멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

Summary

이 프로토콜은 생체 기능화된 프러시안 블루 나노 입자의 합성과 다중 모드 분자 이미징 에이전트로서의 사용을 설명합니다. 나노 입자는 나노 입자 코어 내의 가돌리늄 또는 망간 이온이 MRI 대비를 생성하는 코어 쉘 설계를 가지고 있습니다. 생체 기능 쉘에는 형광 이미징을 위한 형광단과 분자 표적화를 위한 표적 리간드가 포함되어 있습니다.

Abstract

다 모드는, 분자 영상은 여러 상보 이미징 기술을 사용하여, 세포 내 세포 및 분자 수준의 해상도에서의 생물학적 과정을 시각화한다. 이들 조영제 모두 진단 및 치료 효능을 향상 생체 내 경로 및 메커니즘의 실시간 평가를 용이하게한다. 복합 분자 이미징 응용 프로그램에서 사용할 에이전트의 새로운 클래스 -이 문서 biofunctionalized 감청 나노 입자의 합성 (PB 된 NP)에 대한 프로토콜을 제시한다. 나노 입자, 형광 이미징 및 자기 공명 영상 (MRI)에 포함되는 영상 방식이 보완 기능을 갖는다. PB NPS는 가돌리늄, 망간 이온이 T ₁ 및 T ₂ -weighted 서열 모두에서 PB 격자의 격자 간 공간 내에 통합 MRI 콘트라스트를 생성하는 코어 - 쉘 디자인을 갖는다. PB NP에 정전 사용하여 형광 아비딘으로 코팅 자체를-로형광 이미징을 가능하게 sembly. 아비딘 - 코팅 된 나노 입자는 나노 입자에 대한 분자 표적으로 기능을 부여 바이오틴 리간드로 변형된다. 나노 입자의 안정성과 독성은 자신의 MRI의 relaxivities뿐만 아니라, 측정된다. 이러한 NP는 biofunctionalized PB의 복합 분자 이미징 기능이어서 형광 이미징 및 MRI 분자 체외에서 그들을 사용하여 증명된다.

Introduction

분자 영상은 세포, 세포 내에서의 생물학적 과정, 및 분자 수준 ^1의 비 침습성 시각화 및 타겟이다. 분자 영상은 내인성 경로 및 메커니즘은 실시간으로 평가하는 동안 네이티브 미세 환경에 남아 시험편을 허용한다. 일반적으로, 분자 ^영상은이 검토되고, 구상 대상과 관련된 생리 학적 과정을 추적하는 작은 분자, 거대 분자, 또는 나노 입자의 형태로 촬상 외인성 제제의 투여를 포함한다. 분자 영상에서 탐구 된 다양한 영상 방식은 MRI, CT, PET, SPECT, 초음파, photoacoustics, 라만 분광법, 생물 발광, 형광 및 생체 내에 현미경 ^(3)를 포함한다. 조영이 조합 시각화하고 다양한 생물학적 과정과 ^이벤트를 특징 짓는 ^네 능력을 향상 둘 이상의 영상 방식의 조합이다. Multimoda각자의 한계를 보상하면서 ³ L 이미징, 개별 이미징 기술의 장점을 이용한다.

멀티 모드, 분자 이미징 에이전트의 새로운 클래스 -이 문서 biofunctionalized 감청 나노 입자의 합성 (PB 된 NP)에 대한 프로토콜을 제시한다. PB 국민 연금 형광 이미징 및 분자 MRI를 위해 사용된다. PB는 면심 입방 네트워크에서 철 (II), 철 (III) 원자를 교대로 이루어진 안료 (도 1)이다. CN - - 그 삼차원 네트워크 ⁽⁵⁾ 내에서 전하 균형 양이온을 포함 철 ^{III 링키지} PB 격자는 철 시안화물 ^II의 선형 리간드로 구성된다. 그 격자에 양이온을 통합하는 PB의 능력은 별도로 MRI 대비를위한 PB 된 NP에 가돌리늄, 망간 이온을로드하여 이용된다.

MRI 대비를위한 나노 입자 디자인을 추구하기위한 이론적 근거 때문에이다이 디자인의 장점은 현재의 MRI 조영제에 대해 제공한다. US FDA 승인 MRI 조영제의 대부분은 자연에서 상자성이고 스핀 - 격자 완화기구 ^6,7,8 의해 포지티브 대조를 가돌리늄 킬레이트이다. 그 자체로 낮은 신호 강도를 제공하는 단일 가돌리늄 킬레이트 비교해서 나노 입자의 PB 격자 내의 여러 가돌리늄 이온의 혼입은 신호 강도 (양 대비) ^{3,9- 더욱 향상.} 또한, PB 격자 내의 여러 가돌리늄 이온이 존재함으로써, 스핀 - 스핀 완화기구에 의해 음의 콘트라스트를 생성하는 전체적인 스핀 밀도와 그 근방에있는 로컬 자기장 교란 나노 입자의 상자성의 크기를 증가시킨다. 따라서 가돌리늄 함유 나노 입자는 T (긍정적 인) _1과 T ₂ (음) 조영제 ^{(10, 11)} 모두로 작동합니다.

