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방법 논문

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

12.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52665

⸱

2015년 5월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

초록

다발성 골수종 (MM), 악성 형질 세포 질환, 난치성 유지 및 신규 약물은 환자의 예후를 개선하기 위해 요구된다. 인해 골 미세 자동 / 분비 성장 인자의 부족으로 인간 MM 세포는 배양하기 어렵다. 따라서, 인간의 MM 세포에 새로운 치료제의 작용을 연구하기 위해 시험 관내 및 생체 내 배양 시스템에서 적절한 확립이 절실히 요구되고있다. 여기서 우리는 시험 관내 및 생체 내에서 복잡한 3D 환경에서 인간 다발성 골수종 세포를 성장 모델을 제시한다. MM 세포주 OPM-2 및 RPMI-8226를 형질 전환 유전자 GFP를 발현하는 형질 감염시키고 인간 중간 엽 세포와 콜라겐의 존재 하에서 배양 하였다 타입 I 입체 타원체로 매트릭스합니다. 더하여, 구 상체는 닭 배아 융모 막 (CAM)에 그래프트 된 종양 성장은 스테레오 형광 현미경에 의해 모니터 하였다. 두 모델 모두 새로운 치료 DRU의 연구를 허용복잡한 3D 환경 및 트랜스 특정 GFP-ELISA에서의 균질화 이식 후 종양 세포 질량의 정량화에 GS. 또한, 직하 숙주 조직으로 호스트 및 종양 세포의 침윤 혈관 신생 반응을 입체 현미경으로 매일 모니터링 및 인간 종양 세포 (기-67, CD138, 멘틴) 또는 호스트 벽화 세포 덮는 혈관에 대해 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다 (최근 desmin / ASMA).

결론적 onplant 시스템은 복잡한 3 차원 환경에서 MM 세포 성장 및 혈관 신생을 연구 할 수 있으며 MM 세포의 생존과 증식을 치료 표적 신규 화합물에 대한 스크리닝을 가능하게한다.

서론

다발성 골수종(MM)은 골수에서 악성 형질 세포의 증식, 뼈 병변 및 면역 결핍을 특징으로 합니다 1. 프로테아좀 억제제(보르테조밉)와 면역조절제(포말리도마이드, 레날리도마이드)와 같은 새로운 치료법이 있지만, MM은 여전히 암울한 예후를 가진 불치의 악성 종양으로 남아 있다 2. 나쁜 예후는 특히 MM 클론의 장시간 치료 및 선택 압력 하에서 치료에 대한 다양한 반응에 기여하는 MM 세포 클론의 특별한 이질성에 의해 설명될 수 있습니다 3.

체외 및 생체 내 신약 및 조합의 전임상 검사는 미래 약물 개발을 위한 중요하고 시간이 많이 소요되는 단계입니다. 따라서 질병의 생물학을 더 잘 이해하고 신약을 발견할 수 있도록 MM의 유용한 생체 내 모델이 필요합니다. 실제로, 혈액 악성 종양 및 치료제에 가장 적합한 이종 이식 모델은 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 마우스 4-7, 비만 당뇨병 / SCID (NOD / SCID) 마우스 8,9 또는 β-microglobulin-knockout NOD / SCID 마우스 10,11.

일부 측면에서 인간 MM의 쥐 모델은 인간 질병의 표현형과 유사할 수 있지만 면역이 결핍된 마우스는 근친 교배이므로 약물에 대한 단일 반응만 시뮬레이션하고 비용이 매우 높습니다. 면역 억제로 인해 동물은 특별한 유지 관리 조건이 필요하며 세포를 더 낮은 동물 생존율로 기술적으로 까다로운 절차를 사용하여 골수에 직접 이식하지 않는 한 마우스에서 인간 MM의 생착은 6 주에서 2 개월이 필요합니다 9, 12 7, 13. 따라서, 줄기세포 기반 오가노이드 모델(organoid model)14, 조직 공학(tissue engineering)15 또는 정교한 3D 세포 배양 모델(16)을 사용하는 새로운 방법이 확립되었습니다. 그들은 가까운 장래에 전임상 약물 테스트를 위한 고전적인 동물 실험과 경쟁할 것이지만 살아있는 유기체의 전신 독성 테스트를 대체할 수는 없습니다.

닭 배아는 17-19세가 부화할 때까지 적응 면역 반응이 부족하기 때문에 인간 세포와 조직의 이종 이식에 적합한 유기체임이 이전에 입증되었습니다. 더욱이, 각 닭 배아는 닭 집단 내의 유전적 다양성으로 인해 적용된 약물 또는 종양 세포에 대한 개별 반응을 반영합니다. 융모대질막(CAM)은 종양 의존성 혈관신생 20-22를 연구하기 위한 잘 정립된 시스템입니다. 고형 종양을 CAM에 이식하면 증식, 침습, 혈관 신생 및 전이를 포함한 생체 내 암의 많은 특성을 나타냅니다 23-27.

