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Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

정량적 핵산 증폭 환경, 인성 및 인성 병원균의 검출뿐만 아니라, 임상 적 진단을위한 중요한 기술이다. 실시간 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)는 HIV-1 바이러스 성 부하 테스트 세균성 병원체의 검출 및 다른 많은 생물 ^한 스크리닝 예를 들면 핵산의 민감하고 특이 및 정량적 검출 금 표준 방법 ^{– 3.} 실시간 qPCR의 동안 프라이머 사이클 병원체 DNA를 증폭 및 형광 신호는 각주기에서 증폭 된 DNA 시료의 양에 비례한다고 생성된다. 병원체 DNA의 미지 농도를 함유하는 샘플은 표준 시료의 초기 DNA 농도와 형광 신호가 특정 임계 값에 도달하는 시간 (즉, 사이클 임계치 또는 C의 _T)에 관한 표준 곡선을 사용하여 정량화 될 수있다.

<p class=실시간 qPCR의 이러한 재조합 효소 증폭 (RPA)의 결과로서, 대안 등온 증폭 기술을 수신하기 위해 고가의 열 순환 장치와 몇 시간이 필요하기 때문에 "jove_content는"> ^4, 개발되어왔다. 이러한 플랫폼은 일반적으로 더 빠른 결과를 제공하고 덜 비싼, 간단한 장치로 달성 될 수있는 저급 단일 온도에서 핵산을 증폭. , 현장 진료 응용 프로그램에 특히 매력적인 분 안에 DNA를 증폭 RPA는 낮은 증폭 온도 (37 ° C)를 필요로하고, 불순물 ^5,6의 존재에 활성 상태로 유지됩니다. ^{12 –} RPA 분석법은 biothreat 제 ^7의 식품 분석, 병원균 검출, 항암제 스크리닝 및 검출을 포함한 다양한 애플리케이션을 위해 개발되었다. 그러나, 핵산의 정량 RPA를 사용 ^13,14 한정되었다.

이전의 연구에서는 웃음이었다WN 그 실시간 정량적 RPA (qRPA)는 ¹⁵ 가능하다. 여기서, 상세한 프로토콜은 표준 곡선을 사용하여 정량화 qPCR에 유사 방법을 사용하여 미지 시료를 정량화 실시간 정량적 RPA를 사용하기 위해 제공된다. 이 프로토콜은 제대로 작동하는 시스템을 보장하기 위해 내부 양성 대조군 (IPC)를 개발하는 방법뿐만 아니라, 개념 증명으로 HIV-1 DNA를 검출하기 위해 열 자전거 타는 사람에 RPA 반응을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 트레이닝 데이터를 이용하여 표준 곡선을 구성하기위한 서열 증폭기 또는 현미경과 데이터 분석에 의한 데이터 수집은 또한 상술된다. 마지막으로, 커스텀 스크립트 표준 곡선을 사용하여 미지 시료 정량법이 설명된다. 이 qRPA 기술은 미지 농도와 시료의 정량 분석​​을 가능하게하고 기존의 실시간 qPCR에 비해 많은 장점이 있습니다.

Protocol

1. 프로그램 실시간 qRPA의 반응에 대한 열 자전거 타는 사람

1. 열 자전거 타는 소프트웨어의 새로운 프로토콜을 작성합니다.
   1. 1 분 39 ° C : 미리 배양 단계를 삽입합니다.
   2. 두 번째 단계를 추가 : 39 ° C를 판 읽기 다음 20 초 동안.
   3. 마지막으로, 두 번째 단계를 반복 59 번 "로 이동"삽입합니다.
   4. 프로토콜을 저장합니다.
2. 소프트웨어의 "판 편집기"탭에서 새 판을 만듭니다. RPA 반응의 위치에 해당하는 접시에 우물 선택합니다 (여기를 사용 우물 A1, A4-A8, B1 및 B4-B8).
   주 : 데이터 분석이 커스텀 스크립트를 사용하여 수행되는 것처럼 웰 (예를 들어, "표준", "NTC")의 샘플 유형이 지정되었는지 여부를 중요하지 않다.
   1. 만 HIV-1 DNA를 포함하는 실험의 경우, 모든 우물 "HEX"형광을 선택합니다. HIV-1 DNA와 내부 긍정적 인 협력을 포함하는 실험ntrol "HEX"모든 우물 용 "FAM"형광 물질을 모두 선택합니다. 접시를 저장합니다.

