Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
정량적 핵산 증폭 환경, 인성 및 인성 병원균의 검출뿐만 아니라, 임상 적 진단을위한 중요한 기술이다. 실시간 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)는 HIV-1 바이러스 성 부하 테스트 세균성 병원체의 검출 및 다른 많은 생물 한 스크리닝 예를 들면 핵산의 민감하고 특이 및 정량적 검출 금 표준 방법 – 3. 실시간 qPCR의 동안 프라이머 사이클 병원체 DNA를 증폭 및 형광 신호는 각주기에서 증폭 된 DNA 시료의 양에 비례한다고 생성된다. 병원체 DNA의 미지 농도를 함유하는 샘플은 표준 시료의 초기 DNA 농도와 형광 신호가 특정 임계 값에 도달하는 시간 (즉, 사이클 임계치 또는 C의 T)에 관한 표준 곡선을 사용하여 정량화 될 수있다.
<p class=실시간 qPCR의 이러한 재조합 효소 증폭 (RPA)의 결과로서, 대안 등온 증폭 기술을 수신하기 위해 고가의 열 순환 장치와 몇 시간이 필요하기 때문에 "jove_content는"> 4, 개발되어왔다. 이러한 플랫폼은 일반적으로 더 빠른 결과를 제공하고 덜 비싼, 간단한 장치로 달성 될 수있는 저급 단일 온도에서 핵산을 증폭. , 현장 진료 응용 프로그램에 특히 매력적인 분 안에 DNA를 증폭 RPA는 낮은 증폭 온도 (37 ° C)를 필요로하고, 불순물 5,6의 존재에 활성 상태로 유지됩니다. 12 – RPA 분석법은 biothreat 제 7의 식품 분석, 병원균 검출, 항암제 스크리닝 및 검출을 포함한 다양한 애플리케이션을 위해 개발되었다. 그러나, 핵산의 정량 RPA를 사용 13,14 한정되었다.이전의 연구에서는 웃음이었다WN 그 실시간 정량적 RPA (qRPA)는 15 가능하다. 여기서, 상세한 프로토콜은 표준 곡선을 사용하여 정량화 qPCR에 유사 방법을 사용하여 미지 시료를 정량화 실시간 정량적 RPA를 사용하기 위해 제공된다. 이 프로토콜은 제대로 작동하는 시스템을 보장하기 위해 내부 양성 대조군 (IPC)를 개발하는 방법뿐만 아니라, 개념 증명으로 HIV-1 DNA를 검출하기 위해 열 자전거 타는 사람에 RPA 반응을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 트레이닝 데이터를 이용하여 표준 곡선을 구성하기위한 서열 증폭기 또는 현미경과 데이터 분석에 의한 데이터 수집은 또한 상술된다. 마지막으로, 커스텀 스크립트 표준 곡선을 사용하여 미지 시료 정량법이 설명된다. 이 qRPA 기술은 미지 농도와 시료의 정량 분석을 가능하게하고 기존의 실시간 qPCR에 비해 많은 장점이 있습니다.
1. 프로그램 실시간 qRPA의 반응에 대한 열 자전거 타는 사람
2. HIV-1 qRPA 실험 준비
3. HIV-1 qRPA 표준 곡선을 조립
4. 내부 긍정적 인 컨트롤 개발
5. 여러 실험에서 표준 곡선을 구축
6. 분석 검증 및 사용하여 미지 시료의 정량표준 곡선
형광 현미경 및 온수 칩을 사용하여 데이터 수집 7. 준비
8. 데이터 수집 및 AnalySIS 형광 현미경을 사용하여
프롬프트되면 MATLAB 알고리즘을 사용하여 의미있는 정량화 된 데이터를 획득하기 위해, 사용자는 해당 입력 값을 선택한다. 제 5,6의 각 스크립트를 개시 한 후, 모든 입력 변수는 자동 명령 창에서 요청 된 것으로 출력이 자동으로 생성된다. 5.7 절에서는 사용자가 기울기 임계 값을 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 경사의 문턱 값은 착용감 상관 계수 (R 2)의 제곱에 영향을 미친다. 열 사이 클러에서 반출 형광 원시 데이터를 사용하는 경우, 2.0와 5.0 사이의 값은 높은 계수 R 2를 수득하는 경향이있다. 5.8 절에 사용자가 긍정적 인 임계 값을 설정하는 배경 위로 표준 편차의 수를 지정해야한다. 양 또는 음으로 샘플을 점수로 스크립트가 자동으로 화력에서 내 보낸 원시 형광 데이터를 사용하여 각 샘플에 대한 최대 및 최소 형광 사이의 차이 Δ 샘플을 결정한다L 자전거 타는 사람. 그것은 모든없는 목표 제어 샘플의 평균 차이 Δ 배경 및 표준 편차 σ 배경을 계산합니다. Δ 샘플 Δ 배경 위에 σ 배경 × Z보다 더 많은 경우 샘플은 긍정적 인 것으로 간주됩니다. 5.10 절에서 사용자는 디폴트 임계 값을 사용하거나 새로운 임계 값을 설정할지 여부를 결정한다. 사용자가 새로운 임계 값을 설정하기를 원하는 경우, 어떤 실험 HIV-1 DNA를 본 실험없이 3 각 함유 12 RPA 반응을 수행하여 새로운 임계 값을 결정한다. 이 실험 플러스 3 표준 편차에서 형광 강도의 평균 증가 임계 값을 설정합니다. 6 절을 완료 한 후, 스크립트 JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m 자동 (LOG10 사본에) 각 qRPA 반응에 대한 예상 DNA 농도를 반환합니다. 스크립트가 더 HIV-1 DNA 샘플에 존재하지 않는 것으로 판정 한 경우, 상기 추정 된 농도 중 "네으로 나열내부 양성 대조군의 형광 신호 여부에 따라 잘못된 HIV에 대한 gative "또는", "(σ 배경 + Δ 배경 × Z) 임계 값을 초과했습니다. 사용자는 공지 된 샘플 농도는 표준 곡선을 검증하는 경우, 스크립트는 또한 표 1과 유사한 표를 추가로 리턴한다.
정확한 정량을 제공 실시간 RPA 분석을 개발하기 위해, 실험적인 일관성은 중요하다. 예를 들어, 표준 곡선 및 검증 실험 모두에 대해 동일한 프라이머 및 프로브를 사용하여 분취 액. 또한 실험 사이에 4 ° C에서 프라이머 및 프로브 분량을 저장하는 것이 아니라 -20 ° C에 의해 동결 해동 사이클을 피하십시오. 표준 곡선 및 검증 실험에 사용 템플릿 분액 동일한 방식으로 저장된다. 동일 로트 RPA 효소 펠릿 및 시약은 제조 업체의 권장 사항에 따라 사용됩니다. 마지막으로, 베카RPA 정확하게 증폭 율을 제어하는 진정한 '주기'를 사용 부족, 사용자의 표준화 단계는 절대적으로 필수적이다. 반응을 조립할 때, 사용자는 항상 각 단계에 대략 동일한 양의 시간을 보내고, 같은 순서로 같은 단계를 수행한다. 반응은 항상 새로운 피펫 팁으로 부드럽게 혼합되어야하며, 거품은 항상 제거해야합니다. 증폭 전에 반응은 일관된 온도를 유지해야하며, 서열 증폭기 또는 현미경 소프트웨어는 항상 정량에 영향을 줄 수있는 준 최적 온도에서 임의의 증폭을 방지하기 위해 반응을 넣기 전에 준비되어야한다. 초기 반응 조건의 모든 변화는 실험 결과의 불일치가 발생할 수 있습니다.
데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 추가 변수는 형광 강도의 변화를 최소화하도록 제어되어야한다. 모든 반응은 스테이지에 따뜻한 같은 영역에 배치하고, microsco해야체육은 모든 샘플에 대해 잘 같은 지역에 집중해야합니다. 이러한 방법을 따르는 경우에도 현미경 상에 수집 형광 데이터 인해 자연스럽게 여기 광에 반복 노출에 기인 RPA 반응, 반응 챔버 내의 기포 형성 또는 광표백 중에 형성 로컬 휘점에 가변성을 나타낼 수있다. 이러한 변수들의 영향은 기저선 변동, 최고점과 최저점을 보여 현미경 (도 4a 및도 4b)에 수집 된 형광 데이터에서 분명하다. 이러한 기능은 서멀 사이 클러 (도 3a 및 3b) 상에 수집 된 데이터로부터 형광 존재하지 않는다. 궁극적으로, 현미경에 데이터 수집은 원칙의 증명 목적되고 최종 분석은보다 정확한 형상과 이들 변수를 최소화 소프트웨어 제어와 계자 동작 가능한 형광 판독기상에서 구현 될 것이다.
