단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 합성은 다양한 생물학적 과정, 특히 환경 조건에 적응에 영향을 미치는 유전자 발현에 중요한 공정이다. mRNA의 개시 코돈, eIF4G1을 포함하여 참여 개시 인자의 리보솜 서브 유닛의 조립을 포함 개시 단계. 번역의 속도 제한 단계에서의 결함은 다양한 질환에 연결되어 있습니다. 이러한 규제 완화의 잠재적 결과를 연구하기 위해, 제노 푸스는 난자가 인간에 필수적인 세포 및 분자 메커니즘의 보존의 높은 학위를 가진 매력적인 모델을 구성 laevis의. 또한, 감수 성숙하는 동안, 난 모세포는 전사적으로 억압하고 필요한 모든 단백질은 기존의, 모계 유래의 mRNA에서 변환됩니다. 이 저렴한 모델은 효과적인 번역과 완벽하게 통합 될 외인성 mRNA를 할 수 있습니다. 여기에 (여기 eIF4G1) 관심 요인으로 번역을 평가 STOR 사용을위한 프로토콜을 설명하는가장 먼저 그 어머니의 mRNA의 에드 폴리아 데 닐화 및 생리 학적 판독으로 난자의 성숙하는 동안 번역합니다. 처음에는 mRNA의 관심의 플라스미드 (여기 eIF4G1)의 시험 관내 전사에 의해로 합성하는 것은 어린 싹 소포 고장 감지하여 난자와 난자의 성숙의 역학에 주입이 결정된다. 연구 모체 mRNA의 타깃은 세린 / 트레오닌 - 단백질 키나아제 MOS이다. 그 폴리아 데 닐화 및 그 이후의 번역은 난자의 성숙에 관여 폭포 신호 MOS의 단백질의 발현 및 인산화와 함께 조사하고 있습니다. 현재 프로토콜의 변화는 앞으로 넣어 번역 결함은 또한 일반적인 적용 성을 강조하기 위해 제안되었다. 비정상적인 단백질 합성은 신경 질환의 병인에 관여 할 수 있다는 증거를 부상에 비추어, 그러한 모델은 쉽게 손상을 평가하고, 새로운 대상을 식별 할 수있는 기회를 제공한다.
서론
단백질은 생물체의 큰 규모에 필수적인 세포 삶의 요소 때문에입니다. 이들은 구조, 운송, 반응 촉매, 조절, 유전자 발현 등 발현은 mRNA의 단백질로의 변환을 허용하는 번역 복잡한 메커니즘의 결과를 포함한 세포 기능의 대부분을 보장한다. 번역은 적응 및 발생과 분화, 노화, 스트레스 또는 생리 병리학 적 양상 동안, 셀의 요구에 따라 유전자 발현을 조절하는 각종 제어를 실시한다.
캡에 의존, 모자 독립적 인 내부 리보솜 항목 세그먼트 (IRES) 구조와 캡 독립 번역 약물 (경유 : 번역은 3 개시 번역 시스템이 요구에 대응하기 위해 3 단계 (개시, 신장 및 종료)와 선물로 분할된다 ) CITE.
대부분의 진핵 생물의 mRNA는 캡 depe로 번역된다단백질 합성시 인식 기능의 역할 7 methylguanosine 5'- 삼인산 캡을 통해 ndent 방식. 이 모자의 eIF4E, eIF4G1 및 eIF4A와 eIF4F 단지의 구성 요소에 바인딩합니다. 폴리 (A) 결합 단백질 (PABP)와 같은 다른 파트너와 관련, eIF2-GTP-메트로-tRNA의 메트로,이 번역 개시 인자의 mRNA를 회람 및 인식 1 코돈 8 월 개시 될 때까지 형태 43S 복잡한 접근성을 개선 할 수 있습니다. 이 이벤트는 번역 개시 즉, 변환의 제 1 단계의 종료에 대응한다.
