중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수에서 얻어지며 확장 배양이 필요합니다. 시료가 처리 전에 응고되면 (효소) 혈전용해제인 우로키나아제(urokinase)를 사용하는 프로토콜을 적용하여 혈전을 분해할 수 있습니다. 따라서 세포가 방출되어 확장 배양에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 리샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다.
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방법 논문
효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출
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이 논문에서
요약
초록
일반적으로 골수에서 얻은 중간엽 줄기세포(MSC)는 종종 확장 배양이 필요합니다. 당사의 프로토콜은 임상 등급의 우로키나아제를 사용하여 골수의 혈전을 분해하고 추가 사용을 위해 MSC를 방출합니다. 이 프로토콜은 골수 재샘플링에 대한 빠르고 저렴한 대안을 제공합니다. 골수는 MSC의 주요 공급원으로, 조직 공학 및 자가 줄기 세포 치료에 관심이 있습니다. 골수를 빼내면 골수가 응고될 수 있는데, 이는 조혈계의 모든 부분을 구성하기 때문입니다. 그 결과 생성된 혈전에는 확장 배양 또는 직접 줄기 세포 치료를 위해 손실된 MSC도 포함되어 있습니다. 우리는 개 골수 샘플의 74%에서 혈전이 포함되어 있으며 응고되지 않은 샘플에서 예상되는 줄기세포 수의 절반 미만을 산출하는 것을 경험했습니다. 따라서 우리는 노동 집약적이고 비용이 많이 드는 골수 재샘플링을 피하기 위해 이러한 혈전의 효소 분해를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 임상적으로 승인되고 쉽게 구할 수 있는 혈전용해제인 Urokinase는 골수 혈전을 거의 완전히 제거합니다. 그 결과, 처리된 골수 흡인은 응고되지 않은 샘플과 유사한 수의 MSC를 산출합니다. 또한, 우로키나아제 치료 후 세포는 대사 활동과 연골형성, 골형성 및 지방형성 계통으로 분화할 수 있는 능력을 유지했습니다. 당사의 프로토콜은 세포의 품질에 영향을 주지 않고 응고된 혈액 및 골수 샘플을 회수합니다. 이로 인해 재샘플링이 필요 없게 되고, 샘플링 비용이 크게 절감되며, 응고된 샘플을 연구 또는 치료에 사용할 수 있습니다.
서론
중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 재생 의학 및 조직 공학에 중요한 역할을합니다. 그들은 그들에게자가 치료 2,3를위한 이상적인 후보자를 표현하는 다양한 세포 유형 1로 분화와 접목, 마이그레이션 할 수 있습니다. 최근, 뼈와 연골 수리를 위해 중간 엽 줄기 세포를 이용하여 임상 시험은, 호스트 질환이나 심장 질환 이식편 대 4를 출시했다. 이러한 중간 엽 줄기 세포는 제대혈이나 지방 조직에서 수확 할 수 있지만 가장 유망한 결과는 골수 유래 줄기 세포 5 얻었다.
장골 골수 상당한 양의를 수집 할 수 있으므로 흡인 6의 메인 사이트의 역할을한다. 그러나 대기음의 품질 인출 골수 부피가 증가함에 따라 감소한다. 골수 흡 인물의 제 5 ㎖ 고품질의 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 반면, 많은 양의 취하 말초 혈액 F와 흡 인물의 희석에 이르게높은 혈관 뼈 7 롬. 항응고제를 사용하지 않고서 본 거핵 혈소판, 골수 흡 인물은 응고되기 쉽다. 그러나 심지어 항응고제, 혈전이 발생할 수 있습니다.
골수에서 중간 엽 줄기 세포는 전체 풀 (8)의 단지 ....
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프로토콜
참고 : 장골에서 인간의 골수 흡인는 루체른의 광저우의 윤리위원회의 승인을 기증자를 동의에서 수집되었다. 장골에서 송곳니 골수 흡 인물은 (약. 20 ㎖) 개 오너 consent.Human으로 수집 하였다 송곳니 (약. 10 ㎖) 골수 흡인했다 항 응고 즉시 철수 후 3.8 %의 구연산 나트륨 15ml를 첨가하여 조작 극장에서. 샘플로서 인출 당일 처리 실험실 환경에 옮겼다.
유로키나제 1. 준비 (이전에 1 차 사용에)
- 제조업체의 지시에 따라 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 재구성 유로키나제 : 10 ㎖ 주사기를 사용하여 격막-입구 플라스크에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 1 mL 당 50,000 사출 유닛 (U)을 얻었다 소용돌이에 의해 건조 물질을 녹이고.
- 의에 500 ㎕를 분주 (25,000 U 각)를 준비terile 튜브. 스토어 씩 -20 ° C 및 6 개월 이상 필요할 때 사용.