신장 기능이 손상된 환자의 일부에서, 가돌리늄 계 조영제의 투여가 신원 성 전신 섬유증 ^{8,12, (13)의} 발전에 연결되었다. 이러한 결과는 조영제로서 대안 상자성 이온의 사용으로 조사를 묻는 메시지가있다 MRI. 따라서, 나노 입자의 다목적 설계 PB 격자 내에 망간 이온을 포함하도록 구성된다. 가돌리늄 킬레이트와 마찬가지로, 망간은 상자성 킬레이트 및 일반적 MRI ^7,14 양성 신호 강도를 제공하기 위해 사용된다. 가돌리늄 - 함유 PB 된 NP와 같이, 망간 함유 PB NPS는 또한 (포지티브) T ₁ 및 T ₂ (네거티브) 조영제로서 기능.

형광 이미징 기능을 통합하기 위해, 나노 입자 "코어"형광 표지 된 아비딘 당 단백질로 이루어진 "biofunctional"쉘 (도 1로 코팅). 아비딘 아니라 형광 이미징을 가능하게 할뿐만 아니라 특정 세포 및 조직을 대상으로 바이오틴 리간드 도킹 플랫폼의 역할을한다. 아비딘 - 바이오틴 결합은 비오틴과 아비딘 ⁽¹⁵⁾ 사이에 매우 강한 결합 친화도를 특징 강한 알려진, 비 - 공유 결합이다. 아비딘 코팅 PB 국민 연금 바이오틴 리간드의 첨부 파일 PB 국민 연금 분자 타겟팅 기능을 부여한다.

이러한 이미징을 보완 기능을 가지고 있기 때문에 PB NPS를 사용하여 형광 및 MR 영상을 추구 동기입니다. 형광 이미징은 가장 널리 사용되는 광 분자 이미징 기술 중 하나이며, 고감도 ^1,16,17 여러 오브젝트의 시각화를 동시에 허용한다. 형광 이미징은 안전한, 비 침습적 양상이지만 낮은 침투 깊이와 공간 해상도 ^1,3,16와 연관된다. 한편, MRI 높은 시간적 생성D 공간 해상도 비 침습적 방사선 ^{1,3,16 이온화를위한} 필요없이. 그러나 MRI는 낮은 민감도 겪고있다. 따라서 형광 이미징 및 MRI 인해 깊이 침투, 감도 및 공간 해상도의 상호 보완 기능을 분자 영상 기술로 선정되었다.

이 문서에서는 PB 된 NP의 합성 및 biofunctionalization에 대한 프로토콜을 제시, 가돌리늄 함유 PB 된 NP (GdPB), 및 망간 함유 PB 된 NP (MnPB) ^{10, 11을.} 다음과 같은 방법이 설명되어 있습니다 : 1) 크기, 비용의 측정, 나노 입자의 시간적 안정성, MRI의 relaxivities 3) 측정 나노 입자의 세포 독성 2) 평가, 형광 분자 자기 공명 영상을위한 나노 입자의 4) 활용 체외에서 대상 세포의 인구. 이러한 결과들은 생체 내에서 멀티 모달, 분자 영상 화제로서 사용 된 NP의 가능성을 입증한다.

Protocol

PB 된 NP, GdPB 및 MnPB 1. 합성

나노 입자 (NP는 PB, GdPB 또는 MnPB)의 합성은 아래에 설명 된 단계를 수행하여 원 - 포트 (one-pot) 합성 방식을 사용하여 달성된다 :