CAM 이종 이식 모델20,26,27에 대한 우리 그룹의 이전 경험을 바탕으로 인간 3D 배양 시스템의 장점과 닭 배아 발달 전 모델을 결합한 인간 MM 모델이 수립되었습니다. 이 MM 모델 시스템을 사용하면 MM 성장 진행, 세포 질량 정량화 및 전임상 약물 검사의 실시간 모니터링을 수행할 수 있습니다.

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프로토콜

실험 동물 복지의 hatching.The NIH 사무실이이 지역 (HTTP 작성 지침을 제공 할 때까지 오스트리아 법, 미국 공중 보건 서비스 조류 배아의 실험 동물 복지 사무소에 따르면 라이브 척추 동물로 간주되지 않습니다 // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 및 NIH 출판 번호 : 06-4515).

1. 세포 배양 및 렌티 바이러스 형질

  1. 문화 MM 세포주 OPM-2, RPMI-8226 및 RPMI1640 배지에서 골수로부터 인간 중간 엽 줄기 세포의 존재에서 10 % 소 태아 혈청, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민으로 보충 37 ℃에서 5 % CO 2.
  2. 형질 감염 5 × 30 μL 리포좀 형질 감염 시약과 형질 매체 (10 mL)을 이용하여 바이러스 포장 믹스 (9 μg의) 및 3 μg의 DNA pLenti6 / V5 DEST eGFP는 벡터 6 HEK 293FT 세포. 12 시간 후 형질 매체를 제거하고10 % 소 혈청 및 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 10 ml의 DMEM 배지를 추가한다.
  3. 오일 후, 수영 세포 (1,000 XG, 5 분)의 원심 분리 후 HEK293FT 세포의 상층 액을 수집합니다. 다른 28 설명 된대로 실시간 PCR에 의해 바이러스 역가를 결정합니다.
  4. 완전한 성장 배지에서 24 웰 플레이트에 eGFP는 렌티 바이러스 입자 (1 × 10 5 입자) 1 × 10 6 MM 세포를 형질. 삼일 후, 2 μg의가 / ml로 배양 배지에 첨가하여 블라스트 선택 프로세스를 시작한다. 시중에서 판매하는 eGFP는의 렌티 바이러스를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신을 사용합니다.
  5. 선택 2 주 후, MM 세포를 표현 eGFP는 클러스터가 나타납니다; 원심 분리 (1,000 XG, 5 분)에 의해 세포를 수집하고 실험 영업 이익률-2 eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는의 서브 라인으로 그들을 확장 (제 2, 3).

2. 3D-다발성 골수종 회전 타원체 모델

  1. 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 10 × DMEM 오N 얼음.
  2. 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지 1/10 볼륨 믹스; 7.4의 pH 값에 콜라겐 산성 용액을 중화시키기에 NaOH (0.2 N)을 추가; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다.
  3. 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 RPMI-8226 eGFP는을, 회전 타원체 당 25 만) 혼합 인간 중간 엽 세포 (50,000 세포 / 회전 타원체, 즉, 30 μL 드롭)에 있습니다.
  4. 15ml의 튜브 (1000 XG, 5 분)에서 원심 분리 세포 혼합물, 세포 펠렛을 차가운 제조 콜라겐 혼합물 (1 ㎖)를 첨가하고, (1000 μL 팁으로) 잘 섞는다.
  5. 즉시 멸균 파라핀 필름에 24 웰 플레이트 (100 ㎕의 팁)와 콜라겐 / 세포 혼합액 30 μL 피펫 세포 / 콜라겐 혼합물을 37 ℃ (도 1a 참조)에서 30 분 동안 중합 할 수있다.
  6. 1, 10 및 100 nM의 볼테 조미 브를 포함하는 1 ㎖의 배지와 오버레이 MM의 스페 로이드 (도 1b 참조).
  7. 37 ° C에서 배양 72 시간 후, 문서 회전 타원체로형광 실체 현미경 (도 1C 참조).
  8. GFP의 측정에 반응 튜브 내의 넓은 플랫 턱 겸자를 이용하여 각각의 회전 타원체로 이동 (도 1d 참조).