2. HIV-1 qRPA 실험 준비

1. qPCR에 대한 지정 피펫, 피펫 팁, vortexer를, 미니 원심 분리기를 포함하는 지정된 사전 증폭 작업 공간에서 RPA 반응을 조립합니다. RPA가 크기만큼 열 같은 순서에 의해 DNA의 단일 복사본을 증폭 수있는 바와 같이 (도시되지 않음), 본 처리하고 지정된 후 증폭 영역에서 포스트 – 증폭 된 DNA를 함유하는 제품을 폐기 튜브.
   1. 모든 사전 증폭 시약 및 사후 증폭 산물 사이의 접촉을 방지합니다. 전에 모든 실험 후 사전 증폭 작업 영역 및 50 % 표백제와 장비를 스프레이. 를 초과하는 표백제를 닦아 종이 타월을 사용합니다.
2. 구매 정방향 프라이머 서열 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA AT & T TTA AAA GAA AAG G-3 '프라이머 서열 5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TT 역상업 DNA 합성기에서 T GTT TTT G-3 '. 프로브 시퀀스 5' TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC를 구입 [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 '상업 소스. 사용하기 전에 10 μM의 농도로 분주 4 ° C에서 모든 프라이머 및 프로브를 저장합니다.
   참고 : qRPA 분석은 고유 한 HIV-1 서열을 증폭한다. 이 개념 증명 분석의 경우, 서튼 등. 표적 서열 ^(16)를 포함하여 기술 된 플라스미드, φ-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr를 사용합니다. qRPA 실험에, 플라스미드는 pH가 8.0에서 10 mM 트리스, 0.1 mM의 EDTA를 함유하는 완충액 μL 당 1, 10, 10 ^2, 10 ^3, 및 ¹⁰⁴ 카피를 함유하는 분취 액을 4 ℃에서 저장 하였다 한 NG / μL 인간 게놈 캐리어 DNA (360486). 이 캐리어 DNA 농도는 HIV-1 ^(17)의 진단에 사용되는 상업용 혈청 DNA 추출 키트로부터 얻어진 DNA의 농도에 상응한다. 이 HIV-1qRPA 반응에서 템플릿 표준 곡선을 구축하기 희석액으로 사용 하였다.

3. HIV-1 qRPA 표준 곡선을 조립

1. 단계 2.1.1에서 설명 된 바와 같이 qRPA 반응을 조립하기 전에, 미리 증폭 작업을 준비한다. 4 ° C에 보관되어있는 96 웰 차가운 블록을 놓습니다.
2. (12) 반응에 시약을 준비합니다
   1. 마그네슘 아세테이트, 재수 버퍼 및 사전 증폭 작업 공간 (12) RPA 반응 알약을 이동합니다.
   2. 마그네슘 아세테이트 및 실온에서 재수 버퍼 해동.
   3. 분취 microcentrifuge 관 마그네슘 아세테이트 32.5 μL (반응 당 2.5 μL).
   4. 13 배 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스에 대한 별도의 microcentrifuge 관에 재수 버퍼의 383.5 μl를 (반응 당 29.5 μL)를 추가합니다. 마스터 믹스에 뉴 클레아 무료 물 41.6 μL (반응 당 3.2 μL)를 추가합니다. 마스터 믹스를 흔든다.
   5. 마그네슘 aceta를 돌려줍니다-20 ° C에서 저장 장치로 테와 재수 버퍼.
   6. 광표백을 최소화하기 위해 과도한 빛에 노출을 피하고, 사전 증폭 영역 냉장고에서 프라이머 및 프로브 분량 씩 이동합니다.
   7. 앞으로 10 μM의 각각 27.3 μl를 추가하고 마스터 믹스 프라이머 (반응 당 프라이머 당 2.1 μl를) 역.
   8. 마스터 믹스에 10 μM의 HEX 표지 HIV-1 DNA 프로브 7.8 μL (반응 당 0.6 μL)를 추가합니다.
