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방법 논문

의 로코 속도에 에탄올의 효과를 측정하는 분석

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52681

⸱

2015년 4월 9일

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

C. elegans는 에탄올의 행동 영향을 연구하는 데 유용한 모델입니다. 우리는 기어가는 벌레의 운동 속도에 에탄올의 영향을 정량화하는 행동 분석을 제시합니다. 이 분석으로 초기 민감도와 에탄올에 대한 급성 기능적 내성의 발달을 모두 측정할 수 있습니다.

초록

알코올 사용 장애는 효과적인 치료 전략이 거의 없는 중요한 공중 보건 문제입니다. 보다 효과적인 치료법 개발을 지연시킨 한 가지 어려움은 에탄올이 행동에 미치는 영향의 분자적 근거에 대한 상대적인 이해 부족입니다. 선충, Caenorhabditis elegans (C. elegans)은 에탄올의 분자적 효과에 대한 가설을 생성하고 테스트하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 여기서 우리는 에탄올에 대한 행동 반응에서 특정 유전자 및 환경 요인의 역할을 조사하기 위해 개발되고 사용된 검정법에 대해 설명합니다. 여기서 행동 출력은 운동입니다. 에탄올은 아가 표면에서의 기어걸음을 급성적으로 억제합니다. 효과는 역동적입니다; 높은 농도에 노출된 동물은 초기 강한 기어걸음 억제, 여기서는 초기 민감성이라고 언급되며, 그 후 약물의 지속적인 존재에도 불구하고 기어걸음 속도를 부분적으로 회복합니다. 이 에탄올 유도 행동 가소성은 여기서 급성 기능적 내성의 발달이라고 언급됩니다. 이 검정법은 이 두 표현형이 구별되고 유전적으로 분리될 수 있음을 입증하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명된 직접적인 운동 검정법은 C. elegans에서 유전자 및 환경 조작이 에탄올에 대한 이러한 급성 행동 반응에 미치는 영향을 조사하는 데 적합합니다.

서론

알코올 사용 장애(AUD)는 널리 퍼져 있으며, 심각한 건강, 사회적 및 경제적 문제를 야기합니다. 인간의 경우, AUD 발병 가능성은 유전자와 환경의 영향을 크게 받습니다1,2. 남용 가능성의 강력한 생리학적 예측 지표는 순수한 음주자가 나타내는 알코올(에탄올)에 대한 초기 반응 수준(LR)입니다3-5. 이 LR 표현형은 유전자 및 비유전자 구성 요소의 영향을 받습니다6. 에탄올에 대한 LR에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 결정하는 것은 에탄올 반응 행동 연구의 중요한 목표입니다.

선형동물인 Caenorhabditis elegans는 에탄올이 행동에 미치는 영향을 연구하는 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다7-9. 선충과 포유류의 신경계 기능 메커니즘에는 강한 분자적 보존이 있으며, 선충의 에탄올에 대한 LR에 영향을 미치는 것으로 나타난 몇몇 유전자가 포유류의 에탄올에 대한 LR에도 영향을 미치는 것으로 나타났습니다10-16, 그리고 인간의 남용 가능성과 관련이 있습니다17-19.

에탄올은 선충을 중독시키며, 이는 선충의 운동 속도 감소로 반영됩니다. 여러 연구실에서 에탄올 효과에 대한 행동 검정법을 개발하였는데, 이는 예를 들어 연구하는 운동 행동(기어 대 유영11,12,14,20,21) 또는 검정이 수행되는 용액의 구성(선충 성장 매체 대 Dent의 식염수20,22)에서 몇 가지 차이점이 있습니다. 흥미롭게도, 이러한 다양한 검정법은 에탄올의 효과에 대해 다소 다른 용량-반응 프로파일을 제공했습니다. 이러한 결과는 기어 및 유영의 기본 행동에 중요한 차이점이 있음을 지적했으며9,23, 에탄올 반응에서 환경 변수인 삼투압의 역할을 강조했습니다20, 그리고 다양한 검정법의 실험적 세부 사항을 설명하는 중요성을 강조했습니다.

여기서는 기어 행동에 대한 에탄올의 급성 효과를 측정하는 검정법을 제시합니다. 이 검정법은 에탄올에 대한 LR에 대한 유전적 및 환경적 영향을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다8,10,20,24,25. 포유류의 LR 표현형은 최소한 두 가지 구성 요소, 즉 에탄올에 대한 초기 민감성 및 에탄올에 대한 급성 기능 내성으로 구성됩니다26,27. 선충에서는 이 행동 검정법을 사용하여 LR 표현형이 이 두 구성 요소로 분리될 수 있음이 나타났습니다. 유전적 및 환경적 조작이 이 두 표현형에 미치는 영향은 이 단일 검정법을 사용하여 조사할 수 있습니다. 중요한 것은 이 두 표현형이 유전적으로 분리될 수 있다는 것입니다.

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프로토콜

분석하기 전에 날에 대해 수행 할 1 단계

  1. 신선한 선충 성장 매체에 L4 무대 웜을 선택 (NGM) 판 OP50 E.의 잔디 파종 20 주 / N에서 대장균, 문화를. 각각의 분석 조건 (10) 웜이 필요합니다; 웜의 O / N 손실을 허용하는 웜의 과잉을 선택합니다.
    1. 첫날 성인들만 분석 동물; 많은 돌연변이가 야생형보다 느린 속도로 성장한다. 테스트 한 모든 동물이 처음 일 성인 있도록 발달 지연이 균주에 대한 따기의 타이밍을 조정합니다.

