간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Summary

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

Abstract

현재 대부분의 체외 세포 연구는 경질 조직 배양 폴리스티렌(~1 GPa)에서 수행되는 반면, 신체의 대부분의 세포는 탄력 있고 훨씬 부드러운 매트릭스(0.1 – 100 kPa)에 부착되어 있습니다. 이러한 강성 불일치는 세포 반응에 큰 영향을 미치기 때문에 세포 기질로 사용되는 광범위한 강성을 포괄하는 하이드로겔 물질을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔은 저렴하고 신체의 모든 연조직의 뻣뻣함 범위를 커버하며 많은 연구 그룹에서 선택하는 하이드로겔입니다. 그러나 폴리아크릴아미드 겔 제제는 길고 지루하며 소량 배치에만 적합합니다. 여기에서는 영구적이고 유연한 플라스틱 필름을 겔의 구조적 지지체로 활용하여 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 제조할 수 있는 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 현재 방법보다 빠르고 효율적이며 비용이 적게 들며 다른 방법으로는 사용할 수 없는 맞춤형 크기의 겔을 준비할 수 있습니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 이 방법은 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있으며 강성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

Introduction

몸에있는 대부분의 조직은 1 ~ 조달 협정 계수가 0.1 kPa 내지 부드러운 연골 100 kPa의 뇌, 아직, 체외 세포 연구에서 대부분의 조직 배양 폴리스티렌 (TCP)에 실시에 대한 범위의 탄성 계수와 부드러운 점탄성 물질이다 . ^1이 강성 불일치가 크게 세포가 자신의 환경에 반응하는 방식에 영향을 미친다. 연구 성장 본체, ^{2,3- 줄기} 세포를 포함. 그 결과 ⁴ 다양한 세포 유형의 운명에 기판의 강성의 영향을 밝히기에 따라서 전용 인 다중 하이드로 겔 강성 - 의존성 세포의 이해를 돕기 위하여 개발되어왔다 기판 강성 세포 운명에 상당한 영향을 미치고 있다는 증거가 증가하고 있지만, 폴리 아크릴 아미드 (PA), ^5-7, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), ^8,9 디메틸 실록산 (PDMS), ⁽¹⁰⁾ 및 알긴산 포함한 생물학. ^11, 가장 연구가 실시되고 (S)의 수가 적은 소규모불가능한 명령어. 세포 유형 또는 환경 조건이 드물다의 배열을위한 기판 강성의 효과에 대한 체계적, 다차원 연구. ⁽¹²⁾

몇몇 유망 높은 처리량 하이드로 겔 기술은 PEG 계 마이크로 어레이, 강성 마이크로로드의 직경 및 높이에 의해 변조되고, 아가 로스 겔 마이크로 비드 ⁽¹⁴⁾ 또는 마이크로 및 나노로드의 제조를위한 ^(13)의 마이크로 유체 장치를 포함하여, 개발되어있다. ⁽¹⁵⁾ 그러나 , 기술은 기판 정교하고 실험실의 수가 제한되어 있습니다 제조한다. 강도 변조 된 세포 반응을 포함하는 많은 연구가 구현뿐만 아니라, 영률, 즉 0.3의 생리 학적으로 중요한 범위 발휘할 만 저렴하고 간단하지 않은 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔 이용한다 -. 300 kPa로를 ^16-22 그러나 PA를 제조하는 방법을 기존 세포 배양 젤은 노동 집약적 결과적으로 준비하다작은 일괄 ared. 세포 기질로서 PA 겔의 제조와 관련된 문제의 일부가 겔을 제조 할 필요가 요구 유래한다 : 1) 산소의 부재하에 완전한 중합을 허용하기 위해, 2) 평활 한 표면과 균일 한 셀을 허용 부착 및 확산, 3) 부동 영구적 방지 세포 배양 접시의 바닥에 부착.

몇몇 그룹은 대형 일괄 적으로 세포 배양을위한 PA 젤을 생산하려고했습니다. 셈러 등. 홀 펀치 후 "컷"이었고, 96 웰 플레이트에 배치 PA 젤의 준비 두께의 시트. ⁽²³⁾ 그러나이 방법은 엄격한 젤, 즉,> 1 kPa의 영률, 부드러워로 제한됩니다 젤은 삭재하고 쉽게 손상 "끈적 끈적한"입니다. MIH가 외. 겔 직접 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에서 중합 될 수 있도록 더 정교한 기술을 개발 하였다. (6)이 작용 유리 바닥 판에 겔 솔루션을 따르고 사용자 정의 커버 글라스 배열로 "를 사이에두고"에 의해 겔을 형성함으로써 달성되었다. ⁶ 비록 매우 유망한, 약간의 가장자리 효과는 아직이 기술로 관찰되었다. 또한,이 기술은 많은 실험실뿐만 아니라 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에 즉시 액세스 할 수없는 맞춤 설계 배열이 필요합니다.