또 다른 중요한qRPA 분석법 개발 프로세스의 측면은 데이터 처리의 일관성이다. 방법 절에 설명 된 프로토콜은 서열 증폭기 또는 현미경에서 수집 (스프레드 시트 파일에 저장된) 형광 원시 데이터를 처리하는 스크립트를 사용한다. 표준 곡선을 작성하는 데 사용되는 모든 실험은 동일 포맷해야합니다. 데이터를 수집하기 위해 써멀 사이 클러를 사용하는 경우, 동일한 플레이트 레이아웃이 사용되어야하며, RPA 반응에 포함되지 않은 웰로부터의 데이터를 내보낼 수 안된다. 데이터를 수집하기 위해 현미경을 사용하는 경우, 데이터의 형태를 자동 유전자 증폭기에서 반출 된 데이터의 포맷과 일치한다. D61, E2 : 세포에서 D2 있어야 주형의 농도를 증가 C61, 데이터 예를 들어, 노 타겟 제어 데이터는 셀 C2에 있어야 실험의 각 농도의 다중 복제물이 있으면 E61 등 2 차 복제 희석 시리즈는 높은 농도에 어떤 목표 제어 (NTC) 왼쪽에서 오른쪽으로 주문해야하고1 일의 바로 오른쪽에있는 컬럼에 저장 희석 시리즈를 복제합니다. 예를 들어, 2와 1.2 절에 사용되는 판 레이아웃에 희석 시리즈의 각 샘플의 첫 번째 복제에 대 한 형광 데이터 셀 (C2)에 저장해야합니다, 각 샘플에 대해 복제 : H61 및 형광 데이터를 각 샘플의 2 차 복제에 대한 희석 시리즈는 세포 I2에 저장해야합니다 : N61. 1.2 절에 사용되는 플레이트 레이아웃의 경우,이 스프레드 시트에 열 자전거 타는 소프트웨어에서 데이터를 내보낼 때 기본 서식입니다.
HIV-1 qRPA 실험으로부터 제공 RPA는 대표 데이터가 미지 시료의 핵산 농도의 정량 분석을 위해 사용될 수있다 개념 증명 지원을 보여준다. 임상 적으로 유용한 HIV-1 바이러스 부하 테스트는 크기의 최소 4 주문의 임상 범위, 0.5 LOG10 사본의 정밀도, 적어도 200 사본 (19, 20)의 한계-의 검출이있다. 기재된 HIV-1 DNA 분석이 CR을 충족iteria 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 저농도 가장 정확하게된다. 따라서, 역전사 단계의 포함으로, 이러한 결과는 HIV-1 RT-RPA 분석은에서 HIV-1 바이러스 양을 측정 할 수있는 잠재력을 가질 수 있음을 시사 임상 샘플. 알고리즘 파라미터를 조정 qRPA 분석법을 개발하는 경우 조정 임상 필요에 따라 감도 및 선형 동적 범위를 할 수있다. (6) (양의 샘플에 대한 임계 값을 결정하는 파라미터) (Z)를 조정하는 하위 및 상위의 감도 및 정확도에 영향을 미칠 수 있음을 보여주고 목표 농도. 또한, 이에 의해 증폭 율을 감소, 낮은 온도에서 반응을 배양 이하 아세트산 마그네슘을 사용하여 정량의 해상도와 정확도를 증가시킬 수있다.
qRPA 개념 분석이 증명은 HIV-1 DNA를 함유하는 샘플의 농도를 정량화하는데 사용될 수있다. 이 MA에서 설명 qRPA 분석법nuscript는 실시간 RPA 반응 조립 개발 IPC 화면 및 미지 시료를 정량화하는데 사용될 수있는 표준 곡선을 구축 형광 원시 데이터를 처리하는 방법에 대한 자세한 설명을 포함한다. 자세한 설명을 포함하여,이 프로토콜은 샘플의 다양한 DNA 농도를 정량화하는 데에 적합 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
qRPA Assay | |||
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |