3' 미번역 영역(3'UTR)(3'LIFE)에서 기능 요소의 발광 식별은 miRNA 또는 기타 조절 요인에 의한 3'UTR의 기능 조절을 식별하는 기술입니다. 이 프로토콜은 96-well transfection 및 luciferase assay와 같은 고처리량 방법론을 활용하여 기능적 억제에 대한 수백 개의 추정 상호 작용을 스크리닝합니다.
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이 논문에서
요약
초록
3'UTRs의 기능 요소의 발광 식별 (3'LIFE는) 쿼리 3'UTRs 수백의 배열 내의 특정의 miRNAs의 목표의 신속한 식별 할 수 있습니다. 대상은 식별 된 miRNA 타겟팅의 판독 기능을 제공 병진 출력을 측정함으로써 mRNA의 수준에서 결합 검출 듀얼 루시퍼 라제 분석에 기초한다. 3'LIFE은 게놈 와이드 화면을 비 독점 버퍼 및 시약, 그리고 공개적으로 사용할 수 기자 라이브러리를 사용 가능하고 비용 효율적인. 3'LIFE 표준 실험실 환경에서 수행 중 또는 액체 처리 로봇 및 기타 높은 처리량 장비를 사용하여 확장 할 수 있습니다. 우리는 인간의 96 웰 플레이트에 복제 3'UTRs, 2 개의 시험의 miRNAs의 데이터 집합을 사용하는 방법을 설명, 렛 7C 미르-10B. 우리는 96 웰 형식 DNA 준비, 형질 전환, 세포 배양 및 루시퍼 라제 분석을 수행하고, 데이터를 툴을 제공하는 방법을 보여분석. 결론적으로 3'LIFE 매우 재현 신속하고 체계적이며, 높은 신뢰성 목표를 식별합니다.
서론
이 방법의 전체 목표는 정확히 감지하고 높은 처리량에서 마이크로 RNA (miRNA의) 대상을 매핑하는 것이다. 의 miRNAs는 ~ 길이 22 뉴클레오티드 내인성 비 코딩 RNA를합니다. 전사 처리에 따라, 성숙의 miRNAs는 단백질 복합체에 포함되는 복잡한 (RISC)를 침묵 유도 된 RNA를했다. 각각의 miRNA는 번역 억압 또는 mRNA의 절단 1 중 하나의 결과로, 주로 메신저 RNA를의 '비 번역 영역 (3'UTRs) (의 mRNA를)에있는 요소를 대상으로 RISC를 안내합니다. U는 염기쌍을 동요하고있다 퇴화를 자연에서 여러 일치하지 않는 염기 쌍을 포함하는 지역을 불룩 : miRNA의 표준 왓슨 - 크릭 및 G에 기초하여 대상 사이트를 인식하고 있습니다. 대부분의 miRNAs는 크게 그들이 생물학적 역할의 다양한 범위를 재생할 인간 2,3에 식물에서 보존된다. 후생 동물에서의 miRNA는 세포의 운명 결정 4, 발달시기 (5) 등 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수있다 자주 조직 특이 적 발현 양상 6,7을 나타낸다. 의 miRNA misexpression 또한 표적 유전자의 기능만을 기준 셀의 동작에 상당한 영향을 미칠 수있는 비정상적인 유전자....
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프로토콜
1. 세포 배양 (24 ~ 48 시간 형질 전환 이전)
- 종래 형질 전환 종자에 24-48 시간은 96 웰 플레이트의 수에 기초 HEK293T 세포, 충분한 양의 형질 감염된다.
참고 : 일관성있는 형질의 경우, 충분한 밀도 판 세포는 빠르게 분열을 선호하는, 아직 형질의 번에 두 개 이상의 70-90%의 포화 상태에있을 수 없습니다. - 각 96 웰 플레이트 (저장 및 멀티 채널 피펫의 사용을 설명하기 위해 잘 당 75,000 세포 및 플레이트 당 120 우물) 9 × 10 6 세포를 필요로한다. HEK293 세포 (일반적으로 ~ 20 시간)의 배가 시간을 계산하고, 세포의 적절한 수는 트랜시 적어도 9 × 106 세포를 수득 시드. 새로운 플레이트를 다시 시드 나머지 세포 ~ 10 %, ~ 90 % 컨 플루 언시로 성장 145mm 원형 배양 플레이트는 통상적으로 3 96- 웰 형질에 충분하다.
