 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	HyClone	SH30243.01	4°C에 저장; C
0.05% Trypsin-EDTA	Life  기술	25300-062	Store at – 20 ° C
콜라겐 분해 효소 유형 IV	시그마 - 알드리치	C5138	저장 – 20 ° C
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	매장 – 20 ° C
Pen Strep	Life  기술	15140-122	4 °에 저장; C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	매장 – 80 ° C
Z-fix	ANATECH	#174	RT
India Ink	Yasutomo		RT
AERRANE (Isoflurane)	Baxter	NDC 10019-773-60	RT
Ethanol	EMD	AX0441-3	Store at RT 스토어