중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수에서 얻어지며 확장 배양이 필요합니다. 시료가 처리 전에 응고되면 (효소) 혈전용해제인 우로키나아제(urokinase)를 사용하는 프로토콜을 적용하여 혈전을 분해할 수 있습니다. 따라서 세포가 방출되어 확장 배양에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 리샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다.
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방법 논문
효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
일반적으로 골수에서 얻은 중간엽 줄기세포(MSC)는 종종 확장 배양이 필요합니다. 당사의 프로토콜은 임상 등급의 우로키나아제를 사용하여 골수의 혈전을 분해하고 추가 사용을 위해 MSC를 방출합니다. 이 프로토콜은 골수 재샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다. 골수는 MSC의 주요 공급원으로, 조직 공학 및 자가 줄기 세포 치료에 관심이 있습니다. 골수를 빼내면 골수가 응고될 수 있는데, 이는 조혈계의 모든 부분을 구성하기 때문입니다. 그 결과 생성된 혈전에는 확장 배양 또는 직접 줄기 세포 치료를 위해 손실된 MSC도 포함되어 있습니다. 우리는 개 골수 샘플의 74%에서 혈전이 포함되어 있으며 응고되지 않은 샘플에서 예상되는 줄기세포 수의 절반 미만을 산출하는 것을 경험했습니다. 따라서 우리는 노동 집약적이고 비용이 많이 드는 골수 재샘플링을 피하기 위해 이러한 혈전의 효소 분해를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 임상적으로 승인되고 쉽게 구할 수 있는 혈전용해제인 Urokinase는 골수 혈전을 거의 완전히 제거합니다. 그 결과, 처리된 골수 흡인은 응고되지 않은 샘플과 유사한 수의 MSC를 산출합니다. 또한, 우로키나아제 치료 후 세포는 대사 활동과 연골형성, 골형성 및 지방형성 계통으로 분화할 수 있는 능력을 유지했습니다. 당사의 프로토콜은 세포의 품질에 영향을 주지 않고 응고된 혈액 및 골수 샘플을 회수합니다. 이로 인해 재샘플링이 필요 없게 되고, 샘플링 비용이 크게 절감되며, 응고된 샘플을 연구 또는 치료에 사용할 수 있습니다.
서론
중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 재생 의학 및 조직 공학에 중요한 역할을합니다. 그들은 그들에게자가 치료 2,3를위한 이상적인 후보자를 표현하는 다양한 세포 유형 1로 분화와 접목, 마이그레이션 할 수 있습니다. 최근, 뼈와 연골 수리를 위해 중간 엽 줄기 세포를 이용하여 임상 시험은, 호스트 질환이나 심장 질환 이식편 대 4를 출시했다. 이러한 중간 엽 줄기 세포는 제대혈이나 지방 조직에서 수확 할 수 있지만 가장 유망한 결과는 골수 유래 줄기 세포 5 얻었다.
장골 골수 상당한 양의를 수집 할 수 있으므로 흡인 6의 메인 사이트의 역할을한다. 그러나 대기음의 품질 인출 골수 부피가 증가함에 따라 감소한다. 골수 흡 인물의 제 5 ㎖ 고품질의 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 반면, 많은 양의 취하 말초 혈액 F와 흡 인물의 희석에 이르게높은 혈관 뼈 7 롬. 항응고제를 사용하지 않고서 본 거핵 혈소판, 골수 흡 인물은 응고되기 쉽다. 그러나 심지어 항응고제, 혈전이 발생할 수 있습니다.
골수에서 중간 엽 줄기 세포는 전체 풀 (8)의 단지 작은 부분을 나타내고, 대부분의 조직 공학 또는 치료 응용 4 배양에서 확장해야한다. 이러한 문화의 품질은 크게 초기 셀 풀, 즉에 따라 달라집니다., 다양성과 높은 기동 번호 9. 인출에서 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자는 부분적으로 기증자의 변화에 의해 설명 될 수있다. 한편, 낮은 품질의 샘플들로부터 중간 엽 줄기 세포의 수를 달성하기 위해 더 긴 시간 배양 및 계대 확장을 필요로한다. 어느 경우에도, 연장 계대는 세포 노화의 소스이고 10 분화 잠재력의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 셀 (Y)을 극대화 할 수있는 프로토콜을 최적화과의 ield 11,12 악영향이 개발 될 필요가 방지.
우리가 개 중간 엽 줄기 세포와 함께 작업을 시작했을 때 다행히 응고 인간의 샘플 (열에서 하나) 덜 자주있는 동안, 우리는 3 ~ 4 개에서 골수 샘플 혈전 포함 된 것을보고 깜짝 놀랐다. 반면에 우리가 응고 샘플에서 중간 엽 줄기 세포의 훨씬 낮은 수익률을 관찰하는 것이, 놀랍지 않습니다. 응고 된 샘플의 반복 문제를 해결하기 위해, 우리는 리샘플링 대신 혈전 용해 약물 유로 키나아제를 사용하는 프로토콜을 개발했다.
혈전 용해 요법은 심장 마비, 뇌졸중 또는 때문에 원치 않는 응고의 색전증을 일으키는 혈관의 폐색과 같은 생명을 위협하는 상황에 대처 할 수 있습니다. 그들은 플라스 민과 효소 플라스 미노 겐 활성제에 의한 섬유소의 효소 분해를 통해 혈전의 분해에 의해 작동합니다. 환자의 치료에 널리 사용에도 불구하고, 매우 소수의 서적은 활용도가 혈전 활동하는 것이 존재실험실 응용 프로그램이 응고 샘플을 구출하기 위해, 대부분의 림프구에 초점을 맞추고. 1987 년, 니쿠 등. (13)와 4 년 뒤 기능 림프구의 결과로 혈전을 용해 스트렙토의 사용을 설명, 드 비스 등. 유세포 애플리케이션 (14)에 대한 혈액 및 골수에서 백혈병 세포를 분리 스트렙토의 사용을 확장. 최근 간행물은 암 진단 15 Alteplase의 사용을 제안한다. 동일한 효소 적 방법을 사용하는 동안, 우리는 프로토콜 줄기 세포 연구 분야를위한 툴을 제공하는 MSC의 분화능 양식 골수의 분리에 초점을 맞춘다.
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프로토콜
참고 : 장골에서 인간의 골수 흡인는 루체른의 광저우의 윤리위원회의 승인을 기증자를 동의에서 수집되었다. 장골에서 송곳니 골수 흡 인물은 (약. 20 ㎖) 개 오너 consent.Human으로 수집 하였다 송곳니 (약. 10 ㎖) 골수 흡인했다 항 응고 즉시 철수 후 3.8 %의 구연산 나트륨 15ml를 첨가하여 조작 극장에서. 샘플로서 인출 당일 처리 실험실 환경에 옮겼다.
유로키나제 1. 준비 (이전에 1 차 사용에)
- 제조업체의 지시에 따라 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 재구성 유로키나제 : 10 ㎖ 주사기를 사용하여 격막-입구 플라스크에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 1 mL 당 50,000 사출 유닛 (U)을 얻었다 소용돌이에 의해 건조 물질을 녹이고.
- 의에 500 ㎕를 분주 (25,000 U 각)를 준비terile 튜브. 스토어 씩 -20 ° C 및 6 개월 이상 필요할 때 사용.
2. 제조 단계 (이전에 모든 골수 치료에)
- 유로키나제 중 하나 나누어지는 응고 골수 흡인 당 (25,000 U)를 (25 ml의에 흡인 볼륨이 성공적으로 25,000 U의 단일 나누어지는을 사용하여 처리 된) 해동.
- 37 ° C의 물 목욕이나 진탕 배양기를 예열한다.
응고 3. 효소 다이제스트
- 처리 중 골수 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 층류 바이오 안전성 캐비닛의 모든 작업을 수행합니다. 감염 가능성이 인간의 물질로 작업 할 때, 보호 장갑뿐만 아니라 취급에주의의 사용을 권장합니다.
- 멸균 50 ML 튜브의 상단에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 조심스럽게 스트레이너를 기울 또는 응고 물질 주위를 이동, 셀 스트레이너를 통해 골수 흡인 액을 붓는다. 대한 멸균 피펫 팁을 사용하여필터 망을 통해 더 나은 흐름.
참고 : PBS와 혈전을 세척하여, 예를 들면, 혈전의 희석을 피하십시오. 유로 키나아제는 간접적으로 작용하고 혈청의 구성 요소 (예 :., 플라스 미노 겐) 효과 다이제스트에 대한 생검이 필요합니다. 응고 물질과 절차를 계속하면서, 여액을 단계 3.6에 더 사용할 때까지 실온에서 유지 될 수있다. - 무균 핀셋을 사용하여 빈 세포 배양 접시에 골수 응고 재료를 전송합니다. 약 2mm 3 멸균 메스를 사용하여 작은 조각으로 파편을 잘라.
- 무균 핀셋을 사용하여 50 ㎖ 반응 관에 혈병의 작은 조각을 전송. 다진 응고 젖은 모습을 가지고 있는지 확인하십시오. 이 마른 것 같으면, 축축 3.1 단계에서 여과 액의 일부를 사용합니다.
- 로 pipetting 아래 5 ml의 마이크로 타이 피펫을 사용하여 5 회에 의해 혈전을 씹다. 샘플 유로키나제의 1 나누어지는을 추가합니다. 37 ° C에서 어느 수욕 또는 30 분 동안 인큐베이션진탕 (부드럽게) 인큐베이터.
- 로 pipetting 아래 5 ML의 피펫을 사용하여 5 회에 의해 씹다. 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다. 37 ° C에서 또 다른 30 분 동안 품어. 배양 후, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 다시 5 회 연화. 단계 3.2에서 여과와 풀에 신선한 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다.
- 원심 분리기 (500)의 X g에서 10 분 동안 주위 온도에서 세포 현탁액. 상층 액을 제거한다. 설명 또는 MSC 확장 문화에 대한 실험실의 표준 절차에 따라 같은 매체에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
확장 세포 배양 및 CFU 플레이트 4. 시드
- 알파 MEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2.5 ㎎ / ㎖의 암포 테리 신 B로 보충 : 기초 배지 50 ㎖ 중의 (적혈구 및 단핵 세포로 구성됨) 세포를 재현 탁 . 세포에게 노이 바 우어 chambe를 사용하여 트리 판 블루 용액 희석 1:10 카운트R.
- 5 × 107 세포 / ㎠의 밀도로 세포 배양 플라스크에서 세포를 플레이트 및 37 ° C에서 가습 배양기에서 배양한다. 가능하면, 저산소 (5 % 산소) 조건을 사용합니다. CFU 분석 제어시 10cm 직경의 세포 배양 접시에 세포를 10 9 접시.
- 다른 세포 현탁액에 남아있는 동안 배양 3 일 후, 중간 엽 줄기 세포는 세포 배양 접시에 부착된다. 5 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)이 보충 된 기본 배지로 미디어를 변경한다. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 세포 배양 접시를 치료.
- 미디어 일주일에 세 번 교환, 이주의 총 세포 배양을 계속합니다. 세포가 80 % 컨 플루 언시를 초과하면, 트립신 처리에 의해 분리. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 미디어를 교환하지만, 2 주 코스의 세포를 분할하지 않는다.
CFU 분석 5. 김사 얼룩
- 접시 당 김사-용액 10 ml의 준비 : DIL을UTE 원액 (글리세롤 7.6 g / L 김사 : 메탄올) 1시 10분 멸균 물 (항상 신선한 작업 희석을 준비).