CAM 3. 3D 다발성 골수종 이종 이식 모델

  1. 3 일 동안 특별한 37 ° C에서 조류 계란 인큐베이터와 70 %의 습도에서 계란을 품어.
  2. 그 후, 열려있는 계란과 전송 배아는 세포 배양 접시의 뚜껑 에탄올, 광장, 10-CM 플라스틱 무게 보트와 함께 소독하고 캠 (그림 2A 참조) 개발할 수 있도록, 더 육일은 "전 비켜"를 품어.
  3. 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 얼음에 10 × DMEM 7.4의 pH 값으로 산성 콜라겐 용액을 중화 (N 0.2) NaOH를 추가 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지의 1/10 양을 혼합; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다.
  4. 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 혼합RPMI-8226 eGFP는; 인간 중간 엽 세포와 회전 타원체) 당 250,000 (50,000 세포 / 회전 타원체).
  5. 15ml의 튜브에서 원심 셀 (1000 XG, 5 분, 각 시험 화합물 1 바이알 용) 세포 펠릿을, (목표 작업 농도) 약물을 1 ㎖를 차가운 준비된 콜라겐 혼합물을 넣고 잘 섞어 (1000 μL의 끝).
  6. 37 ° C에서 세포 외 기질을 중합 할 수 있도록 30 분 동안 잘 페이트 6 콜라겐 방울 파라 필름에 (30 μL 각)을 놓는다.
  7. (2cm 떨어진 배아에서) 9 일 된 닭 배아의 캠의 치료 표면에 집게의 사용과 단계 3.6에서 전송 "onplants"(각 닭 배아 4 onplants, 그림 2B 참조)
  8. 형광 실체 현미경에 의해 생체 내 37 ° C에서 계란 인큐베이터에서 성장과 70 %의 습도, 문서 이종 이식 5 일 후 (그림 2C 참조). 5 시간 동안 냉장고에 4 ° C에서 저체온증으로 닭 배아를 안락사.
  9. 안과 가위에 의해 바로 아래 CAM 조직과 이종 이식을 제거하고 넓은 평면 턱과 포셉. GFP의 측정을 사용합니다 (제 4 장, 2D 그림 참조) 또는 혈관 및 / 또는 침입 종양 세포 (섹션 5)의 면역 조직 화학 분석.

ELISA에 의해 eGFP는 단백질의 정량 4.

  1. 0.5 ㎖의 RIPA 버퍼가 200 μg의 / ㎖ 프로테아제 억제제를 포함에 각 MM은 회전 타원체 또는 절제 이종 이식을 전송합니다.
  2. 얼음에 조직 균질로 회전 타원체 / 이종 이식 균질화.
  3. 액체 질소에 세 동결 / 해동 사이클 및 37 ° C의 물을 욕조를 수행합니다.
  4. 20 분 (12,000g) 및 저장 상층 액을 4 ℃에서 원심 분리기 균질.
  5. 샘플을 ELISA 키트의 분석 버퍼 (200 μL)에 1:20 희석. 제조사의 프로토콜에 따라, 비 오티 닐화 항 GFP 항체를 이용한 ELISA 키트 상업적 GFP-GFP에 의해 레벨을 측정한다.

5. Immunohi혈관에 침입 종양 세포의 stochemical 분석

  1. 4 ° C에서 / 4 % 파라 포름 알데히드 O에서 N을 CAM 지역과 절제 이종 이식을 수정합니다.
  2. 매립 카세트에 고정 이종 놓고 증가 등급 알코올 시리즈 (50 %, 70 %, 80 %, 95 % 에탄올, 크 실롤 파라핀 각각 단계 60 분)으로 매립 조직 스테이션에 전송할.
  3. 벤치 탑 로터리 마이크로톰의 사용에 의해 섹션 이종 이식 (5 μm의). 56 ° C에서 유리 슬라이드의 O / N에 파라핀 섹션 굽는다.
  4. 이중 증류수 감소 등급 알코올 시리즈 의한 Deparaffinize 섹션 (크 실롤, 95 %, 80 %, 70 %, 50 % 에탄올, 이중 증류수, 각 단계에서 10 분).
  5. 항원 검색 용액 수조 (95 ° C, 20 분간)에 항원 검색을 수행하여 (버퍼 citrate-하여 pH 7.0, 100 μL 부피 참조).
  6. 30 분 동안 100 ㎕의 3 % H 2 O 2 / 메탄올 내인성 퍼 옥시 데이즈 활성을 차단.
  7. PBS를 함유하는 차단 부45 분 (부피 100 μL) 10 % 소 태아 혈청.
  8. PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 희석 차 항체 (1μg / ㎖) 100 ㎕와 함께 1 시간 동안 얼룩.
  9. PBS로 3 회 세척 후, PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 비오틴 이차 항체 (0.1 μg의 / mL)로 1 시간 동안 배양.
  10. PBS로 3 회 세척 한 후 제조자의 지시에 따라 아비딘 / 비오틴 - 복합체 (ABC) 및 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질 용액에 의해 발색 반응을 수행한다.
  11. 5.11. 헤 마톡 실린으로 두 번 증류수, Counterstain과에 섹션을 전송하여 반응을 중지하고 합성 설치 매체 섹션을 탑재합니다.