   9. 프라이머를 반환 및 저장에 프로브.
3. 1.2 절에 설명 된 플레이트 레이아웃을 매칭, 2 저층 8 웰 PCR 튜브 스트립의 5 오른쪽 튜브에서 각각 맨 왼쪽 튜브의 각 1 효소 펠릿 1 효소 펠렛을 배치합니다.
4. 조심스럽게 각 튜브에 대한 새로운 피펫 팁을 사용하여 펠릿이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 팁과 마스터 믹스와 펠렛을 교반, 효소 펠렛을 포함하는 각 튜브에 마스터 믹스의 37.5 μl를 추가합니다. 거품 formati을 방지하기 위해 부드럽게 저어에, 그리고 반응 부피의 손실을 방지하기 위해주의 깊게 제거 팁.
5. 모든 효소 펠렛 마스터 믹스 재수 화 한 후, 4 ° C에서 저장 영역에서 96 웰 차가운 블록을 검색 할 수 있습니다. 마스터 믹스를 진정 차가운 블록에서 PCR 튜브 스트립을 놓습니다.
6. 마스터 믹스 냉각되는 동안, 제 1 항에 기재된 프로토콜과 접시 서열 증폭기 소프트웨어를로드.
7. PCR 튜브보다 약간 넓게 투명한 플라스틱 마이크로 씰 접착제의 두 조각을 잘라, 그리고 2 개의 평면 PCR 튜브 스트립 뚜껑을 검색 할 수 있습니다.
8. (마이크로 리터 당 HIV-1 플라스미드를 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ 복사본을 포함 함) 저장 부로부터 6 템플릿 분취 검색.
9. 해당 템플릿 농도에 대해 지정된 튜브에 각 서식의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 마스터 믹스와 템플릿을 혼합 할 수있는 팁과 솔루션을 교반, 각 튜브에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다. m에 올바른 위치로 템플릿을 추가해야합니다1.2 절에 설명 된 플레이트 레이아웃을 ATCH.
10. 마이크로 원심을위한 PCR 튜브 스트립 어댑터가 제자리에 있는지 확인합니다.
11. qRPA 반응을 포함하는 튜브에 배치 될 각 관 덮개로 아세트산 마그네슘 2.5 μl를 분주한다.
12. 부드럽게 그들이 완전히 밀봉되지 않고 제거 될 수 있도록 PCR 튜브의 상부에 덮개를 배치했다. 마그네슘 아세테이트는 뚜껑을 준수하고 위에서 명확하게 볼 수 있습니다.
13. PCR 튜브 홀더의 각 측면에 뚜껑 각 PCR 튜브 스트립을 삽입합니다. RPA 반응을 시작, 뚜껑에서 그리고 RPA 반응에 마그네슘 아세테이트 스핀 minifuge의 뚜껑을 닫습니다. 모든 거품이 제거되고 모든 액체가 각각의 튜브 (약 10 초)의 저부에 수집 될 때까지 원심 분리기.
14. 신속하게 PCR 튜브 스트립을 제거하고 qRPA 반응을 중단 추위 블록에 반환.
15. 조심 에어로졸이 형성되지 않도록 뚜껑을 제거하고 잘라 각 PCR 튜브를 밀봉 스트립분명 마이크로 밀봉 필름의 조각.
16. 빨리 열 자전거 타는 사람에 걸어 플레이트 레이아웃 (우물 A1-B8)에 일치하는 위치에서 열 자전거 타는 사람에 두 개의 PCR 튜브 스트립을로드합니다. , 열 자전거 타는 사람의 뚜껑을 닫습니다 "시작 실행"을 클릭하고 실험을 위해 파일 이름을 지정합니다.
    주 : 제조자가 5 분 인큐베이션 후 샘플을 교반 권장하지만,이 단계는 특정 분석에 필요한 아니며 생략 될 수도있다.
17. 실행이 완료되면, 원시 형광 데이터를 표시하는 "설정", "베이스 라인 설정", "아니오 기준 빼기"를 선택합니다. 선택하여 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 보냅니다 "내보내기", "Excel로 모든 데이터 시트를 보냅니다."파일을 부록으로 "정량 증폭 결과"원시 실시간 형광 데이터를 포함하는 생성됩니다.