- 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 씻어. 페트리 접시에 액체를 적용 할 때 매우 precautious하고 세포를 세척을하지 마십시오.
- RT에서 5 분 동안 순수한 메탄올에 세포를 고정. 메탄올을 폐기하십시오. 김사-솔루션을 추가하고 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 60 분 동안 품어.
- PBS로 2 회 세척 할 것. 공기는 종이 타월에 먼저 판 머리를 건조. 수동으로 식민지를 계산합니다. 이것은 최상의 플레이트의 후방에 마커 펜을 사용하여 달성된다.
6. MSC 차별화
- 개 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고 : 개 중간 엽 줄기 세포는 4 주 동안 해당 매체를 자극하여 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포 계통으로 분화되었다. - 용 지방 세포 분화, 4 × 10 5 CE에서 단일 층의 문화 엽 줄기 세포다음 LLS / cm 2 개의 상이한 배양 조건 교번;
- DMEM + 루타, 3 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 170 mM의 인슐린을 함유하는 지방 형성 유지 배지에서 배양.
- 3 % FBS, 5 % 토끼 혈청, 1 μM 덱사메타손으로 보충 유지 배지 지방 형성 유도 배지에서 배양, 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 33 μM 바이오틴, 5 μM 로시글리타존 16 17 μM 판토텐산.
- 오일 레드 O로 염색하여 지질 방울을 르벨. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 해결 PBS로 세척 및 이소프로판올 0.35 % 오일 레드 O로 염색.
- 7 × 103 세포 / cm (2)와 다음의 자극 단층에서의 조골 세포 분화 중간 엽 줄기 세포 배양의 경우 :
- 고급 DMEM (GIBCO) 루타 + 5 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 501; M L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 10mM의 글리세의 ß-100 nm의 덱사메타손.
- 폰 코사 염색 (5 % AGNO 3)에 의한 광물 예금을 확인합니다. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 고정 5 % 증류수에 AGNO 3 PBS와 얼룩 씻는다.
- 연골 세포의 분화
- 스폰지 형 의료 장치로부터 절단 조각 (면당 3mm)는, 동결 건조 된 콜라겐 형 I로부터 구성되고 셀 (17)을지지하는 지지체 재료로서 사용된다.
- 4 × 106 세포 / ml (~ 70,000 세포 / 큐브)의 농도로 큐브의 위에 시드 엽 줄기.
- 매체의 첨가에 앞서, 세포를 30 분 동안 큐브에 부착 할 수있다.
- DMEM / F12 + 루타, 2.5 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2.5 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 40 NG / ㎖ 덱사메타손 (dexamethasone), 50 ㎍ / ㎖의 아스 코르 빈산으로 구성된 연골 미디어 MSC-콜라겐 구조를 유지 산 -2- 포스페이트,50 ㎍ / ㎖의 L 프롤린, 1X 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 X 및 성장 인자 β1 변형 10 ng / ml이되게 준비 하였다.
- 구조 섹션에 프로테오글리칸의 축적을 시각화하는 알 시안 블루 염색을 사용합니다. 간단히, 0.01 %의 H 2 SO 4 및 0.5M 구아니딘 하이드로 클로라이드에 용해하고 0.4 % 알 시안 블루 섹션 O / N 얼룩. 다음, 세척 섹션은 40 % DMSO와 0.05 M의 MgCl 2에서 30 분 동안 세척 하였다. 세포 핵 빠른 빨간색으로 대조되었다.