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결과

3D 다발성 골수종 타원체 내 분석 대상 화합물의 시험 관내 분석에서

때문에 체외에서 일차 인간 MM 세포 배양의 한계로는 골수에서 세포 성장 매트릭스 및지지 차 인간 중간 엽 세포 이용하게 인간 MM 세포 라인에 대한 새로운 3D 체외 배양 모델을 확립 (도 1a를, B). EGFP 유전자 MM 셀 라인은 회전 타원체의 3D 성장 후 시각화 및 MM 종양 질량의 정량화 할 수 있습니다. 두 MM 세포주 OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는 스테레오 형광 현미경에 GFP의 발현에 의해 가시화 하였다 볼테 조미 브 및 종양의 증가 농도 (1~100 ㎚)의 존재하에 3 일간 배양 하였다 (도 1C) . 종양 세포 덩어리 GFP-ELISA (도 1에 의해 ...

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토론

내화성 MM에 대한 새로운 치료제의 개발은 약물에 대한 인간 MM 세포 민감도를 평가하는 데 시간이 덜 소요되고 비용이 생체 시스템을 필요로한다. 지금까지, 단 몇 생체 시스템은 새로운 항 골수종 치료의 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 그들 모두는 화합물 라이브러리 (29)의 대규모 스크리닝에 대한 자신의 한계를 가지고있다.

인간의 MM 셀에 대한 가장 좋은 현재의 모델은 높은 면역 결핍 쥐 7,13,30, 터키의 배아 (29)이다. SCID 마우스 및 조류 배아 이종 이식 모델 모두 MM의 생물학을 연구 및 신규 치료 화합물을 시험하기 위해 사용될 수있다. 그러나 쥐의 시스템은 근친 유전자형, 기술적으로 까다로운 절차, 긴 관찰 기간과 높은 비용 등 여러 가지 한계를 가지고있다.

본 연구에서는, 신규 한 3D 타원체 조류 및 이종 이식 모델은 인간 MES의 존재를 포함 인간 MM 세포 생물학 연구를 ...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 금융 이익이 없다

감사의 글

저자는 면역조직화학과 닭 배아 준비에 대한 탁월한 기술적 도움을 준 Cornelia Heis에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금(FWF 보조금 번호 P19552)과 유럽 연합(EU FP7 프로젝트 Optatio No: 278570)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI-8226 세포DSMZACC 9STR 프로파일
OPM-2 세포DSMZACC 50STR 프로파일 인간
중간엽 줄기 세포 PromoCellPC-C-12974
HEK293FT 셀 InvitrogenR700-07
RPMI1640 중간 크기의시그마 AldrichR0883
태아 소 세럼  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Strep 솔루션SigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAASigma Life SciencesM7145
Transfection Medium/Opti-MEM Gibco51985
eGFP 렌티바이러스 입자GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105준비 완료 바이러스 입자
pLenti6/V5Dest6 eGFP 벡터InvitrogenPN 35-1271저자로부터의
ViralpowerTM 패키징 믹스 InvitrogenP/N 35-1275
트랜스펙션 시약/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinInvitrogenR210-01
NeomycinBiochromA2912
Collagen-Type1  쥐 꼬리BD Biosciences354236
DMEM 분말Life TechnologiesArt.Nr. 10338582
플리티뎁신Pharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
SPF-white hen eggsCharles RiverFertilized  white Leghorn  chicken eggs
Plastic weighing boatsneoLabArt.Nr. 1-1125ex-ovo culture
Petridish square (Lids)SimportD210-16ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x)Cell Signaling#9806
Protease 억제제 정제Roche11 836 170 001
완전한 미니 EDTA 프리
GFP ELISACell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
에탄올 앱솔루트Normapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
SuperFrost 현미경 슬라이드R. Langenbrinck 예술 .-Nr.
Labor- u. Medizintechnik03-0060
DakoCytomation 세척 버퍼 10xDakoCytomation코드-Nr.
S 3006
타겟 회수 용액 (10x)  pH 6,1DAKOCode-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA 클론 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 클론 MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin 클론 V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin 클론 D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  클론 MIB-1   다코  M7240
비오틴화 염소 - 안티 마우스 IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Vectastain Elite ABC 키트Vector Laboratories Inc.# PK-6100
FAST DAB 태블릿 세트.시그마 생화학 물질# D4293
Mayer ' s haemalaun 솔루션Merck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
벤치 탑 로터리 마이크로톰Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
조직 임베딩 스테이션Leica, TP1020
달걀 부화기Grumbach BSS160
스테레오 형광 현미경은 디지털 카메라(Olympus E410)와 유연한 냉광과 연결되어 있습니다.올림푸스, SZX10
울트라 터락스 IKA T10균질화기
사용

참고문헌

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