목표는 콩과 식물이 아닌 애기장대 모델을 보완하기 위해 초기 식물 배아 발생의 조절을 조사하는 데 모델 콩과 식물 Medicago truncatula를 쉽게 사용할 수 있음을 설명하는 것입니다. 포드 형태학은 접합 배발생 단계와 관련이 있으며 조직 배양을 사용하여 배아를 수집하는 프로토콜도 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 - 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopurine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.
서론
수확 면적과 총 생산량 1 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 2 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N (2) 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 5-7 및 배아 8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 - 근류균 공생 (4) 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago 8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다.
체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 (12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 (13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 (14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 (14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고.
배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION.
본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.
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프로토콜
1. 접합체 배아 개발
- 식물 재료
- 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA 13 truncatula.
- 물이 씨앗을 입력하고 물에 하룻밤 담가 허용되도록 씨앗을 파종하기 전에 피어스 (23 G 바늘) 씨 코트의 표면. 완전히 씨앗을 충당하기 위해 충분한 물을 추가합니다.
- 포팅 혼합물의 각 15cm 직경 냄비에 3의 씨앗을 뿌리고 (10 냄비의 총) (굵은 모래, 펄라이트, 야자 껍질의 섬유 - 이탄 (1 : 1 : 1)을 더한 Osmocote 정확한 표준의 5g : 느린 방출 비료) 및 전송 유리 공장. 식물이 올라 줄기를 위해 냄비와 서라운드 당 1 공장은 격자에 의해이 때문에 발아 후 건강한 묘목을 유지.
- 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA 13 truncatula.
- 수확 포드
- W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 9 기재.
주의 : 다른 포드 스테이지가도 1에 도시되고 대응하는 배아 단계는도 2에 도시되어있다. - 분리 스테이지 (6 및 7) (표 2)을 돕는 단계 (6)로부터의 경과 시간. 표 1에서와 같은 기준을 사용하여 수확에서 다른 포드 스테이지를 점검 측정한다.
- W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 9 기재.
- 포드에서 난자를 해부 및 배아 단계를 확인
- 필요에 따라 단독으로 미세 집게를 사용하여 포드 또는 스테레오 해부 현미경과 집게에서 난자를 분리합니다. 필요한 경우 배아 단계 신속 표준 화합물 현미경 (도 3b)을 이용하여 확인할 수있다.
- 아랍어 7.5 g 검, 100g의 클로 랄 하이드레이트, 5 mL의 글리세롤, 증류수 60 mL의 탈 이온수를 함유하는 용액을 호이어의 변성 준비한다. 3-5 시간 또는 하룻밤 교반 용해.
- 더 조정을 위해D 현미경 수정 호이어의 솔루션 (15, 16)의 해부 난자을 취소합니다. 조심스럽게 명확 때까지 실온에서 (난자를 커버하기에 충분) 호이어의 솔루션의 작은 볼륨에서 그대로 난자와 장소를 선택하십시오.
- 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 샘플을 볼 수 있습니다. 디지털 카메라 (9) (그림 2) iwth 이미지를 캡처합니다.
- 포드의 중심 지역에서 가장 균일 한 난자를 확보하고 필요한 수를 축적. 일례가도 3a에 도시되어있다. 추가 분석을 위해 요구되는 온도에서 얼음 저장에 난자 (-80 ° C에 대한 핵산)를 수집합니다.
참고 : 조직 학적 섹션의 분석, 투과 전자 현미경에 대한 자세한 내용 및 현장 하이브리드에 논문 8, 9를 참조하십시오.
체외 2. 체세포 배아 개발
- 엠을 사용하여 truncatula 품종의 T모자는 쉽게 문화의 배아를 형성 할 수있다. 잎 외식이 프로토콜 2-4 개월이다 2HA 공장 13, 17을 사용합니다.
- 신장 줄기의 최신 거의 완전히 확장 세 잎의 잎에서 전단지를 가져 가라.
- 탈수를 방지하기 위해 문화 냄비에 축축한 종이 타월에 세 잎의 잎을 유지합니다.
주 : 세 잎의 잎이 수확되면 그들이 최소한의 지연으로 활용 될 필요가있다. - 배양 배지의 제조
- 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다.