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결과
함께 그들은 우리의 실험실 (그림 1A)에 도착했을 때 개 골수 샘플의 74 % (N = 54) 혈전을 포함한다는 사실은 우리가 중간 엽 줄기 세포의 상당수가 혈전 내에 갇혀 있다고 생각했고, 이러한 샘플에서 MSC 수율을 감소 . 실제로, 단면 응고 재의 간단한 DAPI 얼룩은 고밀도 (도 1B)에 유핵 세포의 존재를 확인한다. 이것은 궁극적 유로키나제를 사용하여 프로토콜을 개발하기 위해 우리를 트리거 확장 문화에 사용할 수 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자로 이어집니다. 일반적으로 우리의 프로토콜을 적용 할 때 거의 완전히 사라지는 혈전. 그러나, 방법의 개발 과정에서 우리는 혈전의 문제 이전에 무게에 의해 소화 한 후 체계적으로 소화 해결. 이러한 실험은 소화되지 않은 나머지 15 % (개) 또는 초기 응고 중량 (그림 2A)의 9 % (인간) 것으로 확인된다.
중간 엽 줄기 세포 ...
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토론
환자가 약간의 추가 작업 만이 동작 극장 요원에 의해 수행되어야하는 이점, (우리의 경우 주로 척추 수술) 수술을하는 동안 일상적으로 우리는 골수 샘플. 샘플은 즉시 인출 후 구연산 나트륨과 혼합 되더라도 그들이 처리 실험실에 도착했을 때, 많은 샘플이 부분적으로 응고했다. 이 단계에서, 응고 표본을 대체 할 리샘플링은 별도의 추가 작업이 다시 로컬 또는 전신 마취 6 필요로 할 것이다. 이 기여할 수있는 임상 직원과 기증자 모두의 의지를 필요로하며, 자원 (21)를 많이 사용합니다.
여기에 우리가 능성의 중간 엽 줄기 세포를 분리 응고 골수 샘플에 재조합 인간 유로키나제를 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 유로 키나아제 처리가 세포를 손상시키지 않고 분화 잠재력이 유지되고 있음을 입증 할 수있다. 프로토콜비교 셀 풀을 산출하면서 unclotted 샘플에 비해에만 약 1 ½의 시간에 의해 샘플 처리를 연장하기 때문에 짧다. 지금까지...
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공개 사항
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감사의 글
이 작업은 스위스 국립 재단 보조금 CR3I3_140717/1과 스위스 하반신 마비 재단의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 기초 매체 구성 요소 | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| 아디포제닉 매체 구성 요소 | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| 인슐린 | 시그마 | I5500 | |
| 토끼 세럼 | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | 시그마 | B4639 | |
| 로시글리타존 | 시그마 | R2408 | |
| 판토텐산 | 시그마 | P5155 | |
| 오일 레드-O | Sigma | O0625 | |
| 골형성 매체 성분 | |||
| L-아스코르브산 2-인산 | 염 Sigma | A8960 | |
| ß-글리세로인산 | Sigma | G9422 | |
| 질산은(AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| 연골형성 배지 성분 | |||
| Biopad - 스펀지 모양의 의료 기기 | 유로리서치 | ||
| L-프롤린 | Sigma | P5607 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄 X | Gibco | 51500056 | |
| 인간 형질전환 성장 인자-&베타; 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| 핵 고속 레드 | 시그마 | N8002 | |
| 일반 | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% 트립신-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa 염색 | Applichem | A0885 | |
| 포름알데히드 | Applichem | A0877 | |
| 황산(H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Applichem | A1584 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| 구아니딘 염산염 | Applichem | A1499 | |
| 소모품 | |||
| 50 ml 반응 튜브 | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml 주사기 | Braun | 4606108V | |
| 스테리칸 바늘 (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml 마이크로튜브 | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 &뮤; m cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| 멸균 겸자 | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| 멸균 메스 | Braun | 5518059 | |
| Primaria 세포 피부 접시 | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| 세포 배양 플라스크 - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| 장비 | |||
| 미생물 생물 안전 캐비닛 클래스 II | Skan | 82011500 | |
| 수조 | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes 혈청 학적 피펫 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| 현미경 | Olympus | CKX41 | |
| 가습 인큐베이터 Heracells 240 | Thermo 과학 | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo 과학 | 75004331 |
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