4. 내부 긍정적 인 컨트롤 개발

1. 타겟 샘플에서 발견 될 가능성이 종으로부터 DNA 서열을 선택한다. 서열은 표적 서열의 발생이 선호되도록 목표 앰플 리콘보다 길게 할 필요가있다.
   참고 :이 유기체가 혈액에서 발견 할 수있는 가능성이 다른 프로젝트의 실험실에서 사용할 수 있기 때문에이 분석, 작은와 포자충, 장내 기생충의 경우, IPC 시퀀스의 생성을위한 템플릿으로 제공하기 위해 선택되었다. IPC 시퀀스를 생성하기 위해 추출 C.로부터 DNA를 정제 포자충의 오오 시스트는 다른 ¹⁸ 설명했다.
2. 앞으로 구입 (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA AT & T TTA AAA GAA AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') 및 역방향 (5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') 상용 소스에서 프라이머. 이 분석에 사용 된 PCR 프라이머 IPC는도 1에 도시 된 IPC 템플릿 D 상보 인 하나의 영역이 포함되어있다NA (예를 들어, 그림 1의 보라색 C. 포자충) 대상 유기체 무료이며, 한 지역 (예를 들면, HIV-1, 그림 1에서 파란색).
3. 프라이머 및 IPC 템플릿 DNA를 사용하여 PCR을 수행합니다.
   1. 폴리머 제외한 제조업체의 지시에 따라 Phusion 고성능 DNA 중합 효소 시약 키트를 사용하여 50 ㎕의 PCR 반응을 조립한다. DNA 템플릿 및 Phusion 버퍼 HF의 2 μl를 사용합니다.
   2. 98 ° C, 62 ° C에서 30 초, 72 °에서 30 초에서 15 초 40주기 다음 98 ℃에서 60 초 다음에 98 ° C에서 핫 스타트, 후 각 반응에 Phusion 중합 효소 추가 5 분 72 ° C에서 최종 확장자를 가진 C. 열 사이클링 후, 4 ℃에서 시료를 개최합니다.
   3. 2 % TAE 아가 로스 겔상에서 전기 영동에 의해 시료를 분석 한 후 추출하여 미세 원심 프로토콜이 포함 따른 인 QIAquick 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제키트.
4. qRPA를 사용하여 증폭 할 수있는 능력에 대한 IPC 후보를 화면.
   1. 3 절에 설명 된대로 IPC (5'-AGG의 TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 특정 HIV-1 프라이머, FAM 표지 프로브를 사용하여, qRPA 반응을 준비 0의 GGT GTA TTT GGA ATT -3 '), 및 총, 10, 10 ^2, 10 ^3, 모든 농도에서 중복 시험을 각 반응 당 IPC 후보, 10 ^(4), 또는 ¹⁰⁵ 복제본.
   2. 가장 지속적으로 증폭하고 하한-의 감지가 IPC 후보를 선택합니다.
5. IPC DNA의 최적 농도를 결정하는 HIV-1 및 IPC 공동 증폭.
   1. 재수 버퍼의 29.5 μL, 정방향 프라이머 [10 μM]의 RPA의 2.1 μL, RPA의 2.1 μL 프라이머 [10 μM]을 역, HIV-1 HEX의 0.6 μl를 : 3 절과 마찬가지로, 각 50 μL 반응에 다음과 같은 결합 표지 된 프로브 [10 μM, 10 μLHIV-1에 다양한 농도의 DNA, 아세트산 마그네슘 2.5 μL, 1 효소 펠릿. 대신 IPC FAM 표지 프로브 [10 μM]의 0.6 μL, 그리고 IPC DNA의 2.6 μl를 추가, 단계 3.2.4에서 수행되면서 뉴 클레아 무료 물 3.2 μl를 추가. qRPA 단독 IPC의 DNA (형광 신호 생성의 양으로 샘플에 의해 생성 된 형광에 의해 생성 된 것보다 큰 최소 농도로 정의 LOD 행하는 경우는 리밋의 검출 (LOD)는 IPC 농도를 사용 어떤 대상 DNA 없음).
   2. 1.1 절에 설명 된 프로토콜을 사용하여 샘​​플을 인큐베이션.
   3. IPC가 모든 샘플에서 증폭하지 않는 경우, 더 높은 크기의 IPC 농도 한 순서로 실험을 반복하는 것이 좋습니다. HIV-1 분석을위한 IPC의 DNA의 최적 농도는 10,000 복사 / μL이다. 어느 IPC 또는 HIV-1 DNA 증폭이있는 경우 샘플이 유효한 것으로 간주되는 동안, 이상적으로는 IPC 대한 검출 가능한 증폭을 나타낸다모든 반응.

5. 여러 실험에서 표준 곡선을 구축

1. 3.13 절에 설명 된대로 각 실험은 스프레드 시트 프로그램으로 내 보낸에 대한 데이터를 확인합니다.
2. 열기 및 스크립트 "JoVE_qRPA_standard_curve.m"를 실행합니다. 모든 입력이 자동으로 명령 창에 메시지가 표시됩니다. 스크립트가 시작된 후, 사용자가 자동​​으로 "데이터 파일 번호"를 지정하도록 프롬프트되는 표준 곡선을 작성하는 데 사용.
3. 명령 창에서 파일의 수는 입력 표준 곡선을 누릅니다을 구축하는 데 사용할 수를 입력합니다.
4. 명령 창에서 샘플의 수와 (각 항목을 입력 한 후 Enter 키를 누르) 각 교육 파일에서 반복 실험의 번호를 입력합니다.
   주 : 1.2 절에 설명 된 플레이트 레이아웃에서, 상이한 농도의 6 샘플 및 각 샘플의 2 회 반복)이 있었다.
5. 명령 창 가장 낮은 DN을 입력입력 (LOG10 복사본) 표준 곡선을 구축하고 언론에 사용되는 농도 (1.2 절에 설명 된 플레이트 레이아웃은, 가장 낮은 서식 농도는 '1'LOG10 사본입니다).
6. 명령 창에 입력 (LOG10 사본에) 각 표준 간의 농도 차이 다음 enter 키를 누릅니다는 (1.2 절에 설명 된 플레이트 레이아웃, 농도 간격은 '1'LOG10 사본입니다).
7. 메시지 후, 명령 창에서 "기울기 임계 값"을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
8. 명령 창에서 "수 (Z) 긍정적 인 임계 값에 대한 배경 위의 표준 편차"를 입​​력하고 Enter 키를 누릅니다. 1-5 Z 범위에 대한 일반적인 값.
9. 지정 데이터는 서열 증폭기 ( '1')를 사용하여 수집 하였다 여부 * .TIFF 현미경 이미지 ( '2'), 또는 * 숫자 '1'이 입력하여 .JPG 현미경 이미지 ( '3') ' 또는 '3'및 Pressing을 입력합니다.
10. 새로운 IPC 임계 값을 설정하거나 메시지가 표시되면, 각각 ', N'또는 'y'를 입력하여 임계 값에 대한 기본 값을 사용하도록 선택합니다.
11. 다음에, 표준 곡선을 작성하는 데 사용되는 스프레드 시트 파일을 각각 선택한다.
    참고 : 스크립트가 자동으로 HEX 및 FAM 형광 데이터를 가져옵니다; 각각의 반응물 (형광 신호가 HEX 또는 FAM 채널 임계 값을 초과하는지 여부, IE) 유효 여부를 결정하고; 지수, 선형 대 ^(R)이 계수를 결정하고, 2 차 다항식 피팅; 플롯 표준 곡선을 작성하는 데 사용되는 모든 샘플에 대해 "사이클 임계 대 LOG10 복사"; 다시 입력 파라미터 모두를 재 입력 할 필요없이 사용자의 검증 실험에 대한 표준 곡선을 재 구축하는 것이 필수적 변수를 포함하는 스프레드 시트 파일을 생성한다.

