이 프로토콜의 목표는 유방 종양 형성을 연구하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비할 수 있습니다. 폐 전이를 연구하기 위해 폐 추출 프로토콜이 포함되어 있습니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다.
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방법 논문
차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유방 종양 형성에서 질병의 전이 단계는 영향을 받는 개인에게 가장 큰 위협이 됩니다. 유전자형이 변형된 정상 유방 세포는 이제 다른 조직에 침입하여 생존할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에서는 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비합니다. 이 절차에서 분리된 세포는 유전자 프로파일링 실험에 사용할 수 있습니다. 성공적인 전이를 위해서는 이러한 세포가 혈관 내 침투할 수 있어야 하고, 순환 중에 생존할 수 있어야 하며, 멀리 떨어진 장기로 유출할 수 있어야 하며, 새로운 장기 시스템에서 생존할 수 있어야 합니다. 폐는 유방암 전이의 전형적인 표적입니다. 폐로의 전이의 선택성을 매개하는 일련의 유전자가 발견되었습니다. 여기에서는 유전자 조작 마우스 모델에서 폐 전이를 연구하는 방법을 설명합니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다. 동일한 동물 유형의 MEF 세포는 비암 세포 유전자 발현의 단서를 제공합니다. 이러한 기술은 함께 마우스 유방 종양 형성, 관련 신호 전달 메커니즘 및 배아 내 이상 경로를 연구하는 데 유용합니다.
서론
전이는 유방암 진행의 마지막 단계입니다 1. 이는 악성 세포가 원발성 종양에서 방출되어 다른 장기로 전파되는 일련의 단계를 포함한다 2. 세포는 혈관 내 침투할 수 있어야 하고, 순환 속에서 생존하며, 멀리 떨어진 장기로 유출할 수 있어야 하고, 새로운 장기 체계에서 생존할 수 있어야 한다 3. 종양 형성의 각 단계는 다양한 유전적 및 후성유전학적 변화를 통해 세포에 의해 엄격하게 제어됩니다 4. 유방암 종양형성의 기전을 연구하기 위해 짧은 수명, 작은 크기 및 빠른 번식 시간으로 인해 마우스 모델 시스템이 활용되었습니다. 암 연구에서 마우스 모델을 사용하는 것의 몇 가지 주요 이점은 인간과 공유하는 분자 및 생리학적 유사성입니다 5.
확립된 마우스와 인간 세포주는 유방암 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 이러한 세포를 사용하여 전이 단계에 대한 일부 정보를 얻을 수 있지만, 종양 억제 인자/종양 유전자를 이용한 유전자 조작 동물 모델은 배아 단계부터 시작되는 종양 발달 및 전이에 대해 훨씬 더 많은 정보를 제공할 것입니다. 따라서 이러한 마우스 모델을 통해 종양 성장의 유전적 및 발달적 조절을 얻을 수 있습니다. 또한, 종양 미세환경은 종양 세포 유전자 발현에 중요한 역할을 하며, 확립된 세포주를 사용하는 연구에서 동일한 시나리오를 모방하기 어려울 수 있습니다. 원발성 인간 유방 종양은 마우스 유방 종양 형성을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 고립된 유방 종양을 사용하는 것의 가장 큰 단점은 새로 이식된 이 종양에는 마우스의 혈관 구조와 림프 조직이 없다는 것입니다. 유선종양형성(mammary tumorigenesis)을 연구하기 위한 유전자 마우스 모델 시스템을 통해 전이 단계를 모니터링하고, 종양 미세환경을 분석하고, 전신에 접근할 수 있다 5.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스의 유방 종양 형성을 연구하는 것입니다. 유방암은 일반적으로 뇌, 폐 및 뼈로 전이되는 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 원발성 유방 종양 세포를 분리할 수 있을 뿐만 아니라 유방암이 폐로 전이되는 것을 연구할 수 있습니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이러한 기술은 함께 쥐의 유방 종양 형성을 연구하는 데 유용합니다.
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프로토콜
모든 마우스 실험은 의학의 LSU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 악기는 해부하기 전에 멸균해야합니다.
마우스 유방 종양에서 일차 전지 1. 준비
- 유전자 이전 6 설명한 바와 같이 자발적 종양을 개발하는 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT 유전자 변형 마우스)로 설계 한 마우스 모델을 사용합니다.
- 아이소 플루 란 (99.9 %)와 쥐를 희생하고 무균 환경 (그림 1A)을 보장하기 위해 75 %의 에탄올을 스프레이.
- 가위로 목 요도 구멍의 영역으로부터 피부를 엽니 다. 기관 (도 1b)에 쉽게 접근 할 수 있도록 피부 아래에 핀.
- 유방 유방 종양을 분리하고 차가운 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) (PH 7.4) (그림 1C)로 씻는다.
- 에 종양 이동멸균 10cm 조직 배양 판은 약 1mm 3 개에 멸균 면도날과 가위로 잘라합니다. 후속 단계는 무균 층류 후드에서 수행되어야한다.
- 37 ° C에서 2 시간 동안 로커에서 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도에서 무 혈청 DMEM 배지에 용해 된 콜라게나 다진 종양 조직을 인큐베이션. g X 200에서 3 분 동안 종양 조직 현탁액을 원심 분리기.
참고 : 콜라게나 배양은 조직의 효소 분해에 필수적이다. - 뜨는을 취소하고 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 PBS (PH 7.4)와 침전물을 3 회 반복한다. 최종 세척 후, 상층 액을 가만히 따르다.
- 하면서 하향 경사 37 ° C에서 5 분 동안 트립신 EDTA 2 ㎖와 조직을 재현 탁. 200 XG에 3 분 동안 현탁액을 원심 분리기 및 세척을 반복합니다.
- 10cm 접시에 정상적인 성장 배지 (DMEM, 10 % FBS, 배 펜 / 연쇄상 구균)에서 조직 펠렛을 재현 탁. 변화미디어 다음 3 일 동안 매일. 목적하는 세포 수까지 배양 세포가 얻어진다.
참고 : 약 1 × 7 세포는이 절차에서 격리됩니다. MMTV-PyMT 비교할 때 이러한 MMTV-노이 같은 다른 마우스 유방 종양 모델은, 세포의 낮은 수율을 제공한다. 낮은 수율을 생성 모델을 사용하면, 더 이상 큰 종양 세포 배양으로 시작하는 것이 유리하다.
2. 마우스 폐 추출 폐 전이를 시각화
- 폐 추출에 앞서, 간 및 진동판을 제거한다. 폐를 방해하지 않고 갈비뼈을 제거.
- 위의 미세 쌍, 경정맥에 가까운 기관의 상부를 연다.
- 카테터를 사용하여, 폐 (도 2A)를 채우기 위해 기관을 통해 Z-수정 또는 인도 잉크 등의 1 ml의 에이전트를 주입. 포함 파라핀에 폐를 Z-해결.
- Fekete의 솔루션에 인도 잉크를 주입 폐를 드 얼룩(100 mL의 70 % 알코올, 10 % 포르말린 10 ml의 빙초산을 5 ml), 5 분. 직경 ≥ 0.5 mm의 보조 사이트에서 종양 결절을 정의 전이로 결절을 결정합니다.
주 : 종양에 의한 기관지 및 세기관지 막힘, 종양 결절이 15 % 먹물을 흡수 할 수없고, 따라서 정상적인 폐 조직이 검게 될 것이고, 종양 결절이 백색 7 인해 것이다. 이것은 개인의 종양 결절 (그림 2B)의 시각화 수 있습니다.
마우스 배아에서 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs에를) 준비 (3)
- 아이소 플루 란 (99.9 %)이 임신 한 쥐를 희생하고 무균 환경을 보장하기 위해 75 %의 에탄올을 스프레이.
- 가위로 목 요도 구멍의 영역에서 피부를 열고 자궁에서 배아를 분리.