이 논문은 쉽게 실험실에 의해 채택 될 수있는 멀티 웰 플레이트에서 PA 젤을 조립하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 구충제는 PA 젤에있는 소수성 하나, 및 공유 증착에 PA 젤을 결합하는 친수성 ​​하나, - 여기, 유연한 플라스틱 지원은 두 가지 측면이있는, 사용된다. PA 겔 시트는가요 성 플라스틱 지지체에 부착 된 영구 증착이 된 후, 임의의 두께 나 강성의 겔을 처리하고 임의의 바람직한 형태로 절단 가능하게한다. 이 APPRoach는 PA 결합 액으로, 커버 글라스 또는 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트의 우물를 달리 상업적으로 사용할 수없는 크기의 사용자 정의 플라스틱 '된 커버'를 생산하고, 또한 유리 표면 - 치료의 사전 할 필요성을 미연에 방지뿐만 아니라 지루하고 시간 소모적 인 단계를 포함한다. 마지막으로, 균일 PA 겔 시트를 큰 배치로 제조하고, 몇 달 동안 탈 수화 저장 될 수있다.

요약하면, 여기에 제시된 분석은 몇 가지 측면에서 기존의 방법에 비해 개선이다. 첫째, 멀티 웰 플레이트 조립체의 프로세스는 효율적이고, 요구되는 물질의 총 비용은 낮다. 둘째, 하이드로 겔은 하나의 균질 한 겔 필름에 큰 일괄 적으로 생산된다. 마지막으로, 상업적으로 사용할 수있는 유일한 재료가 필요합니다. 분석의 유틸리티는 세포 형태에 강성 기판의 효과를 탐구하고 확산 영역으로 도시된다.

Protocol

하이드로 겔 관련 솔루션 및 분취 1. 준비

1. 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액의 제조.
   1. 아크릴 아미드 (A)을 혼합하여 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액을 준비한다 (V / w 40 %, M은 _r에 71.08 g / ㏖), 가교제 비스 아크릴 아미드 (B) (V / w 2 %, M은 154.17 g / mol 인 _R), 및 탈 표 1에 규정 된 부피 백분율에서 이온수.
      참고 :이 솔루션은 큰 일괄 적으로 준비하고 몇 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
      1. 주의 : 아크릴 아마이드는 흡입 또는 섭취시 독성, 특히 분말 형태로 할 때 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 40 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고에 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것 (<23 ° C, 영역을 통풍이 잘되는).
      2. 주의 : 비스 - 아크릴 아미드, 특히, 흡입하거나 섭취시 유독분말 형 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 2 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고 (<4 ° C에서, 환기가 잘되는 장소)에서 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것.
2. 제조 및 N -Sulfosuccinimidyl -6- (4'- 아지도 -2'- 니트로 페닐 아미노) 헥사 노 에이트의 사용량 분취 (설포 SANPAH는 M은 492.40 g / 몰 _R). 주의 : 설포 SANPAH 눈에 심한 자극을 일으킴; 장갑과 적절한 보안경 · 안면 보호구로 처리합니다. 스토어 수령시 -20 ° C에서 이전, 분취한다.
   1. 설포 - SANPAH를 저장하려면 : 50 ㎎ / ㎖에서 dimethylsulfoxane (DMSO)에 설포 SANPAH을 용해. 튜브 당 20 μl를 50 마이크로 원심 분리기 튜브에 원액을 나누어지는. 드라이 아이스 나 액체 질소에 플래시 동결 -80 ° C에서 저장 (최대 가교제 효율을 유지하기위한 선택 사항이지만 선호 단계).
      참고 : 분취 캘리포니아N 수개월 동안 저장 될 수있다.
   2. 설포 - SANPAH를 사용하려면 : 나누어지는 잠시 해동 및 탈 이온수 480 μL에 희석. 즉시 사용합니다. 설포 SANPAH 물에 빠르게 가수 분해 : 따라서 신속하게 위의 단계를 모두 수행 할주의하십시오.
3. 과 황산 암모늄 (M _R 228.18 g / mol)을 분취의 준비.
   참고 :과 황산 암모늄이 눈, 피부, 호흡기에 자극을 일으킴. 취급시 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 화학 흄 후드에서과 황산 암모늄 분말을 처리합니다. 건조하고 통풍이 잘되는 곳에 보관 분말. 분취하면, 희석 용액은 작업대에 사용될 수있다.
   1. / V w 10 %의 최종 황산 암모늄 농도를 달성하기 위해 증류수에 황산 암모늄을 녹인다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 사용하기 직전에 해동.
4. 콜라겐 타입 I 용액의 조제.
   1. 그래서 주식을 희석하여 0.2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비합니다산도 7.4의 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)의 기술인 것. 얼음에 잠시 보관 또는 희석 즉시 사용한다.