6. 분석 검증 및 사용하여 미지 시료의 정량표준 곡선

1. 공지 된 농도의 샘플을 사용하여 분석의 정밀도 및 정확도를 추정 또는 미지 농도의 시료를 정량화하는 데 사용하는 스크립트 "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"를 사용.
   참고 : 이전에 출판 된 연구는 지수 맞는 최고의 R 제곱 계수 ^(18)를 산출 것으로 나타났다 때문에,이 스크립트는 표준 곡선 지수 피팅을 사용한다. 착용감의 다른 유형을 원하는 경우, 스크립트는 적절히 변경 될 수있다.
   1. 열기 및 스크립트 "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"를 실행합니다. 스크립트가 시작되면, 사용자는 자동으로 명령 창에 모든 입력을 입력하라는 메시지가 표시됩니다.
   2. 엔터 '1'로 알려진 샘플 농도는 표준 곡선을 사용하여 분석의 유효성을 검사하거나 입력 할 '2'미지 시료를 정량화.
   3. 메시지가 표시되면, 하나 저장된 표준 곡선을 선택하거나 일을 입력하여 새로 구축자동으로 명령 창에 유혹되어 전자 정보 (5 절에서 "JoVE_qRPA_standard_curve.m"스크립트에 필요한 정보와 동일).
   4. 실험의 번호를 입력 (예, 스프레드 시트 파일) 검증 / 정량 분석합니다.

형광 현미경 및 온수 칩을 사용하여 데이터 수집 7. 준비

1. 형광 현미경은 장소에 무대 히터 1 채널 정밀 높은 안정성 온도 컨트롤러가 있어야합니다.
2. 형광 현미경을 확인하는 것은 흥분과 각 형광에서 형광을 수집하는 필터 큐브를 가지고있다. 흥분과 GFP 필터 (여기 BP 40분의 470 nm의, 방출 BP 50분의 520의 ㎚)를 통해 IPC DNA 증폭시 발생 FAM 형광를 수집합니다. 흥분과 HEX 필터 (여기 BP 30분의 530 nm의, 방출 BP 40분의 575의 ㎚)을 통해 HIV-1 DNA 증폭 중에 생성 된 HEX의 형광을 수집합니다.
3. 열 자전거 타는 사람에 대한 데이터 수집을 복제하는 자동화 된 알고리즘을 생성하기 위해 현미경 스크립트 편집 소프트웨어를 사용합니다.
   1. 먼저 셔터를 닫습니다 "설정"단계를 삽입합니다. 다음 60 초에 노출을 설정할 수있는 "노출"단계를 추가합니다. 1 분 사전 잠복기를 구현하는 60 초 지연을 실행하기 위해 "스냅"를 삽입합니다. GFP 필터에 작업 그룹을 변경하려면 "설정"단계를 추가합니다. 200 밀리 초에 노출을 조정하는 또 다른 "노출"단계를 삽입합니다. GFP 또는 HEX 필터 큐브를 사용하는 모든 노출은 200 밀리로 설정됩니다.
   2. "노출"단계 후, "스냅"를 추가하고 이미지가 촬영되는 카메라를 지정합니다. 사용자 정의 임시 폴더에 이미지를 저장하기 위해 셔터와 "이미지 저장"단계를 닫습니다 다른 "설정"단계를 사용합니다.
   3. 또 다른 "설정"단계 및 제를 사용하여 HEX 필터 큐브 옆에 스위치EN은 "스냅"200 밀리 초,에서 "노출"를 추가하고 "이미지 저장"단계.
   4. 대신 60 (가까운 셔터 20 초 초기 지연이 과정을 59 회 반복 20 초, GFP 필터 큐브로 전환, 200 밀리 초에 설정 한 노출을 기다립니다, 스냅, 가까운 셔터, HEX 필터 큐브로 전환, 설정 노출, 저장 200 밀리 초에,) 스냅인.
4. qRPA 반응을 개최한다 칩을 만듭니다.
   1. 현미경을 사용하는 실험에서, 파일 JoVE_qRPA_base.ai 100 % 전력, 10 % 속도로 설정 레이저 커터를 사용하여 1/8 "두께의 흑색 아크릴 시트로부터 40 X 15mm 직사각형 기부를 절단하는 데 사용할.
   2. 물론 1.5 mm 두께의 투명 아크릴 시트에서 5 mm 직경의 원형 구멍 컷 10 × 10mm의 정사각형으로 이루어진 반응을 차단하기 위해 파일 JoVE_qRPA_well.ai을 사용합니다.
   3. superglue 젤을 사용하여 하나의베이스에 세 개의 우물까지 연결합니다.
   4. 드라이 하룻밤.