캡 독립적 번역 인스턴스 세포 증식 및 아폽토시스 유도에 대한 스트레스 조건 하에서 필수적인 단백질 mRNA의 인코딩에 의해 사용된다. 이 메커니즘은 mRNA의에 차 구조를 포함 5' 번역되지 않은 지역 (UTR)는 IRES라고 eIF4A 및 43S 복합과 관련된 eIF4G1의 카르복시 말단. 이 43S 개시전 (C)의 결합IRES에 omplex은 eIF4E를 인자 2,3 필요없이 뚜껑 독립적 인 번역을 시작합니다.
mRNA의 UTR 4 내에있는 구조를 인용을 통해 마지막으로, 아직 잘 이해되지 다른 변환 메커니즘은 스트레스 조건 하에서이 모자 독립적 인 번역 활동을 지원합니다.
그들의 개시 단계에서 다른 번역이 다양한 방식을 통해 변환이 셀룰러 항상성에 중요한 역할을하고, 따라서 큰 규모의 효과와 작은 유기체에 영향을 미칠 것이다 이러한 프로세스 중 하나에 변경을 수행한다. 실제로, 개시는 mRNA의 단백질로의 정확한 변환을 관리하는 프로세스 속도 제한 단계이며, 따라서 다수의 제어 및 조절 점 (5)의 목표이다. 이 후자의 또는 이러한 프로세스의 구성 요소에 대한 여부 하나에 결함이있는 것으로 밝혀지면, 그것은 셀의 설립 균형을 교란하고, 따라서 병리 콘돌리자으로 이어질 수TIONS. 이러한 맥락에서, 번역 인자의 돌연변이는 이러한 잠재적 흰색 matter' (eIF2B1-5 서브 유닛) (6), 월콧 - Rallison 증후군 (PERK에 대한 EIF2AK3 유전자 인코딩) (7), 소멸과 백색질 뇌증 '와 같은 퇴행성 신경 질환 등 여러 질환에 참여하고있다 파킨슨 병 (eIF4G1의 p.R1205H) 8. 이는 질병 개발 및 번역 개시의 일반적인 과정에 대한 우리의 지식을 증가시키는 이러한 돌연변이 단백질의 세포 및 분자 연구를 수행하는 것이 중요하다.
이 연구를 수행하기 위해, 이러한 돌연변이의 영향을 관찰하기 위해 가장 적절한 모델을 선택하는 것이 필수적이다 제노는 난자 특히 생리 학적 및 생화학 적 특성으로 인해 적응 laevis의 :. 생리 동시성 (세포주기의 단계 G2에서 차단) , 단백질 합성의 높은 용량 (200 ~ 400 NG / 일 / 난자), 추출 OOC의 높은 수같은 동물에서 ytes (800-1,000 난자 / 여성)과 조작을 용이하게 셀 크기 (직경 1.2-1.4 mm)이다. 합성의 mRNA와 제노 푸스 난 모세포의 마이크로 인젝션 쉽게 번역 단계를 해부하기 위해 수행 될 수있다. 이보기에 그것은 다른 장점을 제공합니다. 감수 분열의 진행의 속도와 번역의 mRNA의 미세 주입 (~ 24 시간) 후 감안할 때, Xenopus의 난자는 재구성 세포 (대장균에서 추출, 밀 세균 또는 토끼 망상 ...) 시스템의 mRNA가 인에 비해 빠른 시스템을 나타냅니다 감소 된 변환 속도와 낮은 속도로 번역했다. 따라서 mRNA의 도입으로 돌연변이의 효과를 신속하고 용이하게 관찰 할 수있는 여러 개의 난 모세포에서 연구 될 것이다. 제노 푸스 난 모세포의 또 다른 장점은 모체의 mRNA가 잠재되어 단백질 번역을 프로게스테론 자극 전에 차단된다는 것이다. 프로게스테론 첨가 따라서 변환 유도를 제어하는 좋은 방법이다. 세포질 Polyadenylation는 oogenesis 동안 발생하지 않습니다. 그것은 시간적 순서에 프로게스테론 자극 난자에 난자 성숙 과정 시작과 초기 개발을 통해 계속 번역의 다른 단계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
MOS의 mRNA의 폴리아 데 닐화가 발생하는 첫 번째 중 하나입니다 그것은 찰스 워드 등에 정의 된 "조기 성숙"유전자의 클래스에 오로라 / EG2, 히스톤 같은 B4의 mRNA에 속한다. (2004) 9. 이러한 사이클린 A1과 B1 사이클린 등의 "말"의 mRNA의 번역 유도 새싹 소포 고장 (GVBD)의시기에 발생합니다. MOS의 mRNA는 세린 / 트레오닌 - 단백질 키나아제를 암호화한다. 이 간접적으로 난자의 성숙을 활성화 MAP 키나제 캐스케이드을 유도하기 때문에 그것의 번역은 매우 중요하다. 사실, 황체 호르몬에 대한 응답으로, MOS의 mRNA의 폴리아 데 닐화는 EG2 조절 단백질과 일 다른 RNA 결합 단백질을 오로라 /를 포함하는 과정을 통해 강화된다MOS의 mRNA의 전자 3'UTR. MOS의 mRNA의 폴리아 데 닐화 증가 차례로 MEK1를 활성화 MOS 단백질 수준의 증가를 이끈다. 이 과정은 세포 외 신호 조절 키나아제 2 (ERK2) (도 1)의 활성화를 매개한다. 이 시그널링 캐스케이드 다음 요인을 촉진 성숙 M 상, 사이클린 B 및 Cdc2 키나제에 의해 형성된 복합체를 유발하며 결국 감수 재개 야기 할 수있다.