2. 하이드로 겔 준비 (그림 1 참조)

1. 소수성 유리 슬라이드의 준비.
   1. 유리판 상에 소수성 용액의 몇 방울을 넣고 표면을 가로 질러 확산하는 휴지를 사용한다. 공기를 건조 시키과 소수성 코팅을 균일하게 다시 티슈로 닦아냅니다.
      참고 : RT에서 가연성 캐비닛에 보관 소수성 솔루션입니다. 취급시 개인 보호 장비를 착용 할 것. 환기가 잘되는 곳에서 작업 할 수 있습니다.
2. 유연한 플라스틱 지원 준비.
   1. 소수성 코팅 된 유리판의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지체를 잘라.
   2. 가볍게 같은 메스와 같은 날카로운 도구로 표면을 긁어서 유연한 플라스틱 지원의 소수성 측면을 표시합니다.
      참고 : 젤 번 - 완전히 투명 - 마를스크래치 마크는가요 성 플라스틱 지지체 측을 포함하는 겔을 구별 할 수 있도록한다.
      참고 : 유연한 플라스틱 지원은 소수성과 친수성 ​​측면이있다. 일단 침착, 폴리 아크릴 아미드가 영구적으로 쉽게 이후의 하이드로 겔 처리를 용이하게 플라스틱 지원의 친수성 ​​측면을 준수합니다.
3. 젤 제조 예 (실시 예 5 ㎖ 볼륨 겔 전구체 용액 주어진다).
   주 : 겔 초기 두께가 0.5 mm 인 경우는 5 ~ 40 ㎖의 겔을 제조하기에 충분하다. 겔 두께가 감소하는 경우는 겔을 제조 할 수있다.
   1. 50 ML 원뿔 튜브에 원하는 최종 농도 (표 1)의 폴리 아크릴 아미드 전구체 용액의 4972.5 μl를 놓습니다. 열린 캡 30 분 동안 탈 가스 챔버에 배치합니다.
      주 : 산소 자유 라디칼 트랩으로서 작용하며, 본, 그것을 중합을 억제한다.
   2. 과 황산 암모늄의 v / w 10 %의 25 μl를 추가 최종를 달성하기 위해 (1.3 포인트 참조)0.05 %의 황산 암모늄 농도.
   3. N, N, N ', N'- 테트라 메틸 에틸렌 2.5 μl를 추가 0.5 % TEMED 최종 농도를 달성하기 위해 탈기 겔 용액 (TEMED, M은 116.24 g / 몰 _R).
      참고 : 저장 TEMED 실온에서 가연성 캐비닛. 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 때 화학 흄 후드 취급 할 것. 이 높은 공기와 습기 민감로 단단히 불활성 가스 하에서 닫아 보관할 것.
   4. 5 회 - 아래 3을 피펫 팅에 의해 부드럽게 솔루션을 섞는다. 겔 전구체 용액에 산소 확산을 피하기 위해 와동 마십시오.
   5. 소수성 코팅 된 유리 슬라이드와 유연한 플라스틱 지원 및 샌드위치의 친수성면에 겔 용액을 피펫. 원하는 두께 (예를 들면, 0.5 mm)의 실리콘 스페이서 두 개의 슬라이드를 분리합니다. 겔화의 지표로서 사용하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 폴리머 전구체 용액을 소량 (~ 100 μL)를 떠난다.
      참고 :상관 스페이서가 사용될 수있다. 120 μm의 - 예를 들어, 파라 필름의 하나의 스트립 (100)의 최종 두께 팽윤 된 겔을 준다.
   6. 중합시에도 하이드로 겔 표면을 확인하기 위해 유연한 플라스틱 지원 / 젤 샌드위치 꼭대기 다른 유리 접시를 놓습니다.
   7. 원하는 경우에 더 적은 시간이 더 높은 중량 %의 겔에 사용될 수 있지만, 겔, 45 분 동안 중합하자. 겔 중합 된 것을 확인하기 위해, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 남은 용액을 관찰; 나머지 용액을 겔화 한 경우, 그때는 유리판뿐만 아니라, 겔화 개시되었음을 보인다. 그러나, 몰드의 개방 완료 조기 중합을 방지 할 수 있습니다.
   8. 겔이 형성되면, 상부에 공유 적으로 부착 된 폴리 아크릴 아미드 겔로가요 성 플라스틱 지지체를 박리하고, 자연 건조 겔 - 측 업을 설정한다.
      주 : 대류 나 가열 건조는이 공정을 촉진시킬 수있다. 가요 성 플라스틱 지지체 상에 건조 후, 겔 저장소 일 수있다무기한 거라고.
      1. 폴리 아크릴 아마이드 젤이 거품으로 인해 형성하지 않은 유연한 플라스틱 지원의 벌거 벗은 반점을 표시합니다. 젤은 건조되면이 유연한 플라스틱 지원 조화 ​​것으로 표시 겔 여전히 수화된다.