8. 데이터 수집 및 AnalySIS 형광 현미경을 사용하여

1. 자동 데이터 수집 스크립트 JoVE_AxioVision_Script.ziscript를로드하여 데이터 수집을위한 현미경을 준비합니다.
   1. 48 ° C 스테이지 히터 설정하고 약 20 분 동안 스테이지 히터 반응 칩을 예열한다. 48 ° C의 온도 설정이 잘 반응에서 39 ° C의 온도를 유지한다 (데이터는 보이지 않음).
   2. 10X, NA 0.45의 대물 렌즈를 사용하여, 반응 웰 제자리에 GFP 필터의 안쪽 가장자리의 상단에 초점. 아크릴의 가장자리는 레이저 절단 후 autofluorescent하고 쉽게 시각화 할 수있다. 모든 데이터가 수집 될 때까지 포커싱 후에 현미경 스테이지의 높이를 조정하지 않는다.
2. 단계 4.5.1에​​ 설명 된대로 지정 사전 증폭 작업 공간의 qRPA 마스터 믹스를 조립합니다. 각 샘플의 경우, microcentrifuge 관에서 효소 펠렛, 마스터 믹스 및 HIV-1 DNA 템플릿을 섞는다. 첫 번째 reactio에 마그네슘 아세테이트 2.5 μl를 추가N 간략하게 소용돌이.
3. 빠르게 형광 현미경에 qRPA 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관을 운반 할 것.
   1. 조심스럽게 잘 거품을 만들지 않고 반응에 RPA 반응의 30 μl를 피펫. 증발을 방지하기 RPA 반응 위에 PCR 등급의 미네랄 오일 방울을 놓는다.
   2. 잘 만 중심이 아닌 자동 형광 아크릴 가장자리의 모든 이미지에주의하면서 현미경 목표 아래 아니라 직접 놓습니다. 잘가 배치 후 스크립트는 FAM 필터 큐브와 HEX 필터 큐브마다 20 초를 사용하여 하나의 JPEG 이미지를 사용하여 하나의 JPEG 이미지를 생성 7. 자동화 된 스크립트를 실행합니다.
4. 스크립트가 완료되면, 추가 샘플을 실행하기 전에 임시 저장 폴더에서 이러한 이미지를 전송.
   1. 2 폴더 만들기 : 1을 각각 형광 (즉, 'HEX'와 'FAM')를 참조하십시오. 같은 부모 폴더에 두 폴더를 저장합니다. 각각의 형광에서폴더는 샘플 (예를 들면, 0, 10, 등)에 존재하는 DNA 매수로 표지 폴더를 생성한다.
   2. 'HEX'폴더에 해당 하위 폴더에 접두사 'HEX'모든 파일을 전송합니다. 'FAM'폴더에 해당 하위 폴더에 접두사 'GFP'모든 파일을 전송합니다.
5. 0, 10, 10 ^2, 10 ³ 10 ^4, 10 ⁵ HIV-1 DNA와 함께 복사 qRPA 반응 반복 섹션 8.2-8.4.
6. 실험의 모든 qRPA 샘플에 대한 데이터를 수집 한 후, 스크립트에 의해 메시지가 표시되면 ". JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"스크립트를로드 차례로 하위 폴더의 각 농도에 대한 이미지를 포함 2 형광 폴더를 포함하는 상위 폴더를 선택합니다.
   참고 : 스크립트가 자동으로 HEX 형광 데이터 시트에서 남 저장 될 상위 디렉토리에서 스프레드 시트 파일을 생성ED 'HEX', 그리고 FAM 형광 데이터는 'FAM'라는 이름의 시트에 저장됩니다. 각 시트에서, 사이클 넘버 컬럼 B에 나열되고, 템플릿의 농도를 증가시키기위한 실시간 형광 데이터 열 등 C, D,에 주어진다. 각각의 실시간 형광 데이텀 그 시점에서 캡쳐 된 이미지의 평균 형광 강도를 나타낸다.
7. 셀 B2 음모 스프레드 시트 프로그램에서 기본 산점도 함수를 사용하여 'HEX'및 'FAM'시트 H61를 실시간 형광을 시각화하고도 2A, 2B, 3A 및 3B와 유사한 플롯을 생성한다.
   주 : 단계 8.6에서 생성 된 스프레드 시트는 또한 스크립트 "JoVE_qRPA_standard_curve.m"및 "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"에서 사용될 수있다.