제노 푸스는 난자 laevis의 그러므로, 이러한 MOS 등 산모의 mRNA의 연구는 쉽게 여러 MOS 부품 시그널링도 GVBD 레이트의 판정 등의 번역 그들의 효율적인 폴리아 데 닐화에서 여러 엔드 포인트와 그 번역 가능성을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 이 시스템은 신규의 mRNA의 전사 또는 형질 감염 효율의 간섭없이 번역 개시 인자의 돌연변이의 첫번째 결과를 평가하는 것이 흥미 롭다는 문제가 종종 함께 발생 eukary귀 세포 연구.
여기에, 프로토콜은 Xenopus의이 난자를 laevis의 산모의 mRNA의 번역 시험에서 돌연변이 eIF4G1의 mRNA를가 미세 주입되는 경우 설정됩니다. 난자 감수 세포주기를 통해 초기와 후기 클래스의 mRNA의 후속 번역 진행을 위해 필수적이다 GVBD 진행에 결함, MOS mRNA의 폴리아 데 닐화의 존재에서 확인된다. 인산화 오로라 / EG2와 ERK는 MOS의 deregulation.Thus의 결과를 확인하기 위해 연구되고, Xenopus의 난자는 mRNA의 번역의 다른 단계를 분석하는 간단한 방법을 나타냅니다.
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프로토콜
모든 Xenopus의 실험은 실험실 동물 실험에 대한 유럽 공동체위원회 지침 (609분의 86 / EEC)의 규칙에 따라 릴 1 대학의 동물 시설에서 수행 하였다. 동물 프로토콜 (위원회 (CCT) 디부 Ethique 실내 실험 ANIMALE 노르 파 드 칼레 CEEA 07/2010)을 지역 기관 심사위원회에 의해 승인되었다.
1. 난자 처리
- 마취 솔루션을 준비 : 멸균 물 1 L에 tricaine 메탄 설포 네이트 분말 1g을 용해.
- 여성 Xenopus의이 솔루션에 laevis의 플 런지는 탈출을 방지하고 동물이 완전히 (다리 핀치에 어떤 반응없이) 진정 될 때까지 약 45 분을 기다리는 비커를 다룹니다.
- 다음 깨끗한 알루미늄 호일에의 뒷면에있는 동물을 배치 비누로 개구리를 씻고 수돗물로 씻어.
- 복부 측 부분과 집게 난소 레벨에서 피부 클램프.에탄올 70 %와 함께 사용하기 전에 청소 가위로 약 1cm의 절개를합니다. 섹션이 충분히 깊은 있는지 확인 및 개발의 여러 단계에서 여러 난자가 발견되는 난소 조직의 절제를 허용하는 기본 복벽에 도달 할 수 있습니다.