3. 멀티 웰 플레이트 조립, 콜라겐 코팅 및 살균

1. 멀티 웰 플레이트 어셈블리.
   1. 건조되면, 원하는 모양으로 PA 젤을 잘라.
      1. 96- 웰 플레이트를 들어, ~ 6mm 직경의 대형 구멍 펀치를 사용한다. 정사각형 또는 직사각형 모양으로 젤을 잘라 대형 종이 커터를 사용합니다. 또한, 가위를 사용합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 96 웰 플레이트 당 PDMS의 약 500 μl를 준비합니다. 멀티 웰 플레이트의 바닥에 겔 아교, 각 웰의 중앙에 작은 물방울은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 (~ 5 μL)를 올려. 집게를 사용하면, 하나의 폴리 아크릴 아미드를 배치아래 각 웰, 유연한 플라스틱 지원 측면에서 전자 젤. PDMS는, 치료 4 시간의 최소 37 ° C에서 조립 판을 떠날 수 있도록합니다.
2. 폴리 아크릴 아마이드 겔의 콜라겐 코팅.
   1. 전송 피펫으로 소량의 배치 - 설포 - SANPAH (7 8 μl를) 겔 표면에 균일하게 코팅 좌우로 잘 소용돌이 각 (1.2.2를 가리 키도록 참조). 설포 - SANPAH 물 안정되지 않기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다.
   2. 5 분 - (365 nm의 강도 = 37 mW의 λ = 302) 고강도 UV 램프에서 잘 플레이트를 놓습니다. 초과 설포 SANPAH을 제거하기 위해 PBS와 젤을 씻어.
   3. 50 μL 0.2 mg을 피펫 / ㎖ 콜라겐 유형 I 솔루션을 각 웰에 (1.4 포인트 참조). 4 ℃에서 적어도 2 시간 또는 O / N RT에서 커버 플레이트를 남겨주세요.
      주 : 콜라겐 코팅 프로세스 속도, 전송 피펫은 콜라겐 용액을 부가하는데 사용될 수있다. 일반적으로, 1 - 시액 2 방울을 완료하기에 충분합니다LY는 겔 표면을 커버.
   4. 콜라겐 결합을 가능하도록 적어도 2 시간 동안 RT에서 웰 플레이트를 남겨.
   5. 2 시간 동안 조직 배양 후드에서 과도한 콜라겐 용액을 제거하고, UV (λ = 200 ㎚) 하에서 멸균 PBS로 씻어.
   6. 수분과 평형을 O / N (중간 컴포지션 4.1 절 참조) 완전한 매체에 젤을 만끽. 셀은 최대 2 일 동안 냉장고에 바로 저장하거나 시드에 사용합니다.

PA 강성 분석 4. 셀 시드

음표 : 공통 포유류 세포주 전형적인 있지만,이 섹션에 설명 된 프로토콜을 구체적 유방암 MDA-MB-231 세포주와 함께 사용된다 (도 4 및 5 참조).

1. 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 트립신 / EDTA에 노출 조직 배양 플라스크로부터 세포를 수집한다. 문화 플라스크 영역의 각 cm ² 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용; 예를 들면, fo를 트립신 / EDTA 2 ㎖를 사용하여라 T25 세포 배양 플라스크. 다시 일시 원하는 최종 세포 농도로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 완전 배지에 세포를 수집. 계정 배가 시간 셀뿐만 아니라 세포 분석법에 접종 될 시간의 길이를 고려하여 적절한 서브 - 융합 세포 농도를 선택한다. 추가 매체가 완전히 하이드로 겔 잠수함 충분히 있는지 확인하십시오.
   참고 : 하이드로 겔이 매체에 미리 평형 되었기 때문에 충분해야 100 μL 볼륨 (3.2.6 단계를 참조하십시오). 젤 이전 단계에서 언론에 사전 평형 되었기 때문에 멀티 웰 플레이트에 사용되는 일반적인 매체 볼륨은 충분합니다.
   주 : 분석은 첨부 파일에 의존하는 세포 유형에 적합한 것입니다.
   1. hemacytometer를 사용하여 반전 현미경 세포 수를 계산. 로드 (10) 각각의 포트에 hemacytometer 세포 현탁액 μL 및 적어도 8 사분면에서 세포 수의 평균. 를 얻으려면최종 세포 농도가 10 ^(4)에 의해 세포 수를 곱한다.
      참고 : 각 hemacytometer 사분면에 휴대폰 번호가 20 인 경우 최저 세포 수의 결과를 얻을 수있다 - (50).
2. 문화 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 PA 강성 분석 상 세포와 5 % CO _2. 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 5 분 동안 37 ° C에서 5 % 트립신 / EDTA에 노출 됨으로써 필요할 때 세포를 수집한다. 조직 배양 플라스크의 cm ² 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용합니다. 약간 옆으로 멀티 웰 플레이트 팁과 하이드로 겔을 터치 반대로, 잘 각각의 측면 벽에 피펫 팁을 터치하여 흡인 또는 피펫 매체 : 모든 세포 조작 단계 동안, 특별한 하이드로 겔 표면을 방해하지 않도록주의하십시오.
   주 : 표준 조직 배양 처리 동안 하이드로 겔의 표면을 손상하지 않도록 특별한주의하면서 제외한 세포들은 시딩에 것처럼 강성 분석법 동일한 방식으로 조작 할 수있는 상으로 접종일반 멀티 웰 플레이트.

PA 강성 분석에 시드 세포의 5. 이미징

1. 직접 PA 강성 분석에 이미지 세포.
   주 : 상관 현미경 - 반전, 형광 또는 공 촛점은 세포 이미징을 위해 사용될 수있다.
   주 : 강성 분석법을 구성하는 데 사용되는가요 성 플라스틱 지지체는 완전히 투명하며 autofluoresce 또는 세포 이미징을 방해하지 않는다. 그러나,가요 성 플라스틱 지지체 자체가 투명한 경우에도, 결상 성능이 목표의 작동 거리에 의해 제한 될 것이다. 가요 성 플라스틱 지지체는 급격히 감소에 대해 높은 배율, 0.23 mm의 두께 및 10X 대물 렌즈의 작동 거리 전형적인 ~ 4mm 인을 갖는다.
   1. 라이브 세포 이미징의 경우, 현미경 플레이트 홀더와 이미지의 위치 PA 강성 분석. 2 시간에서 영상 세션을 유지, 이상 이미징 회 환경 챔버가 장착 된 현미경을 사용합니다.
   2. 때 살아있는 세포 메신저노화 목표 아니다, 0.1 %의 세제를 보충 4 % 포름 알데히드 용액에 세포를 고정합니다. 2 시간 이상 동안 실온에서 세포를 고정액에 담근다. PBS로 2 회 씻어. 지정 폐기물 용기에 정착 폐기물을 폐기하십시오.
      참고 : 세포는 즉시 이미지를 만들 수 있습니다 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 PBS에 빠져들 저장됩니다. 주의 : 포름 알데히드는 흡입 및 접촉시 독성. 화학 흄 후드 장갑으로 처리합니다.
      주 : 특정 고정 제는 일부 세포 단백질을 손상하기 때문에 세포 정착 프로토콜은 후속하는 세포 염색 및 처리 프로토콜에 기초하여 선택되어야한다.
   3. 형광 이미징의 경우, 얼룩은 멀티 웰 플레이트에서 직접 원하는 셀 얼룩 세포를 고정. 이미지 즉시.