Representative Results

Discussion

프롬프트되면 MATLAB 알고리즘을 사용하여 의미있는 정량화 된 데이터를 획득하기 위해, 사용자는 해당 입력 값을 선택한다. 제 5,6의 각 스크립트를 개시 한 후, 모든 입력 변수는 자동 명령 창에서 요청 된 것으로 출력이 자동으로 생성된다. 5.7 절에서는 사용자가 기울기 임계 값을 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 경사의 문턱 값은 착용감 상관 계수 (R ^2)의 제곱에 영향을 미친다. 열 사이 클러에서 반출 형광 원시 데이터를 사용하는 경우, 2.0와 5.0 사이의 값은 높은 계수 R ^2를 수득하는 경향이있다. 5.8 절에 사용자가 긍정적 인 임계 값을 설정하는 배경 위로 표준 편차의 수를 지정해야한다. 양 또는 음으로 샘플을 점수로 스크립트가 자동으로 화력에서 내 보낸 원시 형광 데이터를 사용하여 각 샘플에 대한 최대 및 최소 형광 사이의 차이 Δ _샘플을 결정한다L 자전거 타는 사람. 그것은 모든없는 목표 제어 샘플의 평균 차이 Δ _배경 및 표준 편차 σ _배경을 계산합니다. Δ _샘플 Δ _배경 위에 σ _배경 × Z보다 더 많은 경우 샘플은 긍정적 인 것으로 간주됩니다. 5.10 절에서 사용자는 디폴트 임계 값을 사용하거나 새로운 임계 값을 설정할지 여부를 결정한다. 사용자가 새로운 임계 값을 설정하기를 원하는 경우, 어떤 실험 HIV-1 DNA를 본 실험없이 3 각 함유 12 RPA 반응을 수행하여 새로운 임계 값을 결정한다. 이 실험 플러스 3 표준 편차에서 형광 강도의 평균 증가 임계 값을 설정합니다. 6 절을 완료 한 후, 스크립트 JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m 자동 (LOG10 사본에) 각 qRPA 반응에 대한 예상 DNA 농도를 반환합니다. 스크립트가 더 HIV-1 DNA 샘플에 존재하지 않는 것으로 판정 한 경우, 상기 추정 된 농도 중 "네으로 나열내부 양성 대조군의 형광 신호 여부에 따라 잘못된 HIV에 대한 gative "또는", "(σ _배경 + Δ _배경 × Z) 임계 값을 초과했습니다. 사용자는 공지 된 샘플 농도는 표준 곡선을 검증하는 경우, 스크립트는 또한 표 1과 유사한 표를 추가로 리턴한다.

정확한 정량을 제공 실시간 RPA 분석을 개발하기 위해, 실험적인 일관성은 중요하다. 예를 들어, 표준 곡선 및 검증 실험 모두에 대해 동일한 프라이머 및 프로브를 사용하여 분취 액. 또한 실험 사이에 4 ° C에서 프라이머 및 프로브 분량을 저장하는 것이 아니라 -20 ° C에 의해 동결 해동 사이클을 피하십시오. 표준 곡선 및 검증 실험에 사용 템플릿 분액 동일한 방식으로 저장된다. 동일 로트 RPA 효소 펠릿 및 시약은 제조 업체의 권장 사항에 따라 사용됩니다. 마지막으로, 베카RPA 정확하게 증폭 율을 제어하는​​ 진정한 '주기'를 사용 부족, 사용자의 표준화 단계는 절대적으로 필수적이다. 반응을 조립할 때, 사용자는 항상 각 단계에 대략 동일한 양의 시간을 보내고, 같은 순서로 같은 단계를 수행한다. 반응은 항상 새로운 피펫 팁으로 부드럽게 혼합되어야하며, 거품은 항상 제거해야합니다. 증폭 전에 반응은 일관된 온도를 유지해야하며, 서열 증폭기 또는 현미경 소프트웨어는 항상 정량에 영향을 줄 수있는 준 최적 온도에서 임의의 증폭을 방지하기 위해 반응을 넣기 전에 준비되어야한다. 초기 반응 조건의 모든 변화는 실험 결과의 불일치가 발생할 수 있습니다.