참고 : P4 10 : 4 : 1 : 5 매체는 P4의 기저 매체 18 플러스 10 μm의 1 naphthaleneacetic 산 (NAA), 4 μm의 6 benzylaminopurine (BAP), 1 μm의 아브 산 (ABA)와 5 μm의 지베렐린으로 구성 산 (GA). GA + ABA의 사용은 배아 형성을 가속화하고 배아 번호 14의 실질적인 증가를 야기한다. - 1 리터의 P4의 기저 매체 메이크업; (calciu을 주요 염으로 구성된) 별도로 미터 사소한 염과 비타민 (표 3), 킬레이트 철 (별도 구성), 카사 미노산 (카제인 가수 분해물), 30g의 자당, 8g 한천.
- 적당한 분량 씩 -20 ° C에서 주요 염, 칼슘, 카사 미노산, 약간의 소금과 비타민의 상점 재고 솔루션을 제공합니다. 4 ℃에서 킬레이트 철을 저장합니다.
- • 7H 다음날에 FeSO4의 1.853 g을 추가하는 동안 교반하면서 탈 증류수 약 900 ml의 나 2 EDTA •의 7.44 g의 2H 2 O를 용해하여 킬레이트 철 (200X)를 확인 후 98 ~ 99 ° C의 솔루션을 가지고 2 O 성분이 용해 될 때 마지막으로 1 리터까지합니다. 호박에 보관은 4 ℃에서 병 색깔.
- 표 4에서와 같이 주식 솔루션 (P4)의 기초 배지를 확인합니다. 매체의 호르몬은 10 μm의 NAA, 4 μM의 BAP, 1 μM의 ABA, 5 μm의 GA (표 4 및 특정 재료 표 참조). NAA 추가BAP 전에 가압 멸균 주사기에 부착 0.22 μm의 필터로 여과 멸균하여, 오토 클레이브 약 55 ° C로 냉각 후 ABA 및 GA를 추가한다. 부드러운 소용돌이에 의해 잘 섞는다.
- 고압 증기 멸균에 앞서 1 M KOH으로 pH 5.8로 미디어를 조정합니다. 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브.
- 필터 살균 ABA와 GA를 추가하고 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 멸균 9cm 페트리 접시에 미디어의 약 25 ml에 부어 고온 가압 멸균 한 후. 쿨과 한천은 뚜껑으로 설정할 수 있습니다. 그런 다음 뚜껑에 넣고 뚜껑에는 응축수가없는 있는지 확인하십시오. (뚜껑 응축을 방지하기 위해 판지 상자) 4 ° C에서 요구 및 저장소로 레이블.
- 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다.
- 잎 조직의 살균
- 자외선 살균 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 작업 할 수 있습니다.
- 장소는 이전에 멸균 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 나뭇잎.
- 막 다른 에탄올 70 %에 (V V)를 잎을 포함하는 차 주입기를 담가30 초 동안 진짜야 냄비.
참고 :이 절차의 모든 단계를 사용할 250 ml의 멸균되는 캡 폴리 카보네이트 문화 냄비 나사. - 배수 후 전송하고 1 잎 조직 몰입 : 8 (V : V)로 희석 표백제 (0.5 % 염소)을 10 분 동안. 때때로 부드럽게 소용돌이.
- 표백제를 배출하고 멸균 탈 증류수를 포함하는 문화 냄비에 차 주입기를 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 여분의 물을 배수. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 한 번 더 반복한다.
- 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 멸균 집게와 차 주입기에서 잎을 제거합니다. 멸균 캡 나사와 반전과 소용돌이로 헹군다. 외식을 준비 할 준비가 될 때까지 멸균 물에 떠있는 나뭇잎을 남겨주세요.
- 의 Explants 준비 및 도금
- 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE.
주 : 이식편의 크기는 제 캘러스를 개시에 매우 중요하다. 테이크 아웃 식품 용기에서 멸균 뚜껑에 절단을 수행하십시오. - 플레이트 9cm 직경 페트리 접시 (그림 5B)에서 한천 화 배지에 6 외식. 보통 잎의 방향을 유지하기 위해 아래로 외식 배축 측 플레이트.
- 접시 주위에 뻗어 파라 필름 (그림 5C)와 페트리 접시를 밀봉합니다. 조직은 지금 배양을위한 준비가되어 있습니다.
- 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE.
- 조직 배양
- 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어.
참고 : 외식이 탈분화를 시작 세포 분열, 증식 (캘러스 형성)과 배아 (차별화)을 받게 될 것이다. - 차별화 expla을 배양신선한 매체에 3 주 후에 NTS. 이 계대 배양에서 층류 후드 또는 생물 캐비닛, 멸균 스테인리스 주걱과 집게를 사용하여 전체 이식편 옮긴다. 캘러스가 발생 캘러스는도 5C에서 가장 큰 하나의 크기를 초과하는 신선한 배지로 계대 배양 될 때, 개별 캘러스의 50 %를 전달.
- 약 4 주 만에 처음으로 배아를 관찰한다. 동시성의 정도가되지만, 4-8 주간의 배양 기간 동안 상이한 배아 수집 단계 (도 6a를, B). 실험 목적에 따라 해부 현미경 및 프로세스에 따라 수집합니다.
- 외식 3 개월 동안 배아를 생산하기 위해 계속 수 있도록 매 3 주 배양과 정기적으로 배아를 제거합니다.
- 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어.
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결과
F - 다른 배아 단계는도 2a에 도시 동안 F - 다른 배아 단계에 해당하는 접합체 배아 다른 포드 구조에 대해서는 그림 1A에 표시됩니다. 동일한 단계에서 포드를 선택함으로써, 난자의 샘플 상당히 균일 (도 3a)를 얻을 수 있음. RT-qPCR의 배아를 이용하여 특정 유전자는 쉽게 검출 및 시간 과정 연구 9를 평가할 수있다. 일부 추가 해부 배아 (그림 3B)의 추가 농축을 허용합니다. 제자리 혼성화 처리 전략을 용이하게 임의의 상보 광 관련된 연구 (도 4A, B) 및 전자 현미경 (8)뿐만 아니라 수행 할 수있다 위해. 이 시스템을 구성하는 특정 값의 뇌하수체 및 suspensor (도 4A, B)의 특수성이다.
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토론
설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 (19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다.
생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드로부터 난자의 분리이다. 더 나아가 "후크"영역 (도 3B)를 오프 자르는 배아 조직을 위해 농축하는 것도 가능하다. 그것은 잘 유리한 난자의 활용, 인접 조직에 부착되지 않는 동안 disection 배아 종종 분실로서 배아 발달의 매우 초기 단계를 분리하는 것이 곤란하다. 꽃의 태그는 포드의 형태를 제거 사용 및 시간 C를 갖는각각의 꽃에 대한 ourse을 정권. 환경이 매우 엄격하게 제어되지 않는 한 또한 잠재적 인 ...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 호주 연구 위원회(Australian Research Council)의 보조금 CEO348212와 뉴캐슬 대학교(University of Newcastle)의 지원을 받았습니다. Sam Zhang 박사의 도움은 인정됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| P4 매체 | : 시그마 - 알드리치 | : 시그마 - 알드리치 화학 물질 또는 기타 분석 등급 공급 업체 사용 | |
| 나프탈렌 아세트산 | Sigma-Aldrich | N0640 | 1M |
| NaOH Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | 1M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | 가열과 몇 방울로 MQ 물에 용해 1N HCl |
| 지베렐릭 산 | Sigma-Aldrich | G7645 | 소량의 에탄올 |
| 장비 | |||
| : 스테레오 해부 현미경 | Leica | MZFLIII | 또는 이와 유사한 |
| 광학 현미경 | Zeiss | Axiophot | 또는 이와 유사한 광학 |
| 디지털 카메라 | Zeiss | AxioCam HRc | 또는 이와 유사한 |
| 살균 잎 | |||
| 250 mL 나사 캡 폴리 프로필렌 뚜껑이있는 폴리 카보네이트 용기 | SARSTEDT | 75.9922.519 | 오토클레이브 가능 |
참고문헌
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