1. 용액을 준비 'A'탈 이온 (DI) 물에 5 mM의 칼륨 헥사시 아노 철 (II) 5 mL를 함유. 다음과 같이 PB NPS에서, GdPB 또는 MnPB이 용액 'B'를 제조 - 나노 입자의 종류에 따라 합성되고
   1. 용 NPS는 PB : DI 물에 2.5 mM의 철 (III) 클로라이드를 함유하는 용액 10 ㎖를 준비한다.
   2. GdPB 된 NP의 경우 : 2.5 mM의 DI 물에 각각 가돌리늄 (III), 질산 철 (III) 클로라이드를 함유하는 용액 10 ㎖를 준비
   3. MnPB 된 NP의 경우 : 2.5 mM의 DI 물에 각각 망간 (II), 염화 철 (III) 클로라이드를 함유하는 용액 10 ㎖를 준비한다.
2. 둥근 바닥 플라스크에 용액 'B'를 추가하고, 실온에서 플라스크 내용물 (RT)을 교반 및1,000 rpm으로. 솔루션 'A'드롭 현명한 둥근 바닥 플라스크 솔루션을 포함하는 'B'에 추가합니다. 약 10 ㎖ / hr로를 분배하는 연동 펌프 세트의 'B'에 용액 'A'를 추가 할 유량을 제어한다.
3. 'B'로 용액 'A'를 추가 한 후 추가로 실온에서 30 분 동안 1,000 rpm으로 교반을 계속하는 것이 완료된다. 교반을 중지하고, 혼합물을 수집합니다.
4. 미 반응 성분이없는 나노 입자를 씻어 마이크로 원심 튜브에 혼합물의 분취 량을 전송합니다. 원심 분리하여 입자 수집을 지원하기 위해 각 나누어지는 5 M의 NaCl (0.2 ㎖의 염화나트륨 / ㎖ 반응 혼합물)를 추가합니다.
5. 원심 분리기 20,000 × g에서 적어도 10 분 동안 나노 입자의 각 나누어지는. 원심 분리 후, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
6. 마이크로 팁 (초음파 펄스를 이용하여 초음파 처리를 통하여 1 ㎖의 DI 물 내의 나노 입자 각각의 펠렛을 재현 탁 / OFF = 1 초에서, 진폭 = 50 %, 기간 =5 초, 초음파기 정격 전력 = 125 W)의 펠릿을 깰.
7. 반복은 나노 입자가 초기 반응과 반응 부산물의 구성 요소가 없는지 확인하기 위해 1.4-1.6 최소 3 × 단계를 반복합니다. 최종 원심 분리 후 1 ㎖의 탈 이온수에 재현 탁 입자.

PB 된 NP, GdPB 및 MnPB 2. Biofunctionalization

후술하는 바와 같이 나노 입자의 Biofunctionalization 아비딘과 바이오틴 리간드를 추가로 나노 입자 "코어"의 코팅을 포함한다 :

1. 아비딘 형광 나노 입자의 코팅
   긍정적 인 아비딘 (PI ~ 10.5) ^(18)을 다음과 같이 부정적인 나노 입자를 충전하기에 코팅되어 충전 곳 형광 아비딘과 나노 입자의 코팅은 정전기 자기 조립 (self-assembly)을 사용하여 달성된다 :
   1. 1 ml의 탈 이온수에 PB 된 NP, GdPB, 또는 MnPB의 현탁액을 준비합니다. 알렉사 플 루어 488 표지 아비딘 필터 (A488을, DI 물에 재구성)10 분 동안 14,000 × g에서 0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 마이크로 원심. ≤0.2 mg의 아비딘 / mg의 나노 입자를 추가합니다. PB 된 NP, GdPB, 또는 MnPB의 분량에 별도로 A488의 필터링 된 각 나누어지는을 추가합니다.
   2. 4 ° C에서 부드러운 흔들림이나 회전 2-4 시간 동안 A488과 나노 입자를 문의하십시오. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
      참고 : PB 된 NP (PB-A488), GdPB (GdPB-A488) 및 MnPB (MnPB-A488)을 코팅이 단계 수율의 A488.
2. 오티 닐화 된 항체의 첨부 파일
   다음과 같이 아비딘 - 코팅 된 나노 입자 상에 바이오틴 대상으로 항체의 첨부 아비딘 - 비오틴 상호 작용을 사용하여 달성된다 :
   1. PB-A488, GdPB-A488, 1 ml의 탈 이온수에 MnPB-A488 - 아비딘 코팅 된 나노 입자의 현탁액을 준비합니다. 10 분 동안 14,000 × g에서 0.2 μm의 나일론 마이크로 원심 필터를 통해 바이오틴 항체 (제조업체가 제공) 필터.
      참고 : 여기서, 본 연구는 비오를 사용inylated 항 - 신경 아교 세포 항원 -2 (ANG2) NG2는 세포 및 중추 신경계 내 조직 및 과발현 대상 오티 닐화 항 - 인간 에오 탁신 3 호산구 또는 호 산성 세포주에서 과발현되는 수용체를 타겟 (Eot3).
   2. 아비딘 코팅 된 나노 입자의 분량에 별도로 비오틴 항체의 필터링 된 각 나누어지는을 추가합니다. ≤0.05 MG 바이오틴 항체 ㎎ / 아비딘 - 코팅 된 나노 입자를 추가합니다. 부드러운 4 ° C에서 흔들림이나 회전을 2-4 시간 동안 비오틴 항체 (ANG2 또는 Eot3)와 아비딘 코팅 된 나노 입자를 문의하십시오. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
      참고 :이 단계 수율 항체 코팅 된 나노 입자 (예를 들어 GdPB-A488-Eot3 및 MnPB-A488-ANG2).