- 피부를 열 때 배아를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 자궁 뿔을 제거하고 차가운 인트에서 그들을 씻어PBS (PH 7.4)를 화나게.
- 얼음 차가운 PBS (PH 7.4)를 포함하는 10cm 접시에 매우 신중 태반과 장소 배아에서 배아를 분리합니다.
- 배아로부터 헤드, 간, 창자를 제거하고 PBS (PH 7.4)를 함유하는 12 웰 조직 배양 플레이트의 나머지 부분을 배치했다.
- 또 다른 12 웰 플레이트 포함 트립신 EDTA에 배아 체를 전송하고 멸균 면도날과 가위를 사용하여 작은 조각 (~ 1mm 3)로 절단. 37 ℃에서 5 분 동안 트립신 EDTA 5 ㎖와 다진 재료를 품어.
- 다진 배아 1 ml의 우 태아 혈청 (FBS)을 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 원심 분리기를 10 분 동안 200 XG 속도 현탁액을 조심스럽게 상층 액을 제거 따뜻한 DMEM 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 10 DMEM의 ㎖ (20 %의 FBS와 2X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유 10cm 접시에 모든 내용을 전송 ).
- 이틀 동안 매체 매일을 변경합니다. 문화 원하는 셀 때까지 세포수는 달성된다.
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결과
동물을 희생에서 종양의 진행 단계는 특정 연구 및 IACUC 지침에 따라 달라집니다. 그림 1A, 마우스 유방 종양 바이러스 폴리오 중동 T-항원 (MMTV-PyMT)와 100 일된 C57BL / 6 마우스의 세 개월에 희생되었다. 피부 위 목 요도 오리피스의 영역으로부터 개방하고 피부는도 1b에 나타낸 바와 같이 기관에 쉽게 액세스 할 수 있도록 아래로 고정 하였다. 이는도 1C에서 얻어진 종양에 쉽게 접근 할 수 있었다. 종양에서 얻은 일차 전지는 그림 1D으로 시각화된다. 많은 유전자가 폐 한 유방암의 전이를 매개하기 때문에, 우리는 전이 과정을 연구하기 위해 폐 (도 2A)을 추출 하였다. 폐는 Z-수정과 팽창 종양 결절을 시각화하는 인도 잉크 (그림 2B)로 염색 하였다. 그림 3은 마우스...
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토론
이 프로토콜은 신선한 마우스의 종양에서 일차 전지를 분리입니다. 이 방법에서 준비 해물 단백질, DNA와 RNA를 분석하는 데 유용합니다. 기본 유방 종양에서 암 세포들은 뇌, 폐, 뼈 1로 전이. 포함 된 전이의 검출을위한 폐를 추출하는 기술이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이 잉크 얼룩 폐 염색하여 종양 결절의 시각화를 허용한다. Z-수정 용액에 폐를 고정하는 것은 우리가 폐의 섹션을 확인하고 전이 메커니즘을 연구에 적합한 항체로 염색 할 수 있습니다. 또한 마우스 배아 섬유 아 세포의 분리를위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이것은 동일한 종류의 동물의 배아 섬유 아세포와 일차 종양 세포의 유전자 발현을 비교하는 데 유용하다.
일차 전지와 MEFs에의 제조에서, 가장 중요한 단계는 재료의 닦지이다. 보라, 적절한 고장없이w 세포 수를 달성 할 것이다. 낮은 세포 카운트가 달성되는 경우, 프로토콜은 여전히 따라야 할 수...
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공개 사항
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감사의 글
재정적 지원에 대해 NIH, LACaTS 및 Ochsner 클리닉 재단에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | 4°C에 저장; C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life 기술 | 25300-062 | Store at – 20 ° C |
| 콜라겐 분해 효소 유형 IV | 시그마 - 알드리치 | C5138 | 저장 – 20 ° C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | 매장 – 20 ° C |
| Pen Strep | Life 기술 | 15140-122 | 4 °에 저장; C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | 매장 – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | RT |
| India Ink | Yasutomo | RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT 스토어 |
참고문헌
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