2 단계 분석의 날에 수행하는

  1. 분석을위한 준비 :
    1. 표준 시드 화 60 X 15mm NGM 판에 분석을 수행합니다. 판 모두 뚜껑 오프로, 2 시간 동안 37 ℃에서 사용하는 건조. 각각의 실험 시험의 경우, 네 건조 NGM 판을 사용한다; 이들은 0 mM의 400 mM의 에탄올 분석 플레이트 및 동반 적응 판을 것입니다.
      참고 :NGM 플레이트의 사용은 여기에 중요하다 판의 조성의 차이가, 특히 그들의 삼투압에 강하게 행동에 에탄올 용량 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 동물 (20)에 의해 축적 된 에탄올의 양의 변화에 적어도 부분적으로 기인한다. NGM 한천 160 mOsm입니다.
    2. 건조 후에, 시드 화 NGM 판 각각이 분석에서 사용 중량을 유의하여야 무게. 빈 접시의 중량을 기준으로 번호판 미디어의 볼륨을 결정한다. 볼륨 한천의 중량의 변환을 근사, 미디어가 같은 부피의 물과 동일한 무게가 있다고 가정한다.
      주 : 당점 일관된 결과가 원래의 10 ml의 용적이 8.3-8.9 ml이다 건조 후의 부피가 충분히 탈수했다 NGM 매체와 함께 밝혀졌다. 2 시간 건조 시간에 대한 대안은 플레이트 044의 차이를 설명하기 위해이 범위의 부피에 도달 할 때까지 건조한다.
    3. 4 구리 반지 (1 내경 용융.6cm) 판의 표면은 약 3 염에 다른 유전자형 또는 worms.Grasp 각각의 집게 링, 열 치료 그룹에 대한 가축 우리 (분젠 버너에서 강한 불꽃이 잘 작동)로 작동으로 초. 여전히 '건너 뛰기'에서 그것을 방지하기 위해 집게로 반지를 잡고 즉시 접시에 반지를 배치합니다.
      1. 링 반지의 여러 지점에서 집게로 가볍게 아래로 눌러 한천의 표면에 평평하게 달려 있는지 확인합니다. 반지를 배치 할 때, 추가로 3 반지를위한 공간을 확보하기 위해주의해야합니다.
      2. 네 개의 모든 카메라의 시야가 맞춰 지도록 함께 가깝게 가능한 올려 놓으주의하면서 판의 표면에 구리 세 개의 추가 고리를 녹아.
        참고 : 한천과 좋은 도장을 만드는 것은 분석하는 동안 링에 벌레를 유지하는 것이 필수적입니다. 접시에 건너 뛸 반지는 한천과 올바른 도장을 할 가능성이 있으며벌레가 파고 할 수 있으며 벌레를 시각화 방해 한천을, 흉터 수 있습니다.
      3. 각 분석 판 건조한 시드되고 더 에탄올을받을 수 없습니다해야 첨부 "적응"판을 준비합니다. 이 판에 네 개의 구리 반지를 놓습니다.
    4. 링 자체의 시야 쓰지주의하면서 옆 링에 사용되는 웜 균주 각각 링 플레이트 하단 레이블. 그 동반 순응 플레이트 분석 플레이트에 레이블을 맞 춥니 다.
    5. 최종 농도가 0 mm로부터 400 mM의 에탄올 (부피 중량)가되도록 각각의 분석 플레이트에 추가 100 % 에탄올의 양을 계산한다. 각각의 실험을 위해 (N = 1), 하나의 0 mM 내지 400 mM의 하나의 에탄올 플레이트있을 것; 순응 판은 에탄올을받지 않습니다. 판의 표면 주위를 피펫 팅, 에탄올을 추가합니다. 플레이트를 밀봉하기 위해 실험실 막을 사용하고 2 시간 동안 벤치 탑에서 평형을 허용한다.
    6. 1.5 시간이 경과하면, 상기 분석 단계 2.2 순응하는 단계를 시작한다.
  2. 운동 분석을 수행 분석 판을
    1. 조심스럽게 순응 접시에 구리 반지의 중심에 각 실험군의 10 웜을 전송합니다. 웜 픽으로 조심스럽게 긁어서이 시점에서 한천에서 볼 수있는 모든 음식을 제거합니다. 동일한 시험 균주에서 동일한 순서로 플레이트 상에 배치되지 않도록 실험군은 실험에 걸쳐 시험 플레이트 상에 배치되는 순서를 다양하다.
      주 : 목표 순응 접시에 식품 분석 플레이트에 전달되면 벌레 음식과 운동에 약물의 효과 가려한다 주위 응집되므로, 식품의 최소량으로 플레이트에 동물을 전송하는 것이다.
    2. 이 벌레가 굴을 할 수 있도록하고, 분석을 방해하므로, 선택과 한천의 표면을 파괴하지 않도록주의하십시오. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 웜.
