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방법 논문

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

10.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52685

⸱

2015년 4월 17일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

이 논문에서

요약

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

초록

환경 샘플의 차세대 염기서열분석은 이러한 샘플의 DNA의 양과 품질이 다양하기 때문에 까다로울 수 있습니다. 차세대 염기서열분석에서 최적의 결과를 얻기 위해서는 고품질 DNA 라이브러리가 필요합니다. 물과 같은 환경 샘플은 DNA와 함께 침전되는 오염 물질뿐만 아니라 DNA의 품질과 양이 낮을 수 있습니다. 추출 및 라이브러리 준비와 관련된 기계적 및 효소적 과정은 DNA를 더 손상시킬 수 있습니다. 겔 크기 선택은 염기서열분석 애플리케이션을 위해 정의된 크기의 DNA 단편을 정제 및 회수할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 작업은 DNA 라이브러리 준비 워크플로우에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편의 회수를 완전히 자동화할 수 있습니다.

이 연구에서는 담수 샘플에서 다른 환경 샘플에도 적용할 수 있는 고품질 DNA 라이브러리를 준비하기 위한 고처리량 접근 방식을 설명합니다. 우리는 환경 담수 샘플에서 박테리아 세포를 농축하기 위해 간접적인 접근 방식을 사용했습니다. DNA는 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 추출하고, DNA 라이브러리는 상용 트랜스포존 기반 프로토콜을 사용하여 준비했습니다. 500 - 800 bp의 DNA 단편을 자동 전기영동 워크스테이션인 Ranger Technology를 사용하여 겔 크기를 선택했습니다. 크기가 선택된 DNA 라이브러리의 염기서열분석은 염기서열분석 판독의 판독 길이와 품질에 상당한 개선을 보여주었습니다.

서론

메타유전체학은 존재하는 미생물 군집을 특성화하기 위해 샘플의 모든 유전 물질을 염기서열 분석하는 것을 포함합니다. 이는 추출된 핵산을 DNA 라이브러리로 변환한 후 차세대 염기서열분석을 수행하는 복잡하고 비용이 많이 드는 프로세스입니다. 고품질 라이브러리는 최대의 데이터 출력과 정확한 균유전체학(metagenomics) 분석을 위해 필수적입니다. 물 샘플과 같은 환경 샘플은1-3으로 분해될 수 있는 소량의 DNA와 PCR4-6 억제제의 존재로 인해 고품질 라이브러리를 생성하는 데 상당한 문제를 제기하는 경우가 많습니다.

고품질 라이브러리는 좁은 길이 범위 내에서 더 긴 DNA 세그먼트로 이상적으로 구성됩니다. 염기서열분석 실행당 생성되는 유용한 데이터의 양을 최대화하기 위해 라이브러리에 있는 DNA의 길이는 최소한 사용되는 염기서열분석 방법의 최대 판독 길이만큼 길어야 합니다. Illumina MiSeq와 같은 sequencing-by-synthesis 기술을 사용할 때 DNA 단편의 크기는 flow cell에서 cluster가 생성되는 효율성에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 라이브러리에 더 짧은 DNA 단편과 더 긴 DNA 단편이 모두 포함되어 있는 경우, 짧은 단편은 염기서열분석 데이터7,8에서 과다 표현됩니다. 대조적으로, 유사한 크기의 DNA 단편이 있는 라이브러리는 시퀀싱 데이터에 비례적으로 표시됩니다. 많은 라이브러리 준비 키트는 접합 기반 방법을 사용하여 DNA 단편에 어댑터를 추가하며 인서트를 포함하지 않는 어댑터 이량체를 제거하려면 크기 선택이 필요합니다9,10. 이를 달성하기 위한 수많은 방법(11,12)이 있지만 가장 일관된 결과를 제공하는 한 가지 기술은 DNA의 전기영동 분리에 이어 원하는 길이의 DNA를 복구하는 것입니다(13,14). 이 프로세스는 소수의 샘플에 대해 수동으로 수행할 수 있지만 수백 개의 샘플을 처리해야 하는 경우 자동화된 솔루션이 필요합니다. 자동 겔 크기 선택을 위해 현재 사용 가능한 플랫폼은 낮은 처리량이며 염기서열분석을 위해 많은 수의 샘플을 처리하기 위해 새로운 플랫폼이 필요합니다. Ranger 기술은 기존 액체 취급 워크스테이션과 통합되어 오늘날의 고처리량 환경을 충족하는 규모에서 크기 선택 및 분석 목적으로 아가로스 젤 전기영동을 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 물 수집 및 여과