데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 추가 변수는 형광 강도의 변화를 최소화하도록 제어되어야한다. 모든 반응은 스테이지에 따뜻한 같은 영역에 배치하고, microsco해야체육은 모든 샘플에 대해 잘 같은 지역에 집중해야합니다. 이러한 방법을 따르는 경우에도 현미경 상에 수집 형광 데이터 인해 자연스럽게 여기 광에 반복 노출에 기인 RPA 반응, 반응 챔버 내의 기포 형성 또는 광표백 중에 형성 로컬 휘점에 가변성을 나타낼 수있다. 이러한 변수들의 영향은 기저선 변동, 최고점과 최저점을 보여 현미경 (도 4a 및도 4b)에 수집 된 형광 데이터에서 분명하다. 이러한 기능은 서멀 사이 클러 (도 3a 및 3b) 상에 수집 된 데이터로부터 형광 존재하지 않는다. 궁극적으로, 현미경에 데이터 수집은 원칙의 증명 목적되고 최종 분석은보다 정확한 형상과 이들 변수를 최소화 소프트웨어 제어와 계자 동작 가능한 형광 판독기상에서 구현 될 것이다.

또 다른 중요한qRPA 분석법 개발 프로세스의 측면은 데이터 처리의 일관성이다. 방법 절에 설명 된 프로토콜은 서열 증폭기 또는 현미경에서 수집 (스프레드 시트 파일에 저장된) 형광 원시 데이터를 처리하는 스크립트를 사용한다. 표준 곡선을 작성하는 데 사용되는 모든 실험은 동일 포맷해야합니다. 데이터를 수집하기 위해 써멀 사이 클러를 사용하는 경우, 동일한 플레이트 레이아웃이 사용되어야하며, RPA 반응에 포함되지 않은 웰로부터의 데이터를 내보낼 수 안된다. 데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 데이터의 형태를 자동 유전자 증폭기에서 반출 된 데이터의 포맷과 일치한다. D61, E2 : 세포에서 D2 있어야 주형의 농도를 증가 C61, 데이터 예를 들어, 노 타겟 제어 데이터는 셀 C2에 있어야 실험의 각 농도의 다중 복제물이 있으면 E61 등 2 ^차 복제 희석 시리즈는 높은 농도에 어떤 목표 제어 (NTC) 왼쪽에서 오른쪽으로 주문해야하고¹ 일의 바로 오른쪽에있는 컬럼에 저장 희석 시리즈를 복제합니다. 예를 들어, 2와 1.2 절에 사용되는 판 레이아웃에 희석 시리즈의 각 샘플의 첫 번째 복제에 대 한 형광 데이터 셀 (C2)에 저장해야합니다, 각 샘플에 대해 복제 : H61 및 형광 데이터를 각 샘플의 2 차 복제에 대한 희석 시리즈는 세포 I2에 저장해야합니다 : N61. 1.2 절에 사용되는 플레이트 레이아웃의 경우,이 스프레드 시트에 열 자전거 타는 소프트웨어에서 데이터를 내보낼 때 기본 서식입니다.

HIV-1 qRPA 실험으로부터 제공 RPA는 대표 데이터가 미지 시료의 핵산 농도의 정량 분석​​을 위해 사용될 수있다 개념 증명 지원을 보여준다. 임상 적으로 유용한 HIV-1 바이러스 부하 테스트는 크기의 최소 4 주문의 임상 범위, 0.5 LOG10 사본의 정밀도, 적어도 200 사본 ^{(19, 20)의} 한계-의 검출이있다. 기재된 HIV-1 DNA 분석이 CR을 충족iteria 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 저농도 가장 정확하게된다. 따라서, 역전사 단계의 포함으로, 이러한 결과는 HIV-1 RT-RPA 분석은에서 HIV-1 바이러스 양을 측정 할 수있는 잠재력을 가질 수 있음을 시사 임상 샘플. 알고리즘 파라미터를 조정 qRPA 분석법을 개발하는 경우 조정 임상 필요에 따라 감도 및 선형 동적 범위를 할 수있다. (6) (양의 샘플에 대한 임계 값을 결정하는 파라미터) (Z)를 조정하는 하위 및 상위의 감도 및 정확도에 영향을 미칠 수 있음을 보여주고 목표 농도. 또한, 이에 의해 증폭 율을 감소, 낮은 온도에서 반응을 배양 이하 아세트산 마그네슘을 사용하여 정량의 해상도와 정확도를 증가시킬 수있다.

qRPA 개념 분석이 증명은 HIV-1 DNA를 함유하는 샘플의 농도를 정량화하는데 사용될 수있다. 이 MA에서 설명 qRPA 분석법nuscript는 실시간 RPA 반응 조립 개발 IPC 화면 및 미지 시료를 정량화하는데 사용될 수있는 표준 곡선을 구축 형광 원시 데이터를 처리하는 방법에 대한 자세한 설명을 포함한다. 자세한 설명을 포함하여,이 프로토콜은 샘플의 다양한 DNA 농도를 정량화하는 데에 적합 할 수있다.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI