자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

요약

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

초록

환경 샘플의 차세대 염기서열분석은 이러한 샘플의 DNA의 양과 품질이 다양하기 때문에 까다로울 수 있습니다. 차세대 염기서열분석에서 최적의 결과를 얻기 위해서는 고품질 DNA 라이브러리가 필요합니다. 물과 같은 환경 샘플은 DNA와 함께 침전되는 오염 물질뿐만 아니라 DNA의 품질과 양이 낮을 수 있습니다. 추출 및 라이브러리 준비와 관련된 기계적 및 효소적 과정은 DNA를 더 손상시킬 수 있습니다. 겔 크기 선택은 염기서열분석 애플리케이션을 위해 정의된 크기의 DNA 단편을 정제 및 회수할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 작업은 DNA 라이브러리 준비 워크플로우에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편의 회수를 완전히 자동화할 수 있습니다.

이 연구에서는 담수 샘플에서 다른 환경 샘플에도 적용할 수 있는 고품질 DNA 라이브러리를 준비하기 위한 고처리량 접근 방식을 설명합니다. 우리는 환경 담수 샘플에서 박테리아 세포를 농축하기 위해 간접적인 접근 방식을 사용했습니다. DNA는 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 추출하고, DNA 라이브러리는 상용 트랜스포존 기반 프로토콜을 사용하여 준비했습니다. 500 - 800 bp의 DNA 단편을 자동 전기영동 워크스테이션인 Ranger Technology를 사용하여 겔 크기를 선택했습니다. 크기가 선택된 DNA 라이브러리의 염기서열분석은 염기서열분석 판독의 판독 길이와 품질에 상당한 개선을 보여주었습니다.

서론

메타유전체학은 존재하는 미생물 군집을 특성화하기 위해 샘플의 모든 유전 물질을 염기서열 분석하는 것을 포함합니다. 이는 추출된 핵산을 DNA 라이브러리로 변환한 후 차세대 염기서열분석을 수행하는 복잡하고 비용이 많이 드는 프로세스입니다. 고품질 라이브러리는 최대의 데이터 출력과 정확한 균유전체학(metagenomics) 분석을 위해 필수적입니다. 물 샘플과 같은 환경 샘플은^1-3으로 분해될 수 있는 소량의 DNA와 PCR^4-6 억제제의 존재로 인해 고품질 라이브러리를 생성하는 데 상당한 문제를 제기하는 경우가 많습니다.

고품질 라이브러리는 좁은 길이 범위 내에서 더 긴 DNA 세그먼트로 이상적으로 구성됩니다. 염기서열분석 실행당 생성되는 유용한 데이터의 양을 최대화하기 위해 라이브러리에 있는 DNA의 길이는 최소한 사용되는 염기서열분석 방법의 최대 판독 길이만큼 길어야 합니다. Illumina MiSeq와 같은 sequencing-by-synthesis 기술을 사용할 때 DNA 단편의 크기는 flow cell에서 cluster가 생성되는 효율성에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 라이브러리에 더 짧은 DNA 단편과 더 긴 DNA 단편이 모두 포함되어 있는 경우, 짧은 단편은 염기서열분석 데이터^7,....

프로토콜

1. 물 수집 및 여과

1. 여러 사이트 (그림 1)에서 담수 샘플을 수집합니다. 일련의 필터를 통해 샘플을 통과 : 1 μm의 필터, 0.2 μm의 필터, 30 kDa의 차단 접선 흐름 필터 각각 체계적으로 별도의 진핵 세포, 세균 및 바이러스 크기의 입자로합니다.
   참고 : 정제하고 0.2 ㎛의 필터 (유리 살아있는 박테리아)에 회수 된 물질의 분석이보고에서 설명하지만, 유사한 접근법이 필터로부터 회수 다른 입자에 사용될 수있다.

2. 세균 농도 DNA 추출 및 정제

1. 물 여과 시스템 (개략도, 그림 2)에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 분리합니다. 반으로 0.2 μm의 디스크 필터를 접어 오픈면을 위로하여 50 ㎖ 튜브에 배치합니다. 에 1X 인산 완충 용액 5 ㎖ (PBS)와 0.01 % 트윈, pH가 7.4 추가튜브. 하나 이상의 필터가 공정 중에 사용되는 경우마다 다른 필터 튜브를 이용한다. 4 ° C에서 필터를 저장 튜브 (들)까지 처리. 그렇지 않으면, 2.2 단계로 진행합니다.
2. 멸균 집게로 50 ML 튜브에서 0.2 μm의 멤브레인 필터를 제거합니다. 페트리 접시에 놓고 필터 (들) (튜브에....