Results

폴리 아크릴 아미드 (PA) 하이드로 겔 널리 강성 - 의존성 세포 반응을 테스트하는 데 사용된다. ^17,24을 아크릴 아미드 (A), 비스 - 아크릴 아미드 (B) 중 하나는 가장 연조직 강성 범위에 걸쳐 PA 겔을 만들 수있는 다양한 농도의 혼합함으로써 몸 - 0.3 -.. 여기에 300 kPa의 탄성 계수 ⁽¹⁾ 그러나, 폴리 아크릴 아마이드 겔의 준비 지루한 시간이 종종 예를 들어 약물 스크리닝으로 "높은 처리량"애플리케이션의 유용성을 제한, 소모 ^(12), 간단하고 빠른 방법 (도 1) 제시된 멀티 웰 플레이트에서 PA 겔 또는 임의의 다른 바람직한 조직 배양 용기된다 조립.도 2a는 몇몇과 B 농도의 함수 (또한, 표 1에 요약)로서 영률을 나타낸다. 추가적인 B와 조합 계수는 문헌에보고되어있다. ^17,25,26 완전히 swolle의 겔 강성10 ㎐...

Discussion

원래 개발 된 전기 영동 겔은 폴리 아크릴 아미드, ^(28)은 현재 일상적으로 세포 형태, 운동성 및 다른 전지 특성 간의 통신 ^3,24,29 기판에 강성의 영향을 연구하는 세포 배양 용 기재로서 사용된다. (그림 2, 표 1도 참조 ^{17,25,26 참조)} 고분자 전구체 농도의 간단한 변화 - (300 kPa의 0.3) ⁽¹⁾ 폴리 아크릴 아미드는 기판 강성의 조작은 신체의 모든 연부 조직의 강성을 포함 할 수 있습니다. PA 겔은 비교적 저렴​​하고 제조하기 간단하다는 사실에 결합 그들은 강성 - 의존성 세포 - 물질 상호 작용의 연구에서 불가결 플랫폼되었다. 간단한 작업에도 불구 그러나, PA 겔을 제조하는 현재의 기술은 작은 배치로 제한된다. 이 제한은 황산 암모늄에 의해 촉매 자유 라디칼 중합이다 하이드로 겔의 겔화 특성, 유래반응은 자유 라디칼 중합 연쇄이므로 및 TEMED. ^30, 그것은 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% 아크릴아미드	Bio-Rad	161-0140
2% 비스-아크릴아미드	Bio-Rad	161-0142
과황산암모늄	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
콜라겐 타입 1, 쥐 꼬리에서, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
소수성 용액 — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
소 태아 혈청	HyClone	SH30073-03
페니실린 스트렙토마이신	MP 바이오메디컬	1670046
세제: Triton-X	시그마 Aldrich	T8787
포름알데히드 37% 용액	시그마 Aldrich	F1635
소 혈청 알부민(BSA)	시그마 Aldrich	A2153
BSA 기반 세포 접착 차단 키트 — ECM 세포 접착 어레이 키트	Chemicon International	ECM540
일회용 실험실 장비
flexible 플라스틱 지지대 — 폴리아크릴아미드 겔용 GelBond PAG 필름	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
유리판	슬럼피	GBS4100SFSL
50ml 원뿔형 튜브	Fisher Scientific	3181345107
15ml 원뿔형 튜브	FALCON	352097
마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	2ml: 02681258
96웰 플레이트 (평평한 바닥)	Fisher Scientific	12565501
일회용 피펫(1  ml, 2  ml, 5  ml, 10  ml, 25  ml, 50  ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2  ml: 05214038, 5  ml (팔콘) : 357529, 10  ml: 13-678-11E, 25  ML: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
유리 전사 피펫	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
피펫 팁 (1-200  μ 엘, 101-1000  μ l)	Fisher Scientific	2707509
플라스틱 표준 일회용 전송 피펫	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
파우더 프리 검사 장갑	Quest	92897
실리콘 스페이서 — 실리콘 시트, 0.5mm 두께/13cm x 18cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/Non-posable lab equipment
Light and Fluescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
현미경 소프트웨어	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV 오븐	UVITRON	UV1080
진공 챔버/탈기 장치	BelArt	999320237
탈기 장치용 진공 펌프	KNF Lab	5097482
조직 배양 후드	NUAIRE	NU-425-600
화학 흄 후드	KEWAUNEE	99151
도립 현미경(Axiovert 25)	Zeiss	663526
인큐베이터	NUAIRE	NU-8500
피펫 에이드	Drummond Scientific Co.	P-76864
혈구계	Bright-Line	383684