나노 입자의 3 크기 조정, 제타 전위 및 시간적 안정성

나노 입자의 크기 분포, 전하 및 안정성을 동적으로 측정되는빛의 산란 (DLS) 방법은 아래에 설명 된대로 :

1. 나노 입자의 크기 조정
   나노 입자의 크기 조정은 다음과 같이 동적 광산란을 사용하여 달성된다 :
   1. 일회용 플라스틱 큐벳에 DI 물 990 μL에 나노 입자 샘플 (1 ㎎ / ㎖)의 10 μl를 추가합니다.
      참고 :이 좋은 DLS 신호의 대표 값입니다.
   2. 잘 혼합 큐벳와 소용돌이를 모자. 나노 입자의 크기를 측정하기 위해서는 입자 크기를 분석하는 데 사용되는 시스템에서 큐벳을 놓는다. 173 °의 각도로 측정 입자 크기 분석을 수행한다.
2. 나노 입자의 제타 전위
   다음과 같이 나노 입자의 제타 전위는 위상 분석 광산란을 사용하여 측정된다 :
   1. 일회용 플라스틱 모세관 셀 DI 물 900 μL에 나노 입자의 샘플 (1 ㎎ / ㎖) 100 ㎕를 추가한다. 이 값은 좋은 제타 전위 측정에 나타낸다.
   2. 모세관 배치25 ° C에서 기본 매개 변수를 이용하여 나노 입자의 제타 전위를 측정하기 위해 제타 전위를 분석하는 데 사용되는 시스템에서의 Y 셀.
3. 나노 입자의 시간적 안정성
   나노 입자의 시간적 안정성을 다음과 같이 동적 광산란을 사용하여 측정된다 :
   1. DI 물뿐만 아니라 3.1 절에 설명 된대로 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)에서 나노 입자의 크기를 측정하여 나노 입자의 안정성을 평가합니다.
   2. 오일 걸쳐 DI 워터와 DMEM 회 / 1 일의 치수 측정을 반복한다.

나노 입자의 세포 독성 제

다음과 같이 나노 입자의 세포 독성 XTT 세포 증식 분석법을 이용하여 측정된다 :

1. 종자 10,000-15,000 세포 / 웰의 각각의 세포 유형은 96- 웰 플레이트 (Neuro2a, BSG D10,은 EoL-1 및 OE21)을 연구했다. 시드 세포의 전체 볼륨이 전자 없는지 확인을 Xceed 0.2 ㎖ / 잘. 하룻밤 37 ° C, 5 % CO _2에서 시드 세포를 품어.
2. 세포와 나노 입자를 문의 :
   1. (- 0.5 ㎎ / ㎖ 0.01) 나노 입자의 농도 변화와 세포를 품어. (50 μL에서) 나노 입자의 양을 설명하는 대표적인 테이블로서 테이블 1을 참조 / 웰의 50 μl의 배지를 제거한 후, 세포에 첨가.
      1. 어 세이 내에서 나노 입자의 흡광도 어떤 간섭을 고려하여, 나노 입자의 적당한 농도로 이루어진 블랭크를 추가 (0-0.5 ㎎ / ㎖; 세포에 첨가 양에 등가)에서 세포없이 매체.
   2. 37 ° C에서 하룻밤 나노 입자와 세포를 품어 5 % CO _2. 대기음 미디어 웰 각각 인산 완충 용액 (PBS)에 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 구성 염색 완충액으로 헹군다. 페놀 레드없이 매체의 100 μl를 추가하고 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화16 ~ 18 시간 동안.
3. 제조업체의 사양에 따라 키트 구성 요소 (XTT 시약 및 XTT 활성제)를 혼합하여 XTT 세포 증식 분석 작업 솔루션을 준비합니다. 우물에서 미디어를 대기음 또는 연구 세포 유형에 적합한 매체 (/ 페놀 O + 레드 10 % FBS + 1 × 펜 연쇄상 구균 와트 RPMI) RPMI의 100 μl를 추가합니다. 각 웰에 XTT 작업 용액 50 μl를 추가하고 2-2.5 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 %.
4. 지문이나 얼룩을 보정하기 위해 630 nm의 참고 파장으로 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 물론 각각에 대한 보정 흡광도 (A ₄₉₀ -A _630)을 계산하고 반복 실험에 대한 측정 값의 평균을.
5. 최종 흡광도 보정 값을 계산하기 위해 각 웰로부터 블랭크 값 판독을 뺀다. 나노 입자없이 치료 세포의에 최종 수정 흡광도를 정상화하여 각 샘플에 대한 생존 비율을 계산합니다. 플롯 스와나노 입자의 농도의 함수로서 백분율 rvival.

5. MRI PB 된 NP의 Relaxivities, GdPB 및 MnPB

MRI는 T ₁ 이완성 사용하여 측정 - 및 T ₂ 후술하는 나노 입자를 함유하는 96 웰 플레이트를 이용하여 MRI "팬텀"를 제조함으로써 -weighted 서열 :

1. 팬텀 준비
   1. 적절한 농도의 각 웰에 포함 된 100 μL 나노 입자 (PB NP에, GdPB, 또는 MnPB)로 96 웰 플레이트를 준비합니다. 나노 입자의 각 유형에 대해 0.4 mm의 농도를 시작으로 순차적으로 M에 도달 할 때 2.4 × ^10-5의 농도까지 탈 이온수를 이용하여 나노 입자를 희석 × 2 (14 개의 희석액을 15 웰 필요).
   2. 물론 각에 DI 물에 용해 1 % 아가로 오스 용액 100 μl를 넣고 잘 섞는다. 겔 12 시간 동안 4 ℃에서 응고하도록 허용합니다.
      주 :이 일련의 희석액을 함유 팬텀을 수득응고 아가로 오스 나노 입자.
   3. 2 % 한천 (150cm ^3)의 고체 블록에서 수평 3 T 임상 자석 팬텀를 놓습니다. 8 채널 HD 뇌 코일의 중심에서 한천의 팬텀과 블록을 고정합니다. 96- 웰 플레이트 ^(11)의 중간 높이에서, 0.5 mm 두께의 관상 조각을 사용 완화 시간을 측정한다.
2. T - _1과 T ₂ -Weighted 시퀀스
   임상 자석의 시퀀스를 획득하기위한 다음과 같은 대표적인 설정을 사용합니다.
   참고 :이 값은 본 연구에 사용 된 나노 입자에 최적화되어 있습니다 :
   1. T 획득 다음 액체 감쇠 반전 회복 (FLAIR) 시퀀스를 사용하여 ₁ -weighted (T1W) 자기 공명 영상 : 기차 에코 (ET) = 8, 반복 시간 (TR) = 2300 밀리 초, 에코 시간 (TE) = 24.4 밀리 초, 매트릭스 크기를 = 512 X 224, 시야 (FOV)은 16 × 16cm = ^2.
   2. 다음과 같은 빠른 relaxa를 사용하여 T ₂ -weighted (T2W) MR 영상 획득기 빠른 스핀 에코 (FRFSE) 순서 : ET = 21; TR = 3500 밀리 초; TE는 = 104 밀리 초; 매트릭스 크기 = 512 X 224; FOV = 16 × 16cm ^2.
   3. 다음 반전 시간에 127 메가 헤르츠 (3 T)에서 T1W 및 T2W MR 이미지를 취득 : 50, 177, 432, 942, 1,961, 4,000 밀리 초.
3. MRI Relaxivities 측정
   1. 5.2 절에 설명 된 시퀀스를 사용하여 T1W 및 T2W 이미지를 획득 한 후, 다음, 이제부터는 기본 도구 모음에있는 타원형 자르기 버튼을 사용하여 각각의 투자 수익 (ROI)을 선택하여 관심 (ROI)의 영역으로 지정된 각 잘 사용 ImageJ에 대한 신호 강도를 측정 > 측정 분석 선택.
      참고 : 팝업는 "평균"열에서 각 ROI의 평균 신호 강도를 표시해야합니다.
   2. 각 ROI의 경우, 그 특정 시간에 대해 반전 측정 된 신호 강도를 플롯. 필요 반전 포인트 음모의 시작 부분에 초기 "거품"또는 특이점을 생성 (수치) (아래 반전하는 경우회).
      주 : MRI 오히려 ^19에 대해 보정 될 필요가 차지하는 실제 값 (음수) /보다 이미지의 크기 또는 절대 값을 측정하기 때문에 측정 값이 낮은 반전 시간에 생성된다.
   3. 5.2 절에 설명 된대로 반전 시간 대 로아 (SI) (T _I)에 대한 신호 강도의 각각의 플롯에 대한 지수 피팅을 준비합니다. X 축에 플롯 T _I, Y 축에 SI; ɑ 및 Δ는 회귀에 의해 결정된 상수이고, T _1, T _2는 해결해야 할 변수이다 :
      
      여기서 t는 T _1, T = _2.
   4. 상기 식을 사용하여 _하나 또는 T T ₂ 해결하고 각 ROI에 사용되는 나노 입자의 농도에 대해 계산 된 값 (1 / T ₍₁₎ 및 1 / T _(2))의 역수를 플롯.
   5. 선형 그래프의 기울기를 계산하는relaxivities ₁ R 및 _{2 r에} 산출한다.
      참고 : 프로토콜의 다음 섹션에서는 형광 라벨 및 표적 세포에서 생성 MRI 대비를위한 나노 입자의 응용 프로그램을 설명합니다.

