장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 집락화 후 신경능선세포는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커가 있는 뉴런으로 분화해야 합니다. 장 신경계의 주요 신경전달물질 표현형인 콜린성 뉴런은 아세틸콜린의 합성 효소인 콜린 아세틸전이효소(ChAT)를 염색하여 식별합니다. 콜린성 뉴런을 시각화하려는 역사의 노력은 중추신경계와 말초신경계 ChAT에 대한 특이성이 다른 항체로 인해 방해를 받았습니다. 우리와 다른 연구자들은 중추 및 말초 ChAT를 모두 인식하는 태반 ChAT에 대한 항체를 사용하여 배아 장 콜린성 뉴런을 성공적으로 시각화함으로써 이러한 한계를 극복했습니다. 또한, 우리는 이 항체를 ChAT에 대한 유전자 보고자와 비교한 결과, 배발생 시 항체가 더 신뢰할 수 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.
서론
운동성, 영양소 흡수 및 지방 혈액 흐름을 제어 작동 장용 신경계 (ENS)는, 생명에 필수적 일 것이다. ENS는 마이그레이션 그들이 신경 함유 신경 세포와 신경 교세포로 분화 장을, 식민지 증식 신경 능선 세포 (NCC)에 의해 형성된다. 히 르츠 프룽의 질병 (남자 HSCR, 온라인 멘델의 유전 법칙), 1 4,000에서 출산의 빈도와 multigeneic 선천성 장애, 중단 ENS 형성을 연구의 전형 질병으로 간주 될 수있다. HSCR에서 NCC는 마이그레이션 및 말초 hindgut 2의 가변 길이를 식민지화하는 데 실패. 또한, 다른 일반적인 위장 (GI) 등의 항문 직장 기형, 장 atresias 및 운동 장애와 소아의 발달 결함, 기본 ENS 기능의 장애와 연관되고, 가능성이 미묘한, 과소, 해부학 적 변화와 기능적 변화와 관련이있다ENS 3-6. 따라서, 우리는 ENS 형성의 발달 결정을 이해 할 수 있도록 기술은 병인과 소아 위장관 질환의 치료 가능성을 밝혀 수 있습니다.
마이그레이션 및 식민지에 따라, NCC는 신경 전달 물질의 표현형에 대한 특정 마커 신경 세포로 분화. 콜린성 뉴런 장용성 뉴런 (7)의 대략 60 %를 포함하고, 콜린 아세틸....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
위스콘신 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 절차를 승인했다.
솔루션 1. 준비
- 해부 버퍼와 세척 용액으로 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용합니다.
- 병에 설탕과 장소의 30g의 무게로 30 % 자당을 준비합니다. 1X PBS의 99 ML을 추가하고 1 ml의 10 % 아 지드 화 나트륨을 추가합니다. 자당이 모두 용해 될 때까지 잘 혼합. 4 ℃에서 보관이 때까지이 필요합니다.
- 1X PBS, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 트리톤 X-100을 혼합하여 용액을 차단 준비한다. 철저하게 혼합하고 필요할 때까지 냉장고에 보관합니다.
- 1X PBS로 PFA의 적절한 양을 계량하여 1X PBS에서 8 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 준비하고 완전히 용해 될 때까지 65 ° C에서 배양한다. -20 ° C 냉장고에 25 ㎖ 씩에 보관이 필요할 때까지. 사용 당일 1X PBS로 4 % PFA로 희석.
2. 배아 및 굿 해부이온
- 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 프로토콜을 승인, 초과 임신 한 마우스를 안락사와 PBS 1X 60mm 페트리 접시 포함 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리는 이전하는 ChAT 식 (14)을 검출하고 tdTomato GFP 형광 리포터를 모두 발현하는 생쥐의 발생을 설명 하였다. floxSTOP : 간단히, 채팅-Cre 호텔 마우스가 R26R와 결합 된 생산 tdTomato 동물 채팅-Cre 호텔을, R26R을 : floxSTOP : (간담 Cre 호텔 tdTomato라고도 함) tdTomato 마우스. 이 동물은 다음 동형 접합 간담 GFP 기자 마우스를 결합했다. 배아를 분리 하였다 및 조직은 고정되기 전에 해부 및 표 1 항체로, 상기와 같이 면역 염색 하였다. 원위 소장 (SI) 및 근위 결장은 E11, E13.5 및 E16.5로 분석 하였다
E11에서, 주석 - 양성 신경 말단 SI 내에 존재하지만 아직 NCC 근위 결장 (도 1)에 도달하지 않았다. 이 시점에서, 주석 -.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리의 실험실과 다른 사람은 HSCR의 장 결함도 ganglionated 소장 5,15,16에, aganglionic 콜론으로 제한하지만 근위 확장되지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 변화는 ENS 신경 세포 밀도와 신경 전달 물질 표현형의 변화를 포함 HSCR 환자에서 관찰 된 운동 장애에 대해 설명 할 수있다. 우리는 ENS 형성의 결정을 이해하는 우리의 노력에 위의 기술을 활용했다. 구체적으로는, 이들 기술은 신경 산화 질소 합성 효소 (nNOS의) 뉴런, 혈관 활성 장 폴리 펩타이드 뉴런 (VIP),뿐만 아니라 아세틸 콜린 (하는 ChAT) 뉴런 (표 2)를 5 시각화하는데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 면역 또는 매립 및 저온 절편에 대해 하나, 이후 처리를 위해 30 % 수크로오스에 샘플을 저장하기위한 기능이다.
창자의 NCC의 식민지가 진행 파면 F로 발생E14.5에 롬 E9.5. 뉴런을.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 미국 소아 외과 협회 재단 상 (AG) 및 건강 K08DK098271의 국립 연구소 (AG) bythe 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인산염 완충 식염수 | 옥소이드 | BR0014G | |
| 자당 | Fisher | S2 | |
| 아지드 나트륨 | Fisher | BP9221 | |
| 소 혈청 알부민 | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm 페트리 접시 | 피셔 | FB0875713A | |
| 형광 현미경 | 니콘 | SMZ-18 입 | |
| 현미경 해부 현미경 | 니콘 | SMZ-18 입체 | |
| 미세 겸자 | 정밀 과학 도구 | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf 튜브 | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, 버밍엄, AL | 0100-01 | |
| 유리 슬라이드 | Fisher | 12-550-15 | |
| 커버 유리 | VWR | 16004-330 | |
| 컨포칼 현미경 | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
참고문헌
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
