Method Article

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

DOI:

10.3791/52722

⸱

April 3rd, 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 외 소포 (전기 자동차), 각종 세포에서 방출 막의 입자는, 임상 적용을위한 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은 핵산과 단백질화물을 포함 점점 진핵​​ 생물과 원핵 세포 모두에 의해 사용되는 세포 간 의사 소통의 수단으로 인식하고 있습니다. 그러나, 작은 크기로, 전기 자동차의 분리를위한 현재의 프로토콜은 종종 시간이 소요, 복잡하고, 이러한 초 원심 분리기와 같은 큰 샘플 볼륨과 고가의 장비를 필요로합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 쉽게 효율적이고, 10 μL로 낮은 샘플 볼륨을 필요 전기차의 서브 그룹들을 분리하기위한 종이 기반 면역 플랫폼을 개발했다. 생물학적 시료는 화학적으로 특정한 EV 표면 마커에 높은 친 화성을 가지고 포획 분자로 변성 된 종이 테스트 존에 직접 피펫 팅 될 수있다. 우리는 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 분석의 유효성을 확인, 종이 기반 효소 결합 immunosorbent 분석 (P-ELISA)과 전 사체 분석. 이 종이 기반의 디바이스는 건강과 질병에 EV 기능에 대한 우리의 이해를 발전하기 위해 병원과 연구 환경에서 전기 자동차의 연구를 가능하게 할 것이다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포외 소포체(EV)는 크기가 40nm에서 5,000nm인 이질적인 막질 입자이며 다양한 생물 발생 경로1-9를 통해 많은 세포 유형에 의해 활발하게 방출됩니다. 그들은 DNA, RNA, 단백질 및 부모 세포의 표면 마커의 독특하고 선택된 부분 집합을 포함합니다. 세포간 통신(intercellular communication)10, 면역조절(immunity modulation)11, 혈관신생(angiogenesis)12, 전이(metastasis)12, 화학저항력(chemoresistance)13, 안과 질환(Eye diseases)9의 발병과 같은 다양한 세포 과정에 대한 그들의 관여는 점점 더 인식되고 있으며, 진단, 예후, 치료 및 기초 생물학 응용에서의 유용성에 대한 큰 관심을 불러일으키

고 있다.

EV는 생물 발생 또는 세포 기원에 따라 엑소좀, 미세소포체, 세포자멸사, 종양소체, 엑토솜, 미립자, 텔레로솜, 프로스타토솜, 카디오솜, 벡소좀 등으로 고전적으로 분류할 수 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 다소포체(multivesicular body)에서 형성되는 반면, 미세소포(microvesicle)는 원형질막(plasma membrane)에서 직접 발아하여 생성되며, 자가사멸 소포(apoptotic vesicle)는 자가사멸 세포(apoptotic cell) 또는 괴사세포(necrotic cell)에서 생성됩니다. 그러나 명명법은 여전히 정제되지 않았는데, 부분적으로는 EV에 대한 철저한 이해와 특성화가 부족하기 때문입니다. EV를 정제하기 위해 초원심분리(ultracentrifugation) 14, 한외여과(ultrafiltration) 15, 마그네틱 비드(magnetic beads)16, 고분자 침전(polymeric precipitation 17-19), 미세유체 기술(microfluidic techniques) 20-22 등 여러 가지 방법이 개발되었습니다. EV를 정제하는 가장 일반적인 절차에는 큰 파편 및 기타 세포 오염 물질을 제거하기 위한 일련의 원심분리 및/또는 여과가 포함되며, 비용이 많이 들고 지루하며 비특이적인 프로세스인 최종 고속 초원심분리가 포함됩니다14,23,24. 불행히도 만족스러운 순도와 효율성을 갖춘 EV의 빠르고 신뢰할 수 있는 절연에 대한 기술적 요구는 아직 충족되지 않았습니다.

우리는 EV22의 하위 그룹을 분리하고 특성화하는 간단하고 시간과 비용을 절약하면서도 효율적인 방법을 제공하는 종이 기반 면역친화성 장치를 개발했습니다. 정의된 모양으로 절단된 셀룰로오스 종이는 관통 구멍이 등록된 두 개의 플라스틱 시트를 사용하여 배열하고 적층할 수 있습니다. 소수성 왁스 또는 폴리머25-27을 인쇄하여 종이 기반 장치에서 유체 경계를 정의하는 일반적인 전략과 달리, 이러한 적층 종이 패턴은 에탄올을 포함한 많은 유기 액체에 내성이 있습니다. 종이 테스트 영역은 EV 하위 그룹의 특정 표면 마커에 대한 친화력이 높은 포획 분자(예: 표적 특이적 항체)의 안정적이고 조밀한 적용 범위를 제공하기 위해 화학적으로 변형됩니다. 생물학적 샘플은 종이 테스트 영역에 직접 피펫으로 주입할 수 있으며, 정제된 EV는 헹굼 단계 후에도 유지됩니다. 분리된 EV의 특성화는 SEM, ELISA 및 전사체 분석을 통해 수행할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

작업 절차의 일반 다이어그램 그림 1에 제공됩니다. 윤리 실천을 사용하여, 우리는 (정상인의 혈액 샘플을 수집하고, IRB는 프로토콜을 승인 대만에서 타이 재향 군인 병원 (TCVGH), 타이 통해 환자의 방수 샘플을 얻을 IRB TCVGH 번호 CF11213-1).

종이 장치 1. 제작

  1. 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트와 같은 레이아웃을 제공하도록 직경 5mm의 원으로 크로마토 종이 잘라. 등록 관통 구멍, 라미네이트 두 폴리스티렌 시트 이러한 종이 조각을 샌드위치.
  2. 다음 28 단계에서 설명한 화학적 컨쥬 게이션 방법을 사용하여 용지를 수정 장치.
    1. 플라즈마 챔버에서의 산소 플라즈마 (100 mW의 1 % 산소, 30 초)와 함께 종이 취급 장치.
      주의 : 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란 및 N -γ 말레이 미도 숙신이 미드로 작업 할 때 특별한주의를 기울여야합니다에스테르 (GMBS), 그들은 모두 습기에 민감하고 독성이 있기 때문이다. 보호 장갑을 착용하고 흡입을 피하거나 피부 및 눈에 접촉. 밀폐하여 주식 병을 유지하고 결로를 방지하기 위해 열기 전에 RT 평형 수 있습니다. 또한, 질소 충전 장갑 가방이나 상자 안에 주식 병을 엽니 다. 작은 튜브로 나누어지는 주식 병을 자주 개방을 방지 할 수 있습니다.
    2. 바로 30 분 동안 에탄올 (200 증명)에 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란의 4 % (v / v)의 용액에 용지 처리 장치를 배양한다.
    3. 에탄올로 종이 장치를 씻어 15 분간 에탄올에 0.01 μmol / ㎖ GMBS으로 그들을 품어.
    4. 에탄올 (200 증명) 헹군 후 4 ℃에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에 10 ㎍ / ml의 아비딘 용액을 종이 장치를 품어. 4 ° C에서 보관이 필요한 경우, 4 주 이내에 사용한다.
  3. (BSA를 PBS 10 μL가 소 혈청 알부민 (/ V W) 1 %를 함유하는 각 용지 테스트 존 적셔) 3 × 10 분 동안 캡처 분자를 바이오틴 10 μl를 안보 전에 3 × 10 분. 또는 아 넥신 V (1:20 넥신 V 결합 버퍼에 v / v)의 항 CD63 항체를 사용하여 (PBS는 w / v)의 BSA와 0.09 % (/ v)의 아 지드 화 나트륨 w (1 %를 포함하는 20 μg의는 / ㎖) 포획 분자.
  4. PBS는 각각 3 × 1 분간 완충액 결합 BSA 또는 아 넥신 V (/ V W) 1 %를 함유하는 상응하는 10 μl를 이용하여 결합되지 않은 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자를 씻어.

2. 혈청 및 방수 샘플 수집 및 처리

  1. 혈청 수집.
    1. 혈청 분리 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 튜브 다섯 번 반전. 수직으로 튜브를 설정하고 30 분 동안 기다립니다.
    2. 15 분 동안 1,200 × g에서 원심 분리기. 30 분 동안 3,000 × g에서 다시 깨끗한 튜브 가기 층에서 혈청, 원심 분리기를 전송합니다.
    3. 0.8 μm의 FIL 통해 뜨는을 전달터. 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
  2. 수성 유머 컬렉션 : 사용할 때까지 -80 ° C에서 직접 절차 및 샘플을 저장 침략을 통해 안과 의사에 의해 진단 된 환자에서 방수 샘플을 수집합니다.

세포 외 소포 3. 분리

  1. 5 μL / 분의 속도로 각각의 용지 상에 테스트 존 순간 표본.
  2. BSA 또는 넥신 V 각각 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자로 기능화 된 종이 장치의 3 × 1 분간 완충액 바인딩 (/ V는 W) PBS 1 % 함유 대응 10 μL와 언 바운드 전기차 헹구어. 다음과 같은 다운 스트림 분석을 수행합니다.

4. 다운 스트림 분석 예 1 : 스캔 Electromicrographs

  1. 10 분 동안 10 μL 0.5 × Karnovsky의 정착을 사용하여 작용 종이 테스트 존에서 캡처 한 전기 자동차를 수정합니다.
  2. 2 × 5 분 동안 충분한 PBS로 샘플을 씻어.
  3. 탈수10 분, 2 × 10 분, 50 % 에탄올, 2 × 10 분, 70 % 에탄올, 2 × 10 분, 95 % 에탄올, 4 × 10 분 동안 100 % 에탄올 이후 35 % 에탄올로 샘플.
  4. 건조 및 코트에게 긴급 팔라듐 / 금으로 샘플을 스퍼터링하고, 저 전자 가속 전압에서 작동 사형 전자 현미경을 사용하여 검사 (~ 5 kV로).

5. 다운 스트림 분석 예 2 : 종이 기반의 ELISA

  1. 1 항 CD9 차 항체를 함유하는 5 μL 솔루션을 추가 : 1000 희석 PBS에서 캡처 전기 자동차를 포함하는 각 시험 영역에. 1 분을 기다립니다.
  2. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  3. 5 μL 솔루션을 포함하는 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)를 1 차 항체를 -linked 추가 PBS 1,000 희석하고 1 분을 기다립니다.
  4. PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어.
  5. 과산화수소의 부피비 1 : 1를 함유하는 5 μL 비색 기질 추가D의 3,3 ', 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)와 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔.

6. 다운 스트림 분석의 예 3 : RNA 분리

  1. 캡처 된 전기 자동차를 용해하는 버퍼를 바인딩 / 폴리 비닐 피 롤리 돈 기반 RNA 분리 원조의 35 μL와 용해의 265 μL에 샘플을 담가. 소용돌이 적극적으로.
  2. 해물에 격리 키트에 30 μL 균질를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 10 분 동안 얼음에 넣어.
  3. 다음 단계에 설명 된 산 페놀 - 클로로포름 분리를 사용하여 RNA를 추출합니다.
    1. 병의 바닥 층에서 페놀 - 클로로포름 330 μl를 타고 균질 / 해물을 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 적극적으로.
    2. 5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 깨끗한 튜브로 수성 (위)의 위상을 전송하고 제거 볼륨을 확인합니다.
  4. 이전 단계에서 제거 및 CO 성상의 1.25 배 부피 100 부피 % 에탄올 총 RNA를 침전95 ° C로 예열 용출 용액에서 RNA를 llect.
  5. 농축시키고, 상기의 제조 프로토콜에 따라 RNA 정리 키트를 사용하여 RNA를 정제.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전기차의 하위 그룹을 분리하는 종이 장치의 기능을 효율적으로 EV 표면 마커의 민감하고 특이 인식에 의존한다. 포획 분자와 종이 섬유의 안정한 다른 변형 28-30 바와 같이 아비딘 - 비오틴 화학 제를 사용함으로써 달성된다. 물리적 흡착 방법의 화학적 결합의 효과와 그 형광 기반의 판독을 사용하여 평가한다. 종이 시험 영역은 단계 1.3에서 20 ㎍ / ml의 형광 단의 R 피코 에리 트린 - 복합 비타민 B 복합체 분자 (PE-비오틴)로 대체 캡처 분자를 제외하고 프로토콜 1 단계)에 따라 제조된다. 종이 시험 영역은 다음 언 바운드 PE-비오틴 분자를 제거하는 PBS로 세척한다. 대조적으로, PBS를 1 % 함유하는 10 ㎕를 20 ㎍ / ml의 PE 비오틴 (w / v)의 BSA 및 0.09 % (w / v)의 아 지드 화 나트륨을 직접 PBS이어서, 3 × 10 분간 종이 테스트 존에서 목격되고 PE 비오틴 염료 분자의 물리적 흡착을 수행하기위한 린스. 화학적수정 된 종이 장치 ( "종이 + 가교제...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 외 소포의 하위 그룹의 성공적인 분리를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 용지 1) 좋은 선택; 종이 섬유의 표면 상에 포획 분자의 2)에 따르면 안정적이고 높은; 3) 시료의 적절한 처리; 4) 일반 실험실 위생 기준.