공 초점 현미경 - 나노 입자를 사용하여 표적 세포의 6. 형광 표식

참고 : 나노 입자 (PB NP에, GdPB 및 MnPB)는 형광 다음과 같이 (공 초점 현미경으로 관찰) 대상 세포의 인구 레이블을 사용할 수 있습니다 :

1. 형광 나노 입자의 합성
   1. 섹션 1과 2에 설명 된 단계를 수행하여 표적 세포 집단의 형광 라벨링 GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2을 합성.
2. 세포의 준비 형광 타겟팅에 대한
   1. 코트 없음. 90 분 동안 0.002 %의 폴리 (L- 라이신) 브롬화 수소 산염의 용액에 침적 1.5 마이크로 커버 글라스. 솔루션에서 덮개 유리를 제거하고 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
   2. 씨앗 세포 (예를 들면은 EoL-1, BSG의 D10, SUDIPG1) 6 잘 접시에 배치 적어도 16 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 % 코팅 커버 유리에. 1 × PBS 용액으로 세포를 헹구 (선택적) 15 분 동안 중성 완충 용액에 10 % 포름 알데히드로 고정한다. 30 분 동안 37 ° C에서 PBS에 5 μm의 레드 오렌지 세포 투과 염료와 얼룩 세포. 이어서, PBS로 세포를 헹군다.
3. > 표적 세포의 형광 표식
   1. 1 % 소 혈청 알부민에 추가 (BSA를, DI 물에서) 세포에 세포 비특이적 결합을 최소화하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양.
   2. 1 시간 동안 1 % BSA의 나노 입자와 세포를 품어. 은 EoL-1 : 0.2 ㎎ / ㎖ GdPB-A488 또는 GdPB-A488-Eot3과 배양; BSG의 D10과 SUDIPG1의 경우 : 0.2 ㎎ / ㎖ MnPB-A488 또는 MnPB-A488-ANG2에 품어. unbou 제거 PBS 3 ×를 세포를 씻어차 나노 입자.
   3. 조심 트랩 된 기포가 없는지 보장 현미경 슬라이드 (세포 및 나노 입자를 함유하는) 커버 유리를 반전한다. 신중 맑은 매니큐어를 적용하여 커버 유리 현미경 슬라이드 사이의 가장자리를 밀봉. 이미지 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포.

유동 세포 계측법 - 나노 입자를 사용하여 표적 세포의 7 형광 표식

다음과 같이 나노 입자 (NP는 PB, GdPB 및 MnPB), 형광 라벨 (유동 세포 계측법에 의해 모니터링) 표적 세포 집단을 사용할 수있다 :

1. 세포 현탁액은 PBS 준비 표적이된다. 순수 배양 연구, 현탁액은 단일 세포 유형 (예, BSG의 D10)로 구성되어; 100,000 세포 / ㎖ (10 ㎖ 총)에서 PBS에 BSG의 D10 셀의 세포 펠렛을 재현 탁. 혼합 배양 연구, 현탁액은 적어도 두 종류의 세포 (예를 들면은 EoL-1 및 OE 이루어져21); (10 ㎖ 전체) 100,000 세포 / ㎖ 각에서 BSG의 D10, PBS에서은 EoL-1과 OE21의 재현 탁 세포 펠렛과 유사한.
   1. 은 EoL-1의 가변 비율 준비 : OE21을 1 : 0 (2 ㎖은 EoL-1), 3 : 1 (1.5 ㎖의은 EoL-1, 0.5 ml의 OE21), 1 : 1 (1 ml의은 EoL-1 및 OE21 각) 1 : 3 EOL (-1 0.5 ml의 1.5 ml의 OE21), 0 : 1 (2 ml의 OE21).
2. 세포 (순수 및 혼합 현탁액)을 차단하는 비특이적 결합을 최소화하기 위해 5 %의 BSA와 2 ml의 나노 입자로 타겟팅된다.
3. 셀에 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖) 나노 입자를 추가하고 1 시간 동안 배양한다. BSG의 D10의 경우, MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (제어 항체), 또는 MnPB-A488-ANG2)와 세포를 배양한다. 은 EoL-1과 OE21의 혼합물의 경우, GdPB-A488-Eot3의 고정 된 양의 혼합물을 배양한다.
4. 언 바운드 입자를 제거하는 5 분 동안 1,000 × g에서 최소 3 ×를 샘플을 아래로 회전하여 결합되지 않은 나노 입자를 무료로 세포를 씻어. 1 ml의 PBS에 재현 탁하고 세포를 PBS 중 10 %의 포름 알데히드로 고정한다. 10 ㎍ / ㎖로 배양에 의한 얼룩 세포30 분 동안 얼음에 PBS에서 7-Aminoactinomytcin D. , PBS로 헹구고 그런 다음 플로우 사이토 미터를 사용하여 각 샘플로부터 만 게이트 된 세포를 분석.

나노 입자를 사용하여 표적 세포 8. 생성 MRI 대비

다음과 같이 표적 세포 집단에서 - 나노 입자 (NP는 PB, GdPB 및 MnPB)은 (T와 _두 서열 모두 -weighted T ₁₎ MRI 콘트라스트를 생성하는데 사용될 수있다

1. 팬텀 준비
   1. 80 %의 합류 ~까지 T75 플라스크에 세포 (예 : BSG의 D10)을 성장. 적절한 성장 매체와 조건을 사용합니다. BSG의 D10를 들어, 37 ° C에서 DMEM + 10 % FBS + 1 × 펜 - 스트렙토에서 세포를 성장시키고, 5 % CO _2.
   2. 5 ㎖ PBS와 매체의 무료 세포를 씻어 비특이적 결합을 최소화하기 위해 1 시간 동안 PBS에 5 ml의 1 % BSA와 세포를 차단합니다. 세포에 5 ㎖ (0.5 ㎎ / ㎖) 나노 입자를 추가합니다. BSG의 D10의 경우, MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (제어 항체) 및 MNP와 세포를 배양B-A488-ANG2 1 시간 동안.
   3. 언 바운드 나노 입자를 제거하는 세포 5 ml의 PBS로 3 × 씻어. 팬텀 제조 플라스크에서 그들을 분리 37 ° C, 5 % CO _2에서 2 ml의 0.25 % 트립신 EDTA 용액으로 5 분 × 1 세포를 배양하여 세포를 Trypsinize. 세포의 트립신을 해소하기 위해 DMEM 8 ML을 추가합니다.
   4. 5 분 동안 1000 × g에서 원심 분리하여이를 세포를 수집; 뜨는을 대기음. 1 ml의 PBS에 세포를 재현 탁하고 세포를 해결하기 위해 PBS 1 ml의 10 % 포름 알데히드를 추가합니다. 96 웰 플레이트의 별도의 우물에 각 시료 100 μl를 추가합니다.
   5. 물론 각에 DI 물에 용해 1 % 아가로 오스 용액 100 μl를 추가로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 겔 12 시간 동안 4 ℃에서 응고하도록 허용합니다.
      참고 :이 응고 아가로 오스에 부착 된 나노 입자와 세포를 포함하는 팬텀을 산출한다.
   6. (다음 2 % 한천의 고체 블록에 수평 3 T 임상 자석에 150cm를 팬텀 배치 ^(11)의 중간 높이에 0.5 mm 두께의 관상 조각을 사용 완화 시간을 측정한다.
2. T - _1과 T ₂ -Weighted 시퀀스
   임상 MRI 자석의 시퀀스를 획득하기위한 다음과 같은 설정을 사용합니다 :
   1. 다음 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 T1W MR 이미지를 취득 : 기차 에코 (ET) = 1, 반복 시간 (TR) = 650 밀리 초, 에코 시간 (TE) = 11 밀리 초, 매트릭스 크기 = 320 × 256, 시야 (FOV) = 10 × 10cm ^2.
   2. 다음 FRFSE 시퀀스를 사용하여 T2W MR 이미지를 취득 : ET = 28; TR = 3000 밀리 초; TE는 = 101 밀리 초; 매트릭스 크기 = 384 X 288; FOV = 10 × 10cm ^2.
3. 인수 후 처리
   1. 회색조로 이미지를 변환, 선택 이미지> 유형> 8 비트 : 읽기 쉽게, ImageJ에를 사용하여 색상 스케일 이미지로 원래의 그레이 스케일 이미지를 변환 할 수 있습니다.
   2. 아가로 오스 용액으로부터의 신호 기여를 감산 한 후, 각 샘플에 대한 정규화 된 강도를 계산한다.

Results

원 - 포트 (one-pot) 합성 방식을 사용하여, PB 된 NP의 나노 입자 (직경 78.8 nm의 다 분산 지수 (PDI) = 0.230을 말한다 동적 광산란 기기에 의해 산출) GdPB가 또는 MnPB (직경에게 164.2 nm의 PDI = 0.102을 의미) ( 직경에게 DLS 의해 측정 (122.4 nm의 단 분산되어, PDI = 0.124))을 합성 할 수 일관 (도 2A)를 의미한다. 합성 된 나노 입자의 측정 제타 전위는 표면 전하에 따라 입자의 중간 안정성을 나타내는 미만 -30 MV (그림 2B)이다. 그들의 일관된 크기 (도 2C 역학적 직경)으로 나타낸 바와 같이 합성 된 나노 입자는 5 일의 기간에 걸쳐 충분한 시간적 안정성을 나타낸다.

