이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
같은 차 림프 부종, 림프 기형 및 림프 종양과 같은 림프 시스템 장애는 상당한 사망률의 원인이 있지만, 거의가 자신의 생물학에 대해 알려진 드문 경우입니다. 질병과 건강한 조직에서 매우 순수한 인간의 림프 내피 세포 (수정체 상피)을 분리하는 것은, 유전 분자 및 세포 수준에서 림프 내피 세포의 연구를 촉진한다. 이들 연구는 이러한 조건의 임상 관리를 변경할 수 있습니다 새로운 치료법에 대한 목표를 공개 할 수 것으로 예상된다. 수정체 상피 및 림프 기형 림프 내피 세포 (LM 수정체 상피) 포피 인간의 고립을 설명하는 프로토콜이 표시됩니다. 획득하기 위해 단일 세포 현탁액 조직 다진 및 효소 디스 파제 II 및 II 콜라겐을 사용하여 처리 하였다. 얻어진 단일 세포 현탁액을 분화 (CD) 마커 CD34, CD31, 혈관 내피 성장 인자 3 (VEGFR-3) 및 PODOPLANIN의 클러스터에 대한 항체로 표지 하였다. 스테인레스네드 가능한 세포는 다른 내피 세포 및 비 혈관 내피 세포에서 CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 LM LEC 인구를 분리하는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)에 분류되었다. 분류 LM 수정체 상피가 배양 및 추가 실험 사용 피브로넥틴 코팅 된 플라스크에 확대했다.
서론
림프계 혈관 시스템의 주요 기능은 림프, 지질, 단백질 및 세포 성분을 함유하는 과량의 간질 유체를 흡수하고, 피 정맥 시스템으로 수행 할 수있다. 임파 모세 혈관의 네트워크가 외부 항원, 면역 감시 및 외래 항원을 중화 백혈구의 전개에 중요한 프로세스의 존재에 대해 스크리닝 림프절 림프 지시한다.
단방향 림프계 초기 림프 모세관, 림프 엔트리 1,2- 허용 특화된 세포 접합부와 박벽 평면 내피 세포의 단일 층을 가진 불연속 독특한 구조와 조직에서 시작한다. 이러한 증가 된 모세관 압력 간극 (3)의 존재 하에서 혈관 붕괴를 방지하기 위해 필라멘트를 고정 통하여 인접 결합 조직 매트릭스에 부착된다. 림프 모세관 수집에 빈 초기 림프 모세 혈관그 큰 림프관이나 혈관에 합체. 비교 림프관 두껍게 혈관벽, 페어링 림프 밸브가 몇 평활근 세포 (4)를 포함하는 불연속 기저막에 의해 이탈되어 수집 임파 모세 혈관 최초. 평활근 세포의 협정 개구 및 림프 밸브 폐쇄 및 수축은 림프 (3)의 흐름을 용이하게한다. 흉관과 오른쪽 림프관 : 인간에서, 신체의 여러 지역에서 림프계 혈관 두 림프 덕트를 형성하기 위해 병합 림프계 줄기를 형성하는 조인. 흉관 가슴 아래 신체의 좌측....
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프로토콜
윤리 문 : 림프 기형 및 포피 조직의 수집을위한 윤리 승인 왕립 어린이 병원, 멜버른, 호주에서 인간 연구 윤리위원회로부터 얻은 것입니다. 서명 동의는 수술 전에 환자의 부모로부터 받았습니다. 조직 샘플은 선택 과목 할례를 받고 임상 관리의 일환으로 수술을받은 LMS 환자로 진단 환자에서 수집되었다. 모든 실험은 국립 보건 의료 연구위원회, 호주의 지침에 따라 수행되었다.
포피와 림프 기형 조직에서 세포 현탁액 1. 준비
- 버퍼 및 미디어 준비.
- EGM-2 미디어를 따뜻하게 부드럽게 37 ° C의 물을 욕조에 키트의 구성 요소를 해동 상용화 EGM-2 MV 총알 키트를 사용하여 완전한 내피 세포 미디어를 준비합니다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 무균EGM-2 미디어에 각 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 일단 모든 구성 요소가 미디어에 추가, '완전한 내피 세포 미디어'등이 미디어를 참조하십시오. 사용하기 전에 내용을 혼합 멸균 50 ㎖ 피펫을 사용합니다.
참고 : 세포 배양에 관한 모든 단계는 클래스 II 생물 학적 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 솔루션은 제조자의 지시에 따라, 4 ℃에서 보관하고 사용하기 전에 실온으로 가온된다. 완전한....
- EGM-2 미디어를 따뜻하게 부드럽게 37 ° C의 물을 욕조에 키트의 구성 요소를 해동 상용화 EGM-2 MV 총알 키트를 사용하여 완전한 내피 세포 미디어를 준비합니다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 무균EGM-2 미디어에 각 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 일단 모든 구성 요소가 미디어에 추가, '완전한 내피 세포 미디어'등이 미디어를 참조하십시오. 사용하기 전에 내용을 혼합 멸균 50 ㎖ 피펫을 사용합니다.
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결과
초기 티슈 소화 후, 분획 시료의 배양 24 시간 후, 별개의 내피 세포 콜로니 함께 섬유 아세포 유사 세포 및 평활근 세포 (도 2A)를 관찰 할 수있다. 다음 정렬 및 세포 배양에서 24 시간 후에, CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 세포가 부착 전형적인 조약돌 형태 (그림 2B 및 C)를 보여줍니다. 상술 한 FACS 방법을 사용하여, 우리는 높은 CD34 CD31 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 내피 세포에서 그들을 99.8 % 순도로 세포를 정제하고 구별 할 수있다. 전략 게이팅 및도 3에 제시되어 정렬 대표 결과.이 문제는 자기 비드 분리 방법을 사용할 때 발생 해결했다. 지금까지 우리는 LM 수정체 상피.......
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토론
수정체 상피 유체 항상성, 외래 항원 흡수 및 일부 영양소의 수송에 대한 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을한다. LEC 항상성은 박테리아 감염 및 종양 전이와 같은 질병 과정에 의해 영향을받을 수 있지만, 수정체 상피 또한 영향을받는 환자에 대한 역기능 림프관 형성 및 이환율을 초래할 체세포 돌연변이를 개발할 수있다. 생체 이식 및 생체 외 실험을 통해 림프 기형 병인 더 이해하고 새로운 치료 방법을 발견하기 위해, 우리는 먼저 CD34 NEG CD31 순위 선택 전략 (15)를 사용하여 자성 비드 선택 전략에 기초 LEC 분리 방법을 개발 하였다. 그러나, 얻어진 배양 물은 종종 제거하기 어려웠다 내피 세포 이외의 세포를 함유 하였다. 그 후, 방법은 CD34 CD31 낮은 순위 VEGR3 (P)를 표현하는 수정체 상피를 정렬 FACS를 이용하여 정제 하였다OS PODOPLANIN 순.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 베이커 재단과 Zerina Lokmic의 지원 로얄 어린이 재단 '과학 원정대의 여성을 인정하고 싶습니다. 앤드류 G. Elefanty와 에두아르 G. 스탠리는 NHMRC 선임 연구 펠로우 있습니다. 자신의 실험실에서 작업은 NHMRC 및 줄기 세포 호주에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | 수술실에서 조직 샘플을 채취하는 데 사용됩니다. |
| EGM-2 MV 총알 키트 | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV 총알 키트에는 EBM-2 배지 500ml와 인간 EGF, 하이드로코르티손, 겐타마이신(GA-1000), 소 태아 혈청(FBS), VEGF, 인간 FGF-b, R3-IGF-1 및 아스코르브산이 포함되어 있습니다. |
| VEGF-C | R& 연구 D Systems | 2179-VC-025 | 완전한 내피 세포 매체는 50 ng/ml VEGF-C |
| 항생제-항진균 용액 (100x) | . Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | 이 용액에는 10,000 페니실린 U/ml, 10,000 스트렙토마이신의 mg/ml 및 25 곰팡이 zone 항진균제의 mg / ml. 1:100 희석에서 사용하십시오. |
| Sigma-Aldrich | F2006 | 의 피브로넥틴 | 10mg/ml 농도에서 사용됩니다. 4 ° C 및 멸균 상태로 유지되었습니다. 7 사용 ml로 150cm2 플라스크를 코팅합니다. |
| StemPro Accutase 세포 해리 시약 | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro ® 액쿠타제® cm당 0.05ml2로 사용되어 플라스크의 전체 표면적을 덮습니다. 더 적은 부피를 사용하면 세포가 불완전하게 분리될 수 있습니다. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | 생존력 염색제로 사용됩니다. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | 0.04% |
| 겐 분해 효소 | Worthington Lab | 4176 | 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | 0.01% |
| 70mm 나일론 셀 스트레이너 | BD Falcon | 352350 | |
| [header] | |||
| PE 활용 VEGFR-3 클론 9D9F9, 클론 WM59 | BioLegend | 356204 | 1:50 희석 |
| PE-Cy7-conjugated CD34, 클론 581 | BioLegend | 343516 | 1:200 희석 |
| APC 접합 마우스 anti human CD31, 클론 WM59 | BioLegend | 303116, | 1:100 희석 |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, 클론 NC-80 | BioLegend | 337006 | 1:200 희석에서 사용 |
| -결합 마우스 IgG1, k isotype, 클론 MOPC-21 | BioLegend | 400112 | 1:50 희석에서 사용 |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | 1:200 희석에서 사용 |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | 1:100 희석 |
| 에서 사용Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | 1:200 희석으로 사용 |
참고문헌
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....
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재인쇄 및 허가