  1. 여러 사이트 (그림 1)에서 담수 샘플을 수집합니다. 일련의 필터를 통해 샘플을 통과 : 1 μm의 필터, 0.2 μm의 필터, 30 kDa의 차단 접선 흐름 필터 각각 체계적으로 별도의 진핵 세포, 세균 및 바이러스 크기의 입자로합니다.
    참고 : 정제하고 0.2 ㎛의 필터 (유리 살아있는 박테리아)에 회수 된 물질의 분석이보고에서 설명하지만, 유사한 접근법이 필터로부터 회수 다른 입자에 사용될 수있다.

2. 세균 농도 DNA 추출 및 정제

  1. 물 여과 시스템 (개략도, 그림 2)에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 분리합니다. 반으로 0.2 μm의 디스크 필터를 접어 오픈면을 위로하여 50 ㎖ 튜브에 배치합니다. 에 1X 인산 완충 용액 5 ㎖ (PBS)와 0.01 % 트윈, pH가 7.4 추가튜브. 하나 이상의 필터가 공정 중에 사용되는 경우마다 다른 필터 튜브를 이용한다. 4 ° C에서 필터를 저장 튜브 (들)까지 처리. 그렇지 않으면, 2.2 단계로 진행합니다.
  2. 멸균 집게로 50 ML 튜브에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 제거합니다. 페트리 접시에 놓고 필터 (들) (튜브에서 PBS 버퍼를 떠나).
    1. 멸균 집게 및 멸균 가위, 작은 스트립에 필터 (1cm X 1cm)을 잘라. , 70 % 이소프로판올에 몸을 담근 DNA 표면 오염 제거제로 닦아 다른 샘플 사이의 제 1 형의 초순수로 세척하여 집게와 가위를 소독.
  3. 다시 같은 50 ㎖ 튜브에 스트립으로 절단 필터를 놓습니다. 50 ML 튜브에 버퍼의 15 ml의 총이 때문에 필터에 1X PBS 10 ml의 0.01 % 트윈, 산도 7.4을 추가합니다.
  4. 각 50 ㎖ 튜브에 6 청소 텅스텐 구슬 (3 mm 직경)를 추가 20 분 (50 ㎖ 튜브 소용돌이 어댑터를 사용)에 대해 적극적으로 파라 필름과 튜브, 소용돌이 커버. 멀티 포트의 경우이플 필터는 깨끗한 50 ML 튜브에 하나의 샘플, 전송 및 풀 모든 균질 처리됩니다. 4 ℃에서 15 분 동안 3,300 XG에서 튜브를 원심 분리기.
  5. 1.7 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿과 나누어지는 박테리아 세포 (~ 1 분취 량)을 재현 탁. 샘플 당 5 마이크로 원심 튜브가 될 것이라고합니다.
  6. 10 분 동안 10,000 XG에서 마이크로 원심 튜브를 스핀 다운, 200 ~ μl에 마크 아래 상층 액의 대부분을 제거합니다.
  7. -80 ° C에서 샘플을 보관하거나 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 세균의 DNA를 추출로 진행합니다. 세균성 DNA 추출 사용하거나 또는 물 PBS 네거티브 대조군으로서 추출하고, E. 중 양성 대조군으로서 추출 대장균.
  8. 여러 개의 튜브에서 DNA 추출되기 때문에, 하나 둘 ML 튜브에 동일한 샘플에서 병렬 서브 분주 수영장. 이어서 0.1 이루어지는 용액을 사용하여 O / N 침전을 실시3 M 아세트산 나트륨, 100 % 에탄올 2 부피 및 5 ㎍ / μL 선형 아크릴 아미드 5 μL의 볼륨. 잘 혼합 및 저장 샘플 -80 ° C에서.
  9. 4 ℃에서 30 분 동안 최대 속도 (17,000 XG) 원심 분리기. 10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5의 34 μL에 더 이상 5 분에 resuspend DNA 펠릿에 대한 생물 안전 캐비닛에 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올, 건조 공기의 1 ml로 펠렛을 씻으십시오.
    참고 : 선형 아크릴 아미드가 O / N 침전 후 DNA 펠렛을 시각화하는 데 도움이 될 것입니다.
  10. 제조업체의 지침 (재료의 표 참조), 각각 고감도 형광 핵산 정량 분석​​ 및 microvolume 분광 광도계를 사용하여 다음과 같은 DNA의 양과 질을 결정합니다.
    주의 : 샘플을 여러 시간에 제조하는 경우 dsDNA 접시 계 형광 / 분광 정량 고감도 형광 핵산 분석 방법 대신에 사용될 수있다.

3. DNA 라이브러리 준비

  1. 0.2 NG / μL ~의 농도로 물 시료에서 추출한 게놈 세균의 DNA를 정상화.
  2. 트랜스포존 기반 방법 (tagmentation)를 사용하여 세균 DNA 단편의 효소 적 하나 나노 그램. 제조업체의 지침에 따라 조각난 DNA에 어댑터와 인덱스 시퀀스를 추가합니다. 시퀀싱 인덱스가 통합되는 시점에서 제조업체의 지침에 표시된 주제 PCR의 12주기에 샘플을 tagmented.

4. 자동 젤 사이즈 선택

  1. 제조업체의 지침에 설명 된 표준 포스트-PCR 청소 단계를 건너 뛰십시오 (재료의 표 참조). 사이즈 선택 PCR 후 시료를 직접 자동 겔 기반 사이즈 선택 플랫폼을 사용.
    1. 각 샘플에 로딩 버퍼의 3.5 μl를 추가합니다.
    2. 제조업체의 프로토콜에 따라, 300 μl의 추출물에서, 500 ~ 800 bp의 크기 선택 대상을 지정하여 전기 영동 워크 스테이션에 샘플을로드프리 캐스트 1.5 % 아가로 오스를 사용하여 카세트 이온 볼륨.
    3. 에탄올 침전을 통해 25 μL까지 원시 출력 재료 (300 μl를) 집중.
      주 : 대안 적으로, 필터 판 및 진공 매니 폴드를 통해 더 많은 수의 샘플에 대한 농도를 자동화하는 전기 워크 스테이션을 사용한다.
      1. 3 M 아세트산 나트륨 0.1 부피의 100 % 에탄올의 양이 5 ㎍ / μL 선형 아크릴 아미드 5 μL를 사용하여 원시 용출 부피를 석출. -80 ° CO / N에서 잘 장소 샘플을 섞는다. 원심 분리기 샘플을 30 분 동안 17,000 XG에.
      2. 상층 액을 버리고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ml의 DNA 펠렛을 씻어 진행합니다.
      3. 원심 분리기 샘플은 다시 30 분 동안 17,000 XG에서, 상층 액, 건조 공기를 폐기하고, 마지막으로 10 mM 트리스 - CL, 산도 8.5의 25 μL에 DNA 펠렛을 재현 탁.
  2. (선택 사항) 다섯을 할 수있는 자동화 된 젤 크기 선택 플랫폼 선택 DNA 라이브러리 크기의 1 μl를 사용하여트리스 EDTA 완충액, pH가 8.0를 사용하여 희석 -fold. 제조업체의 지시에 따라 dsDNA 품질을 분석하는 칩 기반 모세관 전기 기기를 사용하여 라이브러리를 분석한다.

5. 도서관 정상화 및 시퀀싱

  1. 제조업체의 준비 가이드에 설명 된대로 (트랜스포존 기반 라이브러리 준비 키트에 포함) 라이브러리 정규화 구슬을 사용하여 샘​​플을 정상화 진행합니다.
    1. 대안 적으로, 2 nm의 dsDNA의 최종 농도에 도달 할 등몰 비율로 풀링 하였다 고감도 형광 핵산 정량 분석​​을 사용 dsDNA 라이브러리를 측정한다. 풀링 라이브러리의 10 μL 0.2 N NaOH를 10 μl를 사용하여 라이브러리를 변성 진행, RT에서 5 분 동안 품어. 오후 11시 5분의 최종 1 ml의 부피와 농도 (트랜스포존 기반 준비 키트 포함) 하이브리드 버퍼를 사용하여 변성 라이브러리를 희석.
  2. 로드 샘플제조사의 표준 프로토콜을 시퀀싱 따라 차세대 시퀀싱 플랫폼들.