2. 제조 단계 (이전에 모든 골수 치료에)
- 유로키나제 중 하나 나누어지는 응고 골수 흡인 당 (25,000 U)를 (25 ml의에 흡인 볼륨이 성공적으로 25,000 U의 단일 나누어지는을 사용하여 ....
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결과
함께 그들은 우리의 실험실 (그림 1A)에 도착했을 때 개 골수 샘플의 74 % (N = 54) 혈전을 포함한다는 사실은 우리가 중간 엽 줄기 세포의 상당수가 혈전 내에 갇혀 있다고 생각했고, 이러한 샘플에서 MSC 수율을 감소 . 실제로, 단면 응고 재의 간단한 DAPI 얼룩은 고밀도 (도 1B)에 유핵 세포의 존재를 확인한다. 이것은 궁극적 유로키나제를 사용하여 프로토콜을 개발하기 위해 우리를 트리거 확장 문화에 사용할 수 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자로 이어집니다. 일반적으로 우리의 프로토콜을 적용 할 때 거의 완전히 사라지는 혈전. 그러나, 방법의 개발 과정에서 우리는 혈전의 문제 이전에 무게에 의해 소화 한 후 체계적으로 소화 해결. 이러한 실험은 소화되지 않은 나머지 15 % (개) 또는 초기 응고 중량 (그림 2A)의 9 % (인간) 것으로 확인된다.
중간 엽 줄기 세포 .......
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토론
환자가 약간의 추가 작업 만이 동작 극장 요원에 의해 수행되어야하는 이점, (우리의 경우 주로 척추 수술) 수술을하는 동안 일상적으로 우리는 골수 샘플. 샘플은 즉시 인출 후 구연산 나트륨과 혼합 되더라도 그들이 처리 실험실에 도착했을 때, 많은 샘플이 부분적으로 응고했다. 이 단계에서, 응고 표본을 대체 할 리샘플링은 별도의 추가 작업이 다시 로컬 또는 전신 마취 6 필요로 할 것이다. 이 기여할 수있는 임상 직원과 기증자 모두의 의지를 필요로하며, 자원 (21)를 많이 사용합니다.
여기에 우리가 능성의 중간 엽 줄기 세포를 분리 응고 골수 샘플에 재조합 인간 유로키나제를 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 유로 키나아제 처리가 세포를 손상시키지 않고 분화 잠재력이 유지되고 있음을 입증 할 수있다. 프로토콜비교 셀 풀을 산출하면서 unclotted 샘플에 비해에만 약 1 ½의 시간에 의해 샘플 처리를 연장하기 때문에 짧다. 지금까지.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 스위스 국립 재단 보조금 CR3I3_140717/1과 스위스 하반신 마비 재단의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 기초 매체 구성 요소 | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I | |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 | |
| 아디포제닉 매체 구성 요소 | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| 인슐린 | 시그마 | I5500 | |
| 토끼 세럼 | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| Biotin | 시그마 | B4639 | |
| 로시글리타존 | 시그마 | R2408 | |
| 판토텐산 | 시그마 | P5155 | |
| 오일 레드-O | Sigma | O0625 | |
| 골형성 매체 성분 | |||
| L-아스코르브산 2-인산 | 염 Sigma | A8960 | |
| ß-글리세로인산 | Sigma | G9422 | |
| 질산은(AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| 연골형성 배지 성분 | |||
| Biopad - 스펀지 모양의 의료 기기 | 유로리서치 | ||
| L-프롤린 | Sigma | P5607 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄 X | Gibco | 51500056 | |
| 인간 형질전환 성장 인자-&베타; 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| 핵 고속 레드 | 시그마 | N8002 | |
| 일반 | |||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% 트립신-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| Giemsa 염색 | Applichem | A0885 | |
| 포름알데히드 | Applichem | A0877 | |
| 황산(H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | Applichem | A1584 | |
| 염화마그네슘(MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| 구아니딘 염산염 | Applichem | A1499 | |
| 소모품 | |||
| 50 ml 반응 튜브 | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml 주사기 | Braun | 4606108V | |
| 스테리칸 바늘 (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml 마이크로튜브 | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 &뮤; m cell strainer | Falcon | 6.05935 | |
| 멸균 겸자 | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| 멸균 메스 | Braun | 5518059 | |
| Primaria 세포 피부 접시 | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| 세포 배양 플라스크 - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| 장비 | |||
| 미생물 생물 안전 캐비닛 클래스 II | Skan | 82011500 | |
| 수조 | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes 혈청 학적 피펫 5ml | Corning | 4487-200ea | |
| 현미경 | Olympus | CKX41 | |
| 가습 인큐베이터 Heracells 240 | Thermo 과학 | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo 과학 | 75004331 |
참고문헌
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., e....
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