    3. 각 판의 입문 사이에 적절한 간격이 있는지 확인하십시오. 숙련 된 실험자 (40) 동물, 4 반지 <1.5 분 동안 10 / 반지를 이동할 수 있지만, 2 분까지의 간격은 허용됩니다. 표준 분석은 10 ~ 12 분 0 mM의 400 mM의 에탄올 모두 노출의 30 ~ 32 분에서 기록 영화가 있습니다.
    4. 0 mM의 노출에 대한 순응 판과 약 2 분 30 초 떨어져 두 번째 영화가 시작해야합니다 전에 첫 번째 동영상 파일의 저장이 가능하도록 400 mM의 노출에 대한 적응 판을 시작합니다.
    5. 30 분의 적응 기간 후, 분석 플레이트에 순응 판에서 벌레를 전송합니다. 그들은 각 플레이트의 사이 완료 타이밍을 추적, 순응 플레이트에 첨가하는 것과 동일한 순서로 분석 플레이트에 웜 (0 MM 또는 400 mM의 에탄올)를 전송합니다. 에탄올을 증발 손실을 최소화하기 위해 실험실 필름 : 봉쇄 판.
    6. 유평평해진 선택의 상단에 벌레를 수집하는 얇은 가장자리가 평평 웜 골라 함께 떠 운동을 SE는. 이 선택에 벌레를 붙 도움으로 일반적으로 웜을 전송에 사용되는 박테리아를 사용하지 않고 분석 플레이트에 시드 화 순응 플레이트 웜의 전송을 수행합니다.
      주 : 접시에 제 웜이 플레이트에 첨가 마지막 웜 이상 에탄올에 노출되기 때문에, 동물이 단계에서 전달되는 속도가 매우 중요하고, 이전 시점이 약간의 시간 의존적 효과를 보여줄 수있다. 이 균주는 실험 반복 실험을 통해 처음으로 접시에 배치되는 회전의 주요 이유입니다.
  3. 로코 분석을 수행 얇은 껍질을
    1. 등으로 2048x2048 7.4와 0.5 배 현미경 목적, 0.8 배의 배율 카메라로 시야 (약 42x42 mm 2 광장)에서 네 개의 링을 동시에 이미징 할 수있는 현미경 / 카메라 조합을 사용하여81; m 화소 CCD.
    2. 강도 임계치 단계에서 물체 인식 에이즈 시야에 걸쳐 심지어 조명을 사용하여 (아래 참조). 3 "X3"백라이트가 잘 작동합니다.
    3. 이미지 광원 전송되는 기존의 현미경에 비해 백라이트를 사용하는 경우 손실 대비를 생성하는 판에 배치 미디어 측 최대의 벌레 (덮개 아래).
    4. 이동 벌레의 시간 경과 영화를 캡처 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 2 분 (120 프레임)의 동영상으로, 12 비트 그레이 스케일 이미지 1 초를 캡처 할 수있는 소프트웨어를 설정합니다. 여전히 충분한 이미지 해상도를 유지하면서, 출력 파일의 크기를 줄이기 위해, 1024 × 1024 화소의 이미지를 캡처하는 2 × 2 비닝 모드를 사용한다.
    5. 동영상을 기록합니다. 마지막 웜 후 10 분은 그 판에 배치 된 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)의 120 프레임 동영상 촬영을 시작합니다. 동영상 파일을 저장합니다.
    6. 제 2 플레이트 (400 mM의 에탄올)을 기록한다. 이 과정을 반복마지막 웜 후 30 분부터 두 플레이트는 각각 노광용 30-32 분 시점을 캡처하는 제 1 플레이트 (0 mM의 에탄올)에 배치했다.
      참고 : 분석 할 다음 판으로 녹음을 시작하기 전에 각 캡처 세션 후 이미지 파일을 저장하기에 충분한 시간을 준다.
    7. 보관 된 영화의 미래 교정 및 8 비트 256 그레이 스케일 TIFF 파일에 각 영화의 사본을 변환,이 영화가 개방 및 ImageJ에 (28)와 같은 다른 공개 오픈 소스 이미징 소프트웨어 프로그램에 의해 분석 될 수 있도록.
      주 : 여기에서 설명 된 이미지 분석 소프트웨어 독자적인 파일 포맷을 사용한다.
  4. ImagePro 소프트웨어를 사용하여 영화의 분석.
    1. 촬영 후에는 이미지-Pro 소프트웨어 또는 그와 동등한 Plus를 사용하여 영화를 분석 할 수 있습니다.
      주의 : 다른 물체 추적 소프트웨어의 다양한 여러 성공적 C.을 추적하는 데 사용 된 것을 사용할 한 번에 29 등의 엘레소프트웨어는 합리적 오브젝트의 식별 단계가 유사한 원리에 기초하여 여기서 설명 된 바와 해당 대체 할 수있다. 설명하는 방법은 약간의 차이가있을 수 있습니다 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어 버전 6.0-6.3 및 7.0, 이미지 - 프로 플러스 소프트웨어의 새 버전에 관한 것이다.
    2. 2 분 (120 프레임) 세그먼트에서 영화를 분석 할 수 있습니다. 먼저, 배경 평탄화 및 웜 물체의 콘트라스트를 향상시키기 위해 화상에 필터를 적용한다. 다음과 같이 필터를 선택 : 메뉴> 프로세스> 필터> 향상>는 평평 : 매개 변수 : 배경 = 다크; 폭 = 20 픽스 기능이 있습니다.
    3. 필터링 단계 후 영화를 다시 저장하지만 항상 필터링되지 않은 형태로 원본 동영상을 유지합니다.
      1. 배치 및 구리 반지와 중복 할 수있는 크기이자 (ROI)의 원형 영역과 별도로 각 링에 동물의 운동을 분석한다. 확인하고 메뉴> 측정과 벌레를 추적> 트랙 ... 명령 개체; 이 추적 D를 불러옵니다ATA는 표 창. 추적 옵션 버튼은 특정 트랙을 제외하고 모든 실험 유물을 제한 할 수 있습니다.
    4. 자동 추적 탭에서 다음 매개 변수를 사용 : 트랙 매개 변수 : 속도 제한 (검색 반경) = 400 μm의 / 프레임, 가속 한계 = 자동, 최소 총 트랙 길이 = 400 μm의, 우위 모션 유형 = 혼란; 트랙 매개 변수의 객체는 : 부분 트랙 = 예, 최소 길이 = 21 프레임, 추적 예측 깊이 = 1 프레임을 허용합니다.
    5. 추적 프로세스를 시작하려면, 자동으로 모든 트랙을 찾아 개수 / 크기 옵션 대화 상자와 추적 대화 상자를 표시하는 버튼을 기능을 클릭합니다. 분석 용 웜 오브젝트를 강조하고 밝은 배경 픽셀을 무시하도록 웜 화소의 계조 강도를 사용하는 중요한 임계 공정을 제공 개수 / 크기 대화 상자의 강도 범위 선택을위한 수동 옵션을 선택한다.
      1. 강도 임계 값을 조정 SLI폰더 모든 어두운 오브젝트를 강조 포괄적 범위를 만들기 위해 (하나의 하한을 설정하기 위해, 하나의 상한을 설정하기 위해). 0-4,095의 규모에 0-1,500의 범위는 미세한 튜닝을위한 좋은 출발점이 될 것입니다.
      2. 이러한 구리 링과 접시에 이물질 같은 단일 웜 개체보다 크고 작은 개체를 제외 할 크기의 필터를 적용합니다. 측정과 자세의 다양한 개별 웜에 대한 크기를 덮이 작업을 수행하는 두 개의 크기 매개 변수를 설정> 카운트 / 크기 옵션 대화 상자에서 선택 측정 메뉴 항목을 선택합니다. (지역 범위 : 28,000-120,000 μm의 2 및 경계 범위 : 600-2,500 μm의).
      3. 변이주가 분석 될 접시에 상당히 작거나 다른 동물보다 크면 설정을 변경할 필요가 없도록, 제 동물을 추적하기 전에 균주의 다른 크기를 수용하기 위해 객체 인식 용 필터 설정의 범위를 확장 중간 분석.
    6. 추적 대화 상자에서 계속을 클릭하여 추적 프로세스를 완료합니다. 시각적으로 자동 필터 설정에 따라이를 제외 할 타당한 이유가없는 한 모든 웜이 표시되어 있는지 확인하기 위해 영화의 각 웜의 진행과 출력 트랙을 비교합니다. 수동 필터 크기 기준을 만족 확인 비 웜 물체의 존재에 의해 생성 된 트랙을 삭제.
    7. 각 프레임 사이의 각각의 웜의 속도를 계산하는 소프트웨어를 사용하여 (거리는 프레임 간의 1 초당 물체의 무게 중심에 대해 이동) 및 웜의 인구 모든 트랙에 걸쳐 각 트랙에 대한 평균 속도와 평균 속도를 표시 구리 반지. 마지막 평균이 실험 시험의 관점에서 N = 1로 고려한다. 통계 분석 및 데이터 보관을위한 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 보냅니다.
    8. 데이터가 플레이트에 제 1 링에 대해 기록 된 후, 그 다음에 링 ROI를 놓고매개 변수를 변경하지 않고도, 추적 처리를 반복한다.
    9. 운동을 통해의 상대 속도를 계산 :
    10. 상대 속도 (%) = 처리 치료 (400 mM의) 속도 / (0 mM의) 속도 × 100.
      참고 : 다른 유전 적 조작은 종종 동물의 기저 운동 속도를 변경. 동물의 운동 속도에 대한 에탄올의 효과를 결정하는 다른 유전자형 또는 증상에 걸쳐 이러한 효과를 비교할 수 있도록하기 위해, 상대 속도를 계산한다.