- ND96 매체 (96 mM의 NaCl을, 2 밀리미터의 KCl와 페트리 접시 (50mm)에 그들에게 4 회 세척, 난소 로브를 해부, 1 밀리미터의 MgCl 2, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 5 mM의 HEPES는 NaOH로 pH를 7.4로 조정 보충 50 μg의와 / ㎖ 스트렙토 마이신 / 페니실린, 225 μg의 / ㎖ 나트륨 피루 베이트, / ㎖ 대두 트립신 억제제 30 μg의 1 μL / ㎖ 테트라 사이클린) 피와 파편의 모든 흔적을 제거합니다.
참고 : 테트라 사이클린은 최적의 보존 및 미세 주사 치료 후 좋은 복구를 할 수 있습니다. - 일주일 동안 자신의 보존을 허용, 14 ° C에서 매체에 잠긴 덮여 페트리 접시에 저장합니다.
- 복부 벽과 수의사 흡수 T와 피부 스티치hread 및 봉합 바늘 (3 또는 4 바늘이 필요합니다).
- 물없이 비커에 동물을 놓고 개구리 다시 이동 될 때까지 수돗물로 피부를 축축한. 탈출을 방지하기 위해 비커를 커버.
- 10 배 배율의 실체 현미경 집게 2 쌍을 이용하여 조심스럽게 5~10 난자 그룹 배지 난소 로브 별개. 단계 VI에서 선택 난자. 그들은 갈색 색소 동물 극과 직경 10 1.2 mm의 II) 크기 우수한 명확한 벨트로 구분 노란색 식물 극) 나는 그들의 모양과 색상을 인식 할 수있다.
- (콜라게나 제는 난자 / 여포 세포 연결 다이제스트) 난자 defolliculation을 용이하게하기 위해 45 분 동안 교반과 아래 페트리 접시 (테트라 사이클린없이 ND96에 용해 상기 Clostridium histolyticum, 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나) 콜라게나 제 용액에서 선택된 난자를 배양한다. ND96 매체에 3 ~ 4 시간은 14로 유지 난자를 씻어° C.
참고 : 난자 작거나 난자의 표면 단백질을 파괴하고 가난한 생존을 유발의 위험으로 인해 45 개 이상의 분 부화하지 마십시오. 콜라게나 제 처리는 자발적인 GVBD을 유도 할 수있다. - 3 ~ 4 시간 동안 매체에 난자를 품어. 양안 돋보기에서 미세 핀셋과 모낭 세포를 제거하고 ND96 배지에서 19 ℃에서 보관하십시오.
mRNA의 합성 2. 준비
- 나는 효소 PME를 사용하여 소화 효소에 의해 다음과 같은 플라스미드의 5 μg의 선형화.
참고 : pcDNA6.2 / 1599 아미노산 eIF4G1 cDNA를 야생형 (eIF4G1-WT; NM_198241)를 포함 V5-DEST 돌연변이 c.2105T과를, eIF4G1 지배적 인 부정의 cDNA (eIF4G1-DN)을 포함하는 pcDNA6.2 / V5-DEST > G c.2106A> C, c.2120-이> G, c.2122T가>, 2125T는> - 그리고 c.2126T> G는 해당 단백질의 618 위치 (612)에서 eIF4G1과의 eIF4E 사이의 상호 작용의 영역에 방해 상호 작용 betweEN eIF4G1과의 eIF4E 8, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼를 포함 pcDNA6.2 / C-EmGFP (GFP). 3 플라스미드 각각 2 혼합물을 준비 : 나는 효소 처음 포함 PME와 두 번째 제어와 같은 효소없이. - 고전 에탄올 절차를 이용하여 플라스미드 DNA를 석출 클레아없는 H 2 O 20 μL에 재현 탁하여
- 분광 광도계를 사용하여 농도를 결정합니다. 농도가 된 cRNA를 전사 할 μL 150 NG / 우수해야한다.
- 선형화 된 플라스미드를 확인하기 위해 1 ㎕의 시료와, 0.8 % 아가 로스 겔에 로딩 완충액 5 μL와의 컨트롤을 실행.
- 시험 관내 전사 및 제조업체의 지침에 따라 cRNA를 정화 키트를 사용합니다. 전사 된 cRNA는 클레아없는 H 2 O 20 μL에 재현 탁 필요한 경우 샘플은 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
- 0.2 M MOPS (PH 7.0), 20m 함유 MOPS 10X 이주 버퍼를 준비M 아세트산 나트륨 및 10mM의 EDTA (PH 8.0). 0.45 μm의 필터 솔루션을 소독. 용액의 산화를 방지하기 위해 RT에서 빛으로부터 보호 용액 재고.
- 수산화 나트륨, 염산으로 연속적으로 전기 탱크를 청소하고 철저 O위한 이중 여과하고, 물로 세정 / N이 된 RNase를 방지하고 RNA의 분해를 방지한다.
- MOPS 및 포름 알데히드를 함유하는 1.5 % 아가 로스 겔 캐스팅. 완전한 아가로 오스 용해 될 때까지 따뜻한하고 55 ℃까지 냉각 할 수 있습니다. 흄 후드에서 MOPS 10 배의 0.1 볼륨, 포름 알데히드의 6.6 %와 에티 디움 브로마이드 4 μg의 (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 흄 후드에서 젤을 붓고 겔을 강화하는 약 1 시간을 기다립니다.
참고 : 포름 알데히드와 에티 디움 브로마이드 독성. - cRNA를 1 μL, 포름 알데히드 8.8 %, 포름 아미드의 60 %와 MOPS 10 배의 0.1 볼륨 0.2 ML 튜브에서 마이그레이션을위한 샘플을 준비합니다. 70 ℃에서 3 분 동안 품어 10 분 동안 얼음에 튜브를 넣어. 원심 분리기 샘플 몇 초에서5,000 × g으로. 젤 로딩 버퍼 2 μl를 추가합니다.
참고 : 포름 아미드 독성이다. - 90V에서 20 분 동안 샘플을 실행합니다. 된 cRNA 품질을 확인하기 위해 그것을 분석하기 전에 젤을 destain하는 뉴 클레아없는 H 2 OO / N에 젤을 만끽 해보세요.
- 분광 광도계를 사용 된 cRNA 농도를 결정하고 -80 ℃에서 저장합니다.
신시 RNA와 난 모세포 성숙 자극 3. 미세 주입
- 난자의 미세 주입에 필요한 장비를 준비합니다. 작은 유리 모세관을 당겨 마이크로 피펫 풀러를 사용합니다. 실체 현미경에서 무딘 끝을 생성하기 위해 핀셋으로 모세관의 말단을 끊다. 반대 말단에서 밀리 포아 0.45 μm의 필터로 1 ML의 주사기를 사용하여 미네랄 오일과 모세관 마이크로 피펫을 채 웁니다. 미세 주입 피펫 상에 마이크로 피펫을 마운트합니다. 적절한 유리 모세관와 함께 사용하면 좋은 정확성을 제공하기 위해 제조업체가 교정 정확한 마이크로 피펫을 선택합니다.
- 미세 주입을 defolliculation 후 1 ~ 2 시간을 수행, 난자에 난자 복구에 필요한 지연은 14 ° C로 유지. 바닥에 사용 페트리 접시는 난자 용 접착제 표면을 만들고 ND96 매체를 채우기 위해 집게로 긁어.
- 45 ° C의 각도 모세관 마이크로 피펫으로 난자의 연속 주입을 허용하는 페트리 접시에서 긁어 차선 따라 난자를 배열.
- 세포질의 샘플 최적의 확산을 위해 착색 된 동물 영역 아래, 난자 적도 영역에 주입. 깊이 약 150 ~ 200 μm의에 모세관 팁의 얇은 부분을 삽입합니다.
- 먼저 난자에 60 NL의 볼륨에 다른 플라스미드에서 각각 획득 된 cRNA의 30 NG를 주입한다. 주입 후, 샘플 탈출 (그림 2A)를 방지하기 위해 모세관 팁을 제거하기 전에 5 ~ 10 초 동안 기다립니다.
참고 : 120 NL을 초과하지 마십시오. 천천히 당신이 할 수있는 주입한다. 증류수로 제어하는 것이 좋습니다. - 다음 난자를 주입하기 위해 수동으로 배양 접시를 이동합니다.
참고 : 끝이 2 ~ 3 microinjections 후 목욕 솔루션에서 작은 펄스를 생성하여 막혀 있지 않은지 확인합니다. - 24 웰 배양 플레이트에 전송 주입 된 난 모세포 (난자 10 / 웰) 신선한 ND96 매체의 3 ㎖로 가득하고 19 ° C에서 그들을 둡니다.
- 19 ° C에서 감수 성숙 (GVBD)을 트리거하는 황체 호르몬 (PG) (2 μg의 / ml)로 ND96의 난자를 품어 15 시간 또는 pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 및 pcDNA6에서 각각 얻은 폴리아 데 닐화 된 cRNA의 미세 주입 후 4 시간 .2 / C-EmGFP는 제어 (그림 2A)로 사용.
참고 : cRNA를 형광 마커의 공동 주입 된 cRNA 주입하고 난 모세포에 남아되었는지 확인하는 좋은 도구입니다. GFP 태그 관심 된 cRNA를 이용한 예비 실험을 수행합니다. - Microinject 등의 # 3.5 다른 비율 (1 : 3, 2 : 2, 3 : 1) 테하기 위해 eIF4G1-WT 및 eIF4G1-DN 된 cRNA를 폴리아 데 닐화의세인트 돌연변이 표현형 (그림 2D)에 eIF4G1-WT의 cRNA를 번역 효과.
4. 어린 싹 소포 고장 결정
- 실체와 검은 동물 극에 흰색 반점의 존재를 관찰하여 PG 자극 후 성숙 난자의 수를 계산합니다. 제 24 시간 (그림 2B, 2C)까지 계산 매 시간마다 반복합니다.
5. 웨스턴 블롯 (WB) 분석
- 50 mM의 헤 페스, 산도 7.4, 500 mM의 염화나트륨, 0.05 % SDS, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mg의 다음 버퍼에 200 μL에서 4 ° C에서, 10 백에 의해 난자와 마이크로 피펫 팁과 등 운동의 그룹을 균질화 / ㎖ 소 혈청 알부민, 10 ㎎ / ㎖ 류 펩틴, 10 ㎎ / ㎖ 아프로 티닌, 10 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제, 10 ㎎ / ㎖ 벤즈 아미 딘, 1mM의 PMSF, 1 mM의 나트륨 바나 데이트.
- 10,000 XG에서 15 분 동안 원심 분리 샘플 지질 (상부 상)과 막 (하부 상) F를 제거ractions. 단백질 농도를 결정하고, 램리 또는 비스 - 트리스 완충액으로 샘플 잔여 완료 분취를 저장, 세포질 분획을 수집 (1 : 1).
주 : 비스 - 트리스 젤 로딩 버퍼에서 가수 분해 된 단백질을 보호 더 중성 pH를 가질 - 10 분 동안 95 ° C에서 20 μg의 샘플을 가열한다. 아크릴 아마이드 겔의 우물에 각각의 샘플을로드합니다. 적절한 버퍼 탱크에 젤을 놓습니다.
- V. 200에서 1 시간 동안 전기 영동을 수행
- TBS pH의 WB 8.0 실현 (트리스 염산을 15 mM의 NaCl을 150 mm의 트윈 0.1 %를 함유하는 10 % 소 혈청 알부민) 염소 항 - 오로라 / EG2 (1 : 3,000, 2 시간) 또는 토끼 안티와 -Aurora / EG2-P (1 : 4 ° C에서 1,000, O / N), 마우스 항 - ERK2 (1 : 3,000, 2 시간), 염소 항 - ERK2-P (Tyr204) (1 : 3,000, 2 시간 10,000, 2 시간) 및 토끼 항 Rsk를 (1), 토끼 항 - MOS (1 : 5000, 4 시간), 토끼 항 GFP (1 : 3,000, 2 시간)을 antibodies.Use가 마우스 항 V5 항체 (1 :로드 컨트롤과 같은 1,000, 2 시간) ().
- 빨래막 3 시간 10 분 TBS-트윈과 함께 1 시간을 품어 1의 희석에 항 - 마우스 또는 항 - 토끼 또는 방지 염소 (IgM의) 고추 냉이 퍼 옥시 다제 표지 된 이차 항체 중 : 5,000, 1 : 7,500 및 1 : 각각 5,000.
- TBS-트윈에서 10 분간 3 회 세척을 수행하고 고급 ECL 검출 시스템과 항원 - 항체 복합체를 검출한다.