세포는 공동 - 배양하는 경우, 나노 입자 (NP는 PB, GdPB 및 MnPB)은 특정 임계 값 이하 농도 세포

Discussion

이 문서 biofunctionalized 프 러시안 블루 (Prussian blue) 나노 입자를 기반으로 복합, 분자 이미징 에이전트의 새로운 클래스의 합성 방법을 제시하고있다. 나노 입자에 통합 분자 영상 방식으로 인해 상호 보완 기능으로, 형광 이미징 및 분자 MRI 있습니다. biofunctionalized 감청 된 나노 입자는 코어 - 쉘 디자인을 가지고있다. 이들 나노 입자의 합성은 핵심 단계 : 1) 한 냄비 감청 나노 입자로 구성되어 코어 (PB 된 NP), 가돌리늄 - 함유 나노 입자 감청 (GdPB), 또는 망간 함유 감청을 수득 합성 나노 입자 (MnPB) 정전기 자기 조립 (self-assembly)에 의해 형광 아비딘을 이용하여 나노 입자, 2) biofunctionalization, 그리고 강력한 아비딘 - 비오틴 상호 작용을 이용하여 나노 입자에 바이오틴 리간드 (항체) 3) 첨부. 형광 아비딘과 바이오틴 리간드 모두를 구성 biof나노 입자의 unctional 쉘.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
칼륨 헥사시아노페레이트 (II) 삼수화물 (K4Fe(CN)6· 3H2O)	Sigma-Aldrich	P9387
망간(II) 염화물 사수화물(MnCl2· 4H2O)	시그마-알드리치	221279
가돌리늄(III) 질산염 육수화물(Gd(NO3)3· 6H2O)	시그마-알드리치	211591
철(III) 염화물 육수화물(FeCl3· 6H2O)	시그마-알드리치	236489
염화나트륨(NaCl)	시그마-알드리치	S9888
항NG2, 콘드로이틴 설페이트, 프로테오글리칸, 비오틴 접합 항체,	Millipore	AB5320
비오틴화 항인간 에오탁신-3	페프로텍	500-P156GBT
Neuro-2a 세포주	ATCC	CCL-131
BSG D10 세포주	연구소 주식	---
OE21 세포주	시그마 - 알드리치	96062201
SUDIPG1 신경 구체	연구소 주식	---
Eol-1 세포주	시그마 - 알드리치	94042252
폴리 (L- 라이신) 하이드로 브로마이드	시그마 - 알드리치	P1399
포름 알데히드	시그마 알드리치	F8775
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A2153
아미노악티노마이신 D	시그마-알드리치	A9400
트리톤 X-100	시그마-알드리치	X100
셀트레이스 칼세인 레드-오렌지, AM	라이프 테크놀로지스	C34851
아비딘-알렉사 플루어 488	라이프 테크놀로지	A21370
원심분리기	Eppendorf	5424
연동 펌프	Instech	P270
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600
Sonicator	QSonica	Q125
핫 플레이트/마그네틱 교반기	VWR	97042-642
울트라 클린 알루미늄 호일	VWR	89107-732
Vortex 믹서	VWR	58816-121
1.7ml 원추형 미세 원심분리기 튜브	VWR	87003-295
15ml 원추형 원심분리기 튜브	VWR	21008-918
튜브 홀더	VWR	82024-342
일회용 플라스틱 큐벳	VWR	7000-590 (/586)
Zetasizer 모세관 셀	VWR	DTS1070
원심 필터, 0.2 마이크로미터 스핀 컬럼	VWR	82031-356
96웰 세포 배양 트레이	VWR	29442-056
트립신 EDTA 0.25% 용액 1x	JR Scientific	82702
세포 배양 등급 PBS (1x)	Life Technologies	10010023
XTT 세포 증식 분석 키트	Trevigen	4891-025-K
T75 플라스크	89092-700	VWR
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowhitaker	12-604Q
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10437-010
Pen-Strep 1x	Life Technologies	15070063
Fluoview FV1200 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Olympus	FV1200
챔버 현미경 슬라이드	Thermo Scientific	154534
마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1.5	VWR	48366-227
현미경 슬라이드	VWR	16004-368
RPMI	Sigma-Aldrich	R8758
아가로스	시그마-알드리치	A9539
FACSCalibur 유세포 분석기	BD Biosciences
3 T 임상 MRI 자석	GE Healthcare
100 ml 둥근 바닥 플라스크