형질 2. 준비 이전
_content "> 참고 :이 시약의 준비 시간이 소요될 수 있기 때문에 단계 2.0-2.2의 버퍼와 플라스미드 DNA의 준비는 이전에 형질 전환에 일을 수행해야한다.- 3'LIFE 분석....
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결과
루미 출력 파일은 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 단백질 원료 측정이 포함되어 있습니다. 와 - Mangone 랩 웹 사이트 (에서 사용 가능한 "3'LIFE 다판 분석"스프레드 시트 -이 원시 형식은 "단판 분석 3'LIFE"와 호환 www.mangonelab.com ). 단판 분석 스프레드 자동 반딧불이 / 레 닐라 비율을 계산 적절한 음성 대조군 miRNA를 각각 정규화하고, 각각의 플레이트에 걸쳐 억압 값을 정규화한다. 스프레드 시트를 자동 낮은 레 닐라 루시퍼 신호 웰을 식별 음성 대조군에 비해 억제를 나타내는 웰을 강조하고, 전체 판에 걸쳐 억압 수단 (도 2)을 제공한다. 통계 분석의 자세한 설명은 (24)을 참조하십시오.
여러 복제 분석 .......
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토론
3'LIFE 분석은 높은 처리량에 3'UTRs에 기능 miRNA의 목표를 식별합니다. 이 분석은 실험적으로 관심에 대한 자신의 miRNA 추정 대상의 다수를 식별 할 목적으로 연구에 유용하다. 3'LIFE 분석은 분석이 miRNA의 타겟팅의 기능 측정, 자신있게 해결할 수있는 하나의 miRNA에 대한 3'UTR :: 단일 기자의 이진 테스트를 제공한다는 점에서 3'UTR 중심의 규제를 조회 할 수있는 강력한 방법이다 개별 유전자의 표적 상태. 이 방법을 확인하기 위해, 우리는 275 3'UTRs의 패널을 상영하고 두 miRNA에 대해, 렛 7C 미르-10B를하고,이 라이브러리에서 10 이전에 검증 대상 유전자를 포함. 이러한 열 유전자 중 8 억압 (24)을 나타내었다. 우리는 또한 검증되지 않은 bioinformatically 예측 대상의 중요한 농축, 그리고 우리의 최고 히트 곡 중 정규 씨의 요소를 포함 예상치 못한 3'UTRs을 관찰,.......
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공개 사항
이 작업은 애리조나 주립대학교의 교양 및 과학 대학과 바이오디자인 연구소의 자금과 NIH 탐색/개발 연구 보조금 1R21CA179144-01A1의 지원을 받습니다.
감사의 글
조언과 토론을 해주신 Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer에게 감사드립니다. Karen Anderson, John Chaput, Josh LaBaer는 시약 및 기기 공유를, Michael Gaskin과 Andrea Throop은 기술 자문 및 프로토콜을 제공했습니다. 저스틴 월터(Justin Wolter)는 마허 장학생이며 마허 가족의 관대한 지원에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 글리실 글리신 | 시그마 | G1127-25G | |
| Kx PO4 | 시그마 | P2222 | |
| EGTA | 시그마 | E3889 | |
| ATP | 시그마 | FLAAS | |
| DTT | 시그마 | D0632 | |
| MgSO4 | 시그마 | M7506 | |
| CoA | 시그마 | C4282 | |
| 루시페린 | 시그마 | L9504 | |
| NaCl | 시그마 | S7653 | |
| Na2EDTA | 시그마 | E0399 | |
| K H2 P O4 | 시그마 | 1551139 | |
| BSA | 시그마 | A2153 | |
| NaN3 | 시그마 | S2002 | |
| 콜렌테라진 | 시그마 | C3230 | |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
| DMEM | 시그마 | D5546 | |
| FBS | 시그마 | F2442 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 | P4333 | |
| 트립신 | T2600000 | ||
| 소모품 | |||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
| 96-웰 미니프렙 플레이트 | Pall | 8032 | |
| 96-웰 셔틀 플레이트 | Lonza | V4SP-2096 | |
| 5x 용해 버퍼 | Promega | E1941 | |
| 악기 | |||
| 96-well GloMax 플레이트 리더 | Promega | E9032 | |
| Biomech FX 액체 핸들러 로봇 | Beckmann | A31842 | |
| 4D-Nucleofector 코어 유닛 | Lonza | AAF-1001 | |
| 96-well 셔틀 시스템 | Lonza | AAM-1001 | |
| 세포 계수기 Countess | Invitrogen | C10227 |
참고문헌
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (680....
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재인쇄 및 허가