6. 폴리아 데 닐화 분석
- 샘플 1.5 ml의 조건에서 당 5 난자. 핵산 분해 효소가없는 PBS 1X (PH 7.4) 1 ㎖로 씻어. 다음 단계는 흄 후드 될 것이다.
- (제조업체의 지침을 참조하십시오) 고전 유기 절차를 사용하여 RNA를 추출합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리 (10,000 XG)에 의해 RNA를 복구 할 수 있습니다. 10 분 동안 뜨는 공기 건조 RNA를 제거합니다.
- 뉴 클레아없는 H 2 O의 30 μL에 재현 탁의 RNA 펠릿
- 새로운 튜브에 샘플의 15 μl를 타고 뉴 클레아없는 H 2 O의 85 μl를 추가 정리SE 샘플은 제조업체의 지시에 따라, 실리카 칼럼에의 품질을 향상시킬 수있다. 뉴 클레아 제 무 H 2 O 30 μL를 사용하여 RNA를 용출
- RNA의 무결성을 검사하기 위해 0.8 % 아가 로즈 겔에 로딩 완충액으로 5 μL 샘플 1 μL를 실행.
- 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 결정한다.
- 조건 당 2 결찰 혼합물을 준비합니다 (즉, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN과 H 2 O 제어) 다음과 같은 시약 : RNA 리가 10 U, 10X 버퍼의 0.1 볼륨, 1 mM의 ATP, PEG8000 50 %의 10 % , 프라이머 P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') (11) 및 뉴 클레아없는 H 2 O 10 μL에 최종 볼륨을 가지고 0.1 μg의 PG 자극없이 난자로부터 얻어진 제 1 혼합물의 RNA에 추가 PG로부터 얻어지는 제 2 혼합물의 RNA에서 난 모세포를 자극.
- 효소를 불 활성화하기 위해 65 ℃에서 20 분 후, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 우리EA의 cDNA 역전사 (RT) 키트. 튜브 당, RT 혼합물을 제조 : 10X RT 버퍼의 0.1 볼륨, 뉴 클레아없는 H와 프라이머 P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) (10), 4 밀리미터의 dNTP 혼합물, 역전사 효소 50 U와 0.1 μg의 완료 최종 볼륨 2 O 10 μL의. 이전에 취득한 연결 반응의 10 μl를 추가합니다. 제조업체에서 기술 조건에서 RT를 수행합니다.
- (PCR) 혼합물, 튜브 당 중합 효소 연쇄 반응을 준비 : 버퍼 10 배의 0.1 볼륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 133 μM의의 dNTP 혼합물, 0.2 μm의 특정 프라이머, 0.2 μm의 프라이머 (P2), 0.025 U의 Taq 중합 효소, cDNA를 1 μL하고 완전한와 뉴 클레아 제 무 50 μL의 최종 부피로 H 2 O. 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행 : 50 ° C를 2 분, 10 분 동안 95 ° C [30 초 1 분 95 ° C, 56 ° C, 30 초, 72 ° C]에 대한 * 40주기, 72 ° C 10 분 9. 다음과 같이 특정 프라이머는 다음과 같습니다 MOS, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA 히스톤 같은 B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; 시클 A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; 사이클린 B1 : GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
- 3 % 아가 로스 젤을 준비합니다. 각각의 PCR 산물을 로딩 완충액 10 μL에 추가. 최적의 마이그레이션을 위해 110 V에서 샘플 10 μL와 젤을 실행합니다. 그들의 번역 조건이다 꼬리 폴리 (A) RNA 따라서 성숙의 길이를 반영 크기의 변화를 관찰하기 위해 10, 20 분 후에 겔을 분석한다.
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결과
PG 자극의 24 시간 (도 2B, 2C) 후 Xenopus의 난자와 백분율 난자 GVBD 결정의 운동 성숙 :
eIF4G1-DN 돌연변이 병진 영향을 연구하기 위해, 제노 푸스에서 PG에 대한 응답은 (H 2 O, GFP) eIF4G1-WT와 다른 제어 상태와 비교 된 cRNA eIF4G1-DN 마이크로 인젝션 된 난자 laevis의. 컨트롤에 관계없이 주입 된 cRNA 또는 eIF4G1 과발현의 성격의 난자 미세 주사의 발생을 평가 할 수 있습니다.
마이크로 인젝션 된 제어 조건에 의해 특징 10 모세포 (H 2 O 및 GFP)의 운동 maturations는 WT 유사하며 GVBD을받은 횟수는 PG 자극 (도 2B) 후 매우 12에서 서로 근접하고 24 시간이다. 24 시간 ...
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토론
번역은 여러 가지 신경 퇴행성 질환 등 다양한 인간 질환의 physiopathology에 관여하는 메커니즘입니다. 파킨슨 병의 예를 들어 여러 보고서 유전 변이 8,12,13과 관련된 번역에 손상을 제안했다.
여러 셀룰러 모델은 번역을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, eIF4G1 및 8의 eIF4E 파트너 간의 상호 작용을 감소시키는 등의 우성 네가티브 돌연변이 작용 eIF4G1에서 돌연변이 병진 영향을 연구하기 위해, 제노 푸스 난 모세포는 laevis의 사용. 이 생화학 실험 물질의 상당량을 선도하고 난자 성숙의 다른 단계의 육안 관찰을 용이하게 합성 mRNA를 미세 주입을 용이하게 하나의 단일 거대 세포로 구성되어 있기 때문에이 모델은 단순성의 이점을 갖는다. 이러한 과정은 안정한 세포에 비해 시간도 효율적라인 생성. 또한, 난자 준비 및 RNA microinjections 여러 프로토콜은...
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공개 사항
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감사의 글
이 연구는 INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille)의 보조금으로 지원되었습니다. MCCH는 Fondation de France의 지원에 감사를 표하며, V5-플라스미드를 기증해 주신 IRCL, V5-플라스미드를 기증해 주신 Sonenberg 교수님, 항-GFP 항체를 기증해 주신 Dissous 박사(Pasteur Institute, Lille), 제노푸스 난모세포를 구입한 UMS 3387(Rennes 대학), 원고 본문을 비판적으로 읽어주신 Taymans 박사(JPArc, Lille)에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 트리카인 메탄 설포네이트 | 산도즈 | MS-222 | 난모세포 취급 |
| 겸 | 모리아 | 듀몬트 MC40 | |
| 스트렙토마이신/페니실린 | 시그마 | 781 | |
| 피루브산 나트륨 | 시그마 | P2256 | |
| 대두 트립신 억제제 | 시그마 | T9128 | |
| 테트라사이클린 | 시그마 | T7660 | |
| 수의사 흡수성 Vicryl 실 | Johnson& Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche 진단 | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | 합성 mRNA |
| DNAse/RNAse 무료 H2O | 준비 Life Technologies | 10977 | |
| 아세트산 나트륨 | Merck | 6268 | |
| 앱솔루트 에탄올 | 시그마 | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| 에티듐 브로마이드 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE 키트 | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| 포름알데히드 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| 포름아미드 | Fluka | 47671 | |
| 젤 독 이미저 | Biorad | ||
| 난자 피펫 100 8" 유리 모세혈 | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | 미세주입 |
| 교체용 유리 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µ m 필터 | Millipore | SLHA025NB | |
| 프로게스테론 | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | 웨스턴 블롯 |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A4612 | |
| 류펩틴 | 시그마 | L8511 | |
| 아프로티닌 | 시그마 | A1153 | |
| 벤자미딘 | 시그마 | B6506 | |
| PMSF | , 시그마 | P7626 | |
| 바나데이트 나트륨 | 시그마 | S6508 | |
| 램리 완충액 | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE, Novex 4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE 전기 영동, 미니 프로티안 TGX | Biorad | 456-1036 및 -1096 | |
| 수평 반건조 블로팅 시스템 | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL 멤브레인 | Amersham Life Science | 10401180 | |
| 메탄올 | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan 생명 과학 | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | 폴리아데닐화 분석 |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| 클로로포름 | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74106 | |
| RTL 버퍼 | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse 세트 | Qiagen | 79254 | |
| 프라이머 | Eurogentec | ||
| T4 RNA 리가제 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| 고용량 c-DNA 역전사 키트 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq 중합효소 | Life Technologies | 10342020 |
참고문헌
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