여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.
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이 논문에서
요약
초록
아데노 바이러스 혈청 형 5 (의 Ad5)를 광범위하게 백신 개발을위한 기존의 형질 전환 방법으로 수정되었습니다. 임상 시험 전통적으로 이러한 변형 된 Ad5 벡터의 감소 효능은 주로 인구 중 대다수의 Ad5 기존 면역성 (PEI)과 상관 될 수있다. 의 Ad5 PEI의 우려를 해결하여의 Ad5-벡터화 백신 개발을 촉진하기 위해, 혁신적인 항원 캡시드-설립 전략은 사용되어왔다. 이 전략의 장점으로, 우리가 처음 hexon 셔틀 건설의 Ad5가-벡터화 플라스미드 HVR1-KWAS-HVR5 - 그 이전에 건설 셔틀 플라스미드 HVR5-그의 6 / pH5S에 가변 영역 (HVR) hexon의 1 서브 클로닝하여 6 / pH5S, 그의 6 태그 HVR5에 통합했다있다. HIV 에피토프를 함유 ELDKWAS HVR1이 DNA 단편을 합성 하였다. HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S 후 선형 및 선형 백본 플라스미드 pAd5 / ΔH5 (GL)와 공동으로 형질 전환상동 재조합합니다. pAd5가 / H5는-HVR1이-KWAS-HVR5이-그의 6 세포로 형질 전환 된이 재조합 플라스미드는 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6을 생성합니다. 이 벡터는 실제 바이러스 역가 (VP / ㎖)로 표시 질적 니스 전염성 역가 (IP / ㎖) 및 대응 VP / IP 비율을 갖도록 검증 하였다. 모두 HIV 에피토프와 그의 6 태그는 표면에 노출 된 Ad5 캡시드에 있었고, 자신의 에피토프 특정 항원을 유지했다. 중화 분석은 시험 관내에서의 Ad5 양성 혈청에 의해 중화를 우회하기 위해이 가의 벡터의 능력을 나타내었다. 마우스 예방 접종은 HIV 에피토프 6 그분에 강력한 체액 성 면역 특정의 생성을 보여 주었다. 이 원리 증명 연구 캡시드 항원 혼입 전략과 연관된 프로토콜을 실행 가능하게 상이한 캡시드 단백질을 수정의 Ad5-벡터화 백신의 생성을 위해 이용 될 수 있다고 제안했다. 이 프로토콜은 심지어 수 f를urther 희토류 혈청 형 아데노 - 벡터화 백신의 생성을위한 개질.
서론
인간 아데노 바이러스 (AD)는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함하는 뉴 클레오 캡시드 면체와 중형, 비 - 외피 바이러스이다. 광고는 일곱 그룹으로 분류 (G 통해)와, 아데노 바이러스 제품군에 속한다. 각 그룹은 다른 혈청 형의 바이러스가 포함되어 있습니다. 그룹 C에서, 아데노 바이러스, 이는 혈청 형 5의 (의 Ad5)의 가장 광범위하게 연구되어 왔으며 가장 널리 유전자 치료 백신과 같은 벡터화에 대한 적용 방법.
전통적인 유전자 전략 개발 및 유전자의 관심을 가진 바이러스 초기 유전자의 변위 특징으로 된 Ad5 변형, 적용, 및 유전자의 관심 숙주에서의 발현 집중되었다. 예를 들면 유인원 면역 결핍 바이러스 1 회전 유전자 초기 유전자 3 (E3)을 대체하여 pENV9 / Ad5hrΔE3의 건설이다, 인간 면역 결핍의 개그 유전자 초기 유전자 1 (E1)을 대체하여 AdCMVGag의 건설바이러스 (HIV) 2, 락 Z 유전자 3 (E1)를 교체하여 광고 락 Z의 건설. 의 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 광범위한 애플리케이션은 다음의 장점에 의존의 Ad5, 바이러스 및 바이러스 증식에 가능한 유전자 공학, 외래 유전자 삽입의 대형 숙박 시설과의....
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프로토콜
승인 된 프로토콜 번호 101109272에서 본원에 기재된 버밍엄 기관 동물 사용 및 관리위원회에서 알라바마 대학은 마우스의 사용을 승인했다.
1. 유전 건설 수정 된 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 항원 캡시드-설립 전략
- 셔틀 플라스미드의 건설 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S
- hexon5 유전자의 AccI로 제한 효소 부위 사이 AgeI 합성 DNA 서열 HVR1-KWAS을 함유하는 플라스미드를 주문한다.