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결과

여러 가지 유전자형과 짝을 컨트롤에서 대표 데이터 (그림 1)는 8,24을 제시; 데이터는 구체적으로 분석 동물에서 그 하이라이트 차이를 선정 하였다. 노출 10 분으로 영향 정도는도 1B-G의 좌측 축 상에 도시되어 균주의 초기 감도 여겨진다. 10 분으로 제어보다 큰 상대 속도와 변이주가, 에탄올 (도 1F, G) 내성 인 것으로 간주되는 반면 (도 1D 에탄올 과민 것으로 간주 제어보다 작은 상대 속도 변이주, E). 도 1의 오른쪽 축 10 및 30 분 사이의 시간주기의 회수 속도의 정도를 나타낸다. 이것은 급성 내성 기능의 개발 (AFT)의 속도의 측정치를 나타내고, 상대 SPE로부터 감산 10 분으로 상대 속도로서 계산된다30 분에 에디션. 큰 복구 값 균주 (도 1C 대조 동물은 AFT 개발의 낮은 속도를 갖는 것으...

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토론

C.에서 사용할 수있는 간단한 신경 생물학 및 유전 적 도구 엘레 웜 행동에 에탄올의 효과의 분자 기초를 공부하는 우수한 모델합니다. 여기서는 8,10,20,24,25을 에탄올 급성 행동 반응의 여러 환경 매개체 분자를 식별하는 데 사용 된 분석법을 설명한다. 이 방법은 함께 포유 동물에서 응답의 수준의 복합 표현형 모델, 분화 및 두 개의 서로 다른 에탄올 응답 행동 표현형, 초기 감도와 급성 기능 관용의 개발을 동시에 검사 할 수 있습니다. 동일한 분석을 용이하게함으로써, 다른 약물의 행동 효과의 평가에서 여러 균주를 동시에 시험을 이용하는 다른 약리학 적 제제를 연구하기 위해 적응 될 수있다.

10-12 분의 시간 창에 변형 등의 초기 감도를 측정하는 데 유용한 시각을 제공한다한올. 노출의 처음 10 분에 걸쳐 400 mM의 에탄올 효과의 분석은 노출되지만 실제로 초 분의 정상 상태 속도부터 효과 에탄올 노광 ...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

R01AA016837 (JCB)와 P20AA017828 (AGD와 JCB) :이 연구는 국립 보건원, 국립 알코올 중독과 알코올 남용 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C. elegans 균주Caenorhabditis 유전체학 센터
60 x 15 mm 페트리 플레이트, 세 배 환기Greiner Bio-One628161다른 플레이트 브랜드도 충분합니다.
NGM 아가다양한NaCl (3 g/L), 아가 (17 g/L), 펩톤 (2.5 g/L), 콜레스테롤 1 ml (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
포집핀셋다양한예: Fisher Scientific #10300
37 °C 인큐베이터다양한아가 건조용
디지털 저울다양한플레이트 무게 및 아가 부피 결정용
구리 링PlumbmasterSTK#35583 (48 캡 스레드 개스킷)1.6 cm 내부 직경, 1.8 cm 외부 직경 구리 링
100% 에탄올다양한
파라필름 MBemisPM996
CCD 카메라QImagingRET-4000R-F-M-12이 카메라는 큰 시야를 가지고 있습니다.
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이미지 및 추적 소프트웨어Media CyberneticsImagePro-Plus v6.0-6.3소프트웨어의 새 버전에는 추적 기능이 있습니다.

참고문헌

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