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결과

DNA 농도 및 품질 평가

세균성 DNA 농도는 0.01 내지 0.11 NG / 유역 다른 사이트의 물 샘플 당 ㎖ (표 1)의 범위였다. 박테리아로부터 단리 DNA 분획은 각각 1.6 260/280 1.8 1.4 0.3 비율 230분의 260 있었다. 230분의 260 비의 일부는 상대적으로 낮은 동안, 명백한 억제 준비된 다른 라이브러리와 하류 어플리케이션에서 관찰되지 않았다. 이러한 응용 프로그램은 PCR 및 qPCR에 16S rRNA 유전자의 CPN 및 60, 그리고 후속 앰플 리콘 시퀀싱 (데이터 미기재) 타겟팅 테스트입니다.

레인저 기술

높은 처리량 자동화 플랫폼 선택된 트랜스포존 - 기반 방법 및 ...

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토론

어댑터 이량 체 우선적으로 현재 플랫폼에서 염기 서열되는 작은 인서트 크기의 클러스터링의 존재는 가능한 수익률과 과소 활용 장비의 용량 (15)의 감소를 나타냅니다. 라이브러리를 준비하는 트랜스포존 기반의 접근 방식과 결합 된 비드 치는 방법의 사용은 추출 4,5의 다른 방법에 비해 DNA 전단이 발생할 수 있습니다. 순서의 분포가 8, 16을 읽고에 그럼에도 불구하고, 추출 및 라이브러리 준비의 모든 방법은 잠재적 편견을 소개합니다. 결찰 기반 방식을 조합 자동 핵산 추출 플랫폼을 사용하여 실험 관찰, 샷건 라이브러리로부터 어댑터 다이머의 과량을 제거하는 것처럼 보이지 않았다 (데이터는 보이지 않음). 본 연구함으로써 어댑터 다이머 또는 작은의 캐리 오버를 최소화 매우 특정한 크기 범위 내에서 선택에 의해 DNA 단편 환경 시료로부터의 라이브러리를 제조하는 변형 된 프로토콜을 채용DNA 단편. 자동화 겔 사이즈 선택 플랫폼의 사용은 500-800 BP ...

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공개 사항

제라드 R. 슬로 보단 매튜 J. 네스 빗 모두 해안 유전체학, 레인저 기술을 제공하는 개인 소유의 브리티시 컬럼비아 기업의 주식을 보유.

감사의 글

이 작업은 Genome BC, Genome Canada 및 Coastal Genomics의 지원을 받았습니다. 저자는 시료 채취 및 처리에 도움을 준 Kirby Cronin과 Michael Chan에게 감사를 표합니다. 또한 생물정보학에 도움을 주신 Thea Van Rossum과 Fiona Brinkman 박사님께도 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
연동 펌프 Masterflex P/S 1400 시리즈Thermo Scientific 1400-1620
0.2 &마이크로; m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
텅스텐 카바이드 비드 3mm (200)Qiagen69997
이소프로필 알코올 70%Jedmon 제품825751헬스케어 플러스
DNA 어웨이VWR7010Molecular BioProducts, Inc. 샌디에고, 캘리포니아
Milli-Q 정수 시스템Fisher ScientificZMQS6VF0Y머크 밀리포어. 이 시스템은 단종되었습니다.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
트윈 20Fisher ScientificBP337-100피셔 화학물질
Vortex 어댑터 2용 (50  ml) 튜브VWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (모델 G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Beckman 원심분리기Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd모델 J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA 분리 키트VWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
24 (1.5-2 ml) 튜브용 Vortex 어댑터VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 원심분리기Beckman Coulter367160
Nimbus Select 워크스테이션 포함 Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01액체 처리 워크스테이션 및 통합 포함 Ranger Tech (전기영동 하드웨어)
Ranger 시약 키트Coastal GenomicsCG-10600-150-12-21로딩 버퍼 및 카세트 포함
에틸 알코올(무수)상업용 알코올P016EAAN그린필드 에탄올
아세트산나트륨 시그마-알드리치S2889-250G
선형 아크릴아미드(5  mg/ml)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf 냉장 원심분리기Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
버퍼 EB(250ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo ScientificND-1000
큐비트 형광측정기Life TechnologiesQ32857Invitrogen. 이 제품은 단종되었습니다.
Qubit dsDNA HS 분석 키트Life TechnologiesQ32854Invitrogen
고감도 DNA 시약Agilent Technologies5067-4626
고감도 DNA 칩Agilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT DNA 시료 준비 키트IlluminaFC-131-1024
Nextera XT 인덱스 키트IlluminaFC-131-1001
MiSeq 시약 키트 v2 (500-cycles)IlluminaMS-102-2003
Miseq 시스템IlluminaSY-410-1003

참고문헌

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