다공성 물질은 많은 저렴하고 장비가없는 분석에 사용되어왔다. 이들은 가변 공경, 다목적 기능, 저가 및 높은 표면 대 부피 비율 유체의 수동적 위킹을 허용을 가질 수도있다. 우리는 주로 적절한 기공 크기와 낮은 단백질 흡착 크로마토 그래피 셀룰로오스 종이 1 등급을 선택했다. 다른 일반적으로 사용되는 다공성 물질, 니트로 셀룰로오스에 비해, 셀룰로오스 종이 훨씬 낮은 비특이적 단백질 흡착 (34)를 갖는다. 우리는 또한이 연구에서 전기 자동차의 작은 비특이적 캡처를 찾을 수 있습니다. 또한, 그 입자 보유 수준으로 11㎛가 특정 캡쳐를 허용 전기차 (35)의 크기보다 큰전기 자동차의 물리적 트래핑에 대비. 여...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 대만 국립 과학위원회 grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) 및 NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) 및 재향 군인의 일반에 의해 부분적으로 지원 병원과 대만의 공동 연구 프로그램의 대학 시스템 (CC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
크로마토그래피 논문GE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® 1등급 셀룰로오스
(3-메르캅토프로필) 트리메톡시실란시그마 알드리치175617이 화학 물질은 물 및 수분과 반응하므로 질소가 채워진 장갑 주머니에 넣어야 합니다. 눈과 피부에 닿지 않도록 하십시오. 연기를 흡입하거나 증기를 흡입하지 마십시오.
에탄올피셔 사이언티픽BP2818Absolute, 200 Proof, 분자 생물학 등급
소 혈청 알부민(BSA)BioShop Canada Inc.ALB001종종 Cohn fraction V라고 합니다.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS는 아민-설프히드릴 교차결합제입니다. GMBS는 습기에 민감합니다.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin은 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 가지고 있으며 pI 값은 6.3으로 네이티브 아비딘보다 더 중립
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V는 포스파티딜세린(PS)에 대한 친화력이 높습니다
항체System BiosciencesEXOAB-CD9A-12차 항체는 horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel, and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; 사용하기 전에 1x로 희석합니다.
TMB 기질 시약 세트BD Biosciences555214세트에는 과산화수소와 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)
[헤더]
RNA 분리 키트Life TechnologiesAM1560MirVana RNA 분리 키트
폴리비닐피롤리돈 기반 RNA 분리 보조제Life TechnologiesAM9690식물 RNA 분리 보조제에는 다당류에 결합하는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 포함되어 있습니다.
RNA 정리 키트, Qiagen, Inc.74004MinElute RNA 청소 키트는 최대 45  &뮤; g RNA입니다.
플라즈마 챔버March InstrumentsPX-250
주사 전자 현미경Hitachi Ltd.S-4300
데스크탑 스캐너Hewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108비트 컬러 이미지를 캡처했습니다. 카메라와 스마트폰도 사용할 수 있습니다.
이미지 기록 시스템J& H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816비트 형광 이미지를 캡처했습니다. 형광 현미경도 사용할 수 있습니다.
지적입니다. ., ,

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