- 37 ℃에서 3 시간 동안 효소 AgeI (6 단위)과 AccI (6 단위)으로 합성 된 조각 (HVR1-KWAS)의 6 μg의 다이제스트. 전기 영동에 의한 2 % 아가로 오스 겔에서 분해 단편을 해결 한 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 겔 추출 키트 단편을 정제.
- 삽입의 몰 비율을 바탕으로 3에서 벡터에 : 1, T4 DNA 리가 아제와 리가 B를 사용uffer는 이전에 구축 셔틀 플라스미드 100 NG로 조각 (HVR1-KWAS)의 12 NG를 결찰하는 HVR5-그의 6 / pH5S 2 시간 동안 실온에서 10 μL 볼륨 17, Age....
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결과
캡시드 항원 혼입 전략 (도 1a)은 이가의 Ad5 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 그의-6를 생성하는데 이용되었다. 첫째, 셔틀 플라스미드 HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S가 이전 건설 셔틀 플라스미드 HVR5-그의 6 / pH5S 17에 HVR1-KWAS 단편을 서브 클로닝에 의해 건설되었다. 둘째, 플라스미드 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 (14) "를 EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-을 His6-PmeI"의 조각과 SwaI - 선형화 pAd5 / ΔH5 사이의 상동 재조합에 의해 건설되었다 (GL ) (16) (그림 1B). PACI의 형질 소화 pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-K.......
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토론
백신의 개발을위한 변형 된 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 애플리케이션은 주로 기인 된 Ad5 PEI 4,6-와 연관된 병목 감소되었다. 이 병목 현상은 부분적으로이 전략의 Ad5 NABS에 의해 중화을 회피 할 수 있기 때문에 항원 - 중 - 관심의 Ad5의 중화 에피토프를 대체하여, 다른 항원 캡시드-설립 전략 (그림 1A)의 응용 프로그램에 의해 감소하고, 강력한 면역의 생성을 촉진 할 수있다 통합 된 항원 -의 이익에. 본 연구에서는 수정 된 이가 바이러스 벡터의 생성의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 개념 예 (그림 1B)로 도입되었다. 프로토콜 섹션 1.1.1에 해당하는 주문 플라스미드의 합성 단편 hexon5의 HVR1 로케일에서 HIV-1 gp41 짧은 유전자 치환을 포함한다. 부분 gp41 유전자는 대체 에피토프 ELDKWAS을 인코딩아미노산 hexon5 (14)의 13.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
건강 5T32AI7493-20과 5R01AI089337-03 부여의이 작품은 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 분할을 위한 | DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| 투석 완충액 준비를 위한 | 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 |
| 글리세롤 | SIGMA | G5516-1L | 투석 완충제 준비 |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | 바이러스 용해 완충제 준비를 위한 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | 배양 배지 구성 요소 |
| 100x 비필수 아미노산 & 주의; | Thermo Scientific | 배양 배지 | |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 배양 배지의 SH30238.01 구성 요소 |
| 페니실린/스트렙토마이신 용액 | Cellgro | 30-002-CI | 고 |
| 포도당 DMEM | Thermo Scientific | SH30081.01 | HEK293 세포 배양을 위한 |
| 최소 필수 매체 SIGMA | M5650 | HeLa 세포 배양을 위한 | |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | 은 대형 DNA 정제 |
| 세슘 클로라이드를 위한 제품입니다 | 리서치 제품 국제 공사 | 바이러스 정화를 위한 | C68050 |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | CsCl 용액 준비를 위한 |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | 바이러스 구조 및 고급 |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | 중화 분석을 위한 |
| T-25 플라스크 | Thermo Scientific | 세포 | 배양을 위한 156367; |
| T-75 플라스크 | 코닝 | 430641 | |
| 세포 배양을 위한 | T-175 플라스크 | Thermo Scientific | 159910 |
| 바이러스 정제를 위한 | 초원심분리기 | BECKMAN | NA |
| 용 | 초원심분리기 튜브 | BECKMAN | 344059 |
| nbsp; | 바이러스 투석을 위한 | Thermo Scientific | 66380 |
| ELISA 플레이트 ELISA | Thermo Scientific | 442404 ELISA | |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS 시약 프로그램 | 1475 | 학적 분석을 위한 |
| 마우스 anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | 면역학적 분석을 위한 |
| SOC 매체 | CORNING | 46-003-CR | |
| PCR 마스터 믹스 솔루션 | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mouse bleeding | |
| 바이러스 물리적 적정을 위한 | Eppendorf | Biophotometer |
참고문헌
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al.
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재인쇄 및 허가