결과

DNA 농도 및 품질 평가

세균성 DNA 농도는 0.01 내지 0.11 NG / 유역 다른 사이트의 물 샘플 당 ㎖ (표 1)의 범위였다. 박테리아로부터 단리 DNA 분획은 각각 1.6 _260/280 1.8 1.4 0.3 비율 _{230분의 260} 있었다. _{230분의 260} 비의 일부는 상대적으로 낮은 동안, 명백한 억제 준비된 다른 라이브러리와 하류 어플리케이션에서 관찰되지 않았다. 이러한 응용 프로그램은 PCR 및 qPCR에 16S rRNA 유전자의 CPN 및 60, 그리고 후속 앰플 리콘 시퀀싱 (데이터 미기재) 타겟팅 테스트입니다.

레인저 기술

높은 처리량 자동화 플랫폼 선택된 트랜스포존 - 기반 방법 및 .......

토론

어댑터 이량 체 우선적으로 현재 플랫폼에서 염기 서열되는 작은 인서트 크기의 클러스터링의 존재는 가능한 수익률과 과소 활용 장비의 용량 ^(15)의 감소를 나타냅니다. 라이브러리를 준비하는 트랜스포존 기반의 접근 방식과 결합 된 비드 치는 방법의 사용은 추출 ^4,5의 다른 방법에 비해 DNA 전단이 발생할 수 있습니다. 순서의 분포가 ^{8, 16을} 읽고에 그럼에도 불구하고, 추출 및 라이브러리 준비의 모든 방법은 잠재적 편견을 소개합니다. 결찰 기반 방식을 조합 자동 핵산 추출 플랫폼을 사용하여 실험 관찰, 샷건 라이브러리로부터 어댑터 다이머의 과량을 제거하는 것처럼 보이지 않았다 (데이터는 보이지 않음). 본 연구함으로써 어댑터 다이머 또는 작은의 캐리 오버를 최소화 매우 특정한 크기 범위 내에서 선택에 의해 DNA 단편 환경 시료로부터의 라이브러리를 제조하는 변형 된 프로토콜을 채용DNA 단편. 자동화 겔 사이즈 선택 플랫폼의 사용은 500-800 BP .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
연동 펌프 Masterflex P/S 1400 시리즈	Thermo Scientific	1400-1620
0.2 &마이크로; m Supor Membrane	VWR	CA28143-969	Pall Corporation, Ann Harbor, MI
텅스텐 카바이드 비드 3mm (200)	Qiagen	69997
이소프로필 알코올 70%	Jedmon 제품	825751	헬스케어 플러스
DNA 어웨이	VWR	7010	Molecular BioProducts, Inc. 샌디에고, 캘리포니아
Milli-Q 정수 시스템	Fisher Scientific	ZMQS6VF0Y	머크 밀리포어. 이 시스템은 단종되었습니다.
20x PBS pH 7.5	VWR	E703-1L	Amresco, Inc., Solon, OH
트윈 20	Fisher Scientific	BP337-100	피셔 화학물질
Vortex 어댑터 2용 (50  ml) 튜브	VWR	13000-V1-50	MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (모델 G560)	VWR	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
Beckman 원심분리기	Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd	모델 J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA 분리 키트	VWR	12855-100	MoBio, Carlsbad, CA
24 (1.5-2 ml) 튜브용 Vortex 어댑터	VWR	13000-V1-24	MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 원심분리기	Beckman Coulter	367160
Nimbus Select 워크스테이션 포함 Ranger Technology	Hamilton Robotics	92720-01	액체 처리 워크스테이션 및 통합 포함 Ranger Tech (전기영동 하드웨어)
Ranger 시약 키트	Coastal Genomics	CG-10600-150-12-21	로딩 버퍼 및 카세트 포함
에틸 알코올(무수)	상업용 알코올	P016EAAN	그린필드 에탄올
아세트산	나트륨 시그마-알드리치	S2889-250G
선형 아크릴아미드(5  mg/ml)	Life Technologies	AM9520	Ambion
Eppendorf 냉장 원심분리기	Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.	5417R
버퍼 EB(250ml)	Qiagen	19086
NanoDrop 1000 분광 광도계	Thermo Scientific	ND-1000
큐비트 형광측정기	Life Technologies	Q32857	Invitrogen. 이 제품은 단종되었습니다.
Qubit dsDNA HS 분석 키트	Life Technologies	Q32854	Invitrogen
고감도 DNA 시약	Agilent Technologies	5067-4626
고감도 DNA 칩	Agilent Technologies	5067-4626
Agilent 2011 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2938B
Nextera XT DNA 시료 준비 키트	Illumina	FC-131-1024
Nextera XT 인덱스 키트	Illumina	FC-131-1001
MiSeq 시약 키트 v2 (500-cycles)	Illumina	MS-102-2003
Miseq 시스템	Illumina	SY-410-1003