단백질 합성 조절은 주로 번역 시작 단계에서 발생하며, 결핍은 다양한 장애와 관련이 있습니다. 이들의 병인을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 여기에서 번역 시작 인자 eIF4G1의 돌연변이가 있는 상태에서 mos 전사체의 번역을 평가하는 Xenopus laevis 난모세포를 사용하는 프로토콜에 대해 설명했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 합성은 다양한 생물학적 과정, 특히 환경 조건에 적응에 영향을 미치는 유전자 발현에 중요한 공정이다. mRNA의 개시 코돈, eIF4G1을 포함하여 참여 개시 인자의 리보솜 서브 유닛의 조립을 포함 개시 단계. 번역의 속도 제한 단계에서의 결함은 다양한 질환에 연결되어 있습니다. 이러한 규제 완화의 잠재적 결과를 연구하기 위해, 제노 푸스는 난자가 인간에 필수적인 세포 및 분자 메커니즘의 보존의 높은 학위를 가진 매력적인 모델을 구성 laevis의. 또한, 감수 성숙하는 동안, 난 모세포는 전사적으로 억압하고 필요한 모든 단백질은 기존의, 모계 유래의 mRNA에서 변환됩니다. 이 저렴한 모델은 효과적인 번역과 완벽하게 통합 될 외인성 mRNA를 할 수 있습니다. 여기에 (여기 eIF4G1) 관심 요인으로 번역을 평가 STOR 사용을위한 프로토콜을 설명하는가장 먼저 그 어머니의 mRNA의 에드 폴리아 데 닐화 및 생리 학적 판독으로 난자의 성숙하는 동안 번역합니다. 처음에는 mRNA의 관심의 플라스미드 (여기 eIF4G1)의 시험 관내 전사에 의해로 합성하는 것은 어린 싹 소포 고장 감지하여 난자와 난자의 성숙의 역학에 주입이 결정된다. 연구 모체 mRNA의 타깃은 세린 / 트레오닌 - 단백질 키나아제 MOS이다. 그 폴리아 데 닐화 및 그 이후의 번역은 난자의 성숙에 관여 폭포 신호 MOS의 단백질의 발현 및 인산화와 함께 조사하고 있습니다. 현재 프로토콜의 변화는 앞으로 넣어 번역 결함은 또한 일반적인 적용 성을 강조하기 위해 제안되었다. 비정상적인 단백질 합성은 신경 질환의 병인에 관여 할 수 있다는 증거를 부상에 비추어, 그러한 모델은 쉽게 손상을 평가하고, 새로운 대상을 식별 할 수있는 기회를 제공한다.
서론
단백질은 생물체의 큰 규모에 필수적인 세포 삶의 요소 때문에입니다. 이들은 구조, 운송, 반응 촉매, 조절, 유전자 발현 등 발현은 mRNA의 단백질로의 변환을 허용하는 번역 복잡한 메커니즘의 결과를 포함한 세포 기능의 대부분을 보장한다. 번역은 적응 및 발생과 분화, 노화, 스트레스 또는 생리 병리학 적 양상 동안, 셀의 요구에 따라 유전자 발현을 조절하는 각종 제어를 실시한다.
캡에 의존, 모자 독립적 인 내부 리보솜 항목 세그먼트 (IRES) 구조와 캡 독립 번역 약물 (경유 : 번역은 3 개시 번역 시스템이 요구에 대응하기 위해 3 단계 (개시, 신장 및 종료)와 선물로 분할된다 ) CITE.
대부분의 진핵 생물의 mRNA는 캡 depe로 번역된다단백질 합성시 인식 기능의 역할 7 methylguanosine 5'- 삼인산 캡을 통해 ndent 방식. 이 모자의 eIF4E, eIF4G1 및 eIF4A와 eIF4F 단지의 구성 요소에 바인딩합니다. 폴리 (A) 결합 단백질 (PABP)와 같은 다른 파트너와 관련, eIF2-GTP-메트로-tRNA의 메트로,이 번역 개시 인자의 mRNA를 회람 및 인식 1 코....
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프로토콜
모든 Xenopus의 실험은 실험실 동물 실험에 대한 유럽 공동체위원회 지침 (609분의 86 / EEC)의 규칙에 따라 릴 1 대학의 동물 시설에서 수행 하였다. 동물 프로토콜 (위원회 (CCT) 디부 Ethique 실내 실험 ANIMALE 노르 파 드 칼레 CEEA 07/2010)을 지역 기관 심사위원회에 의해 승인되었다.
1. 난자 처리
- 마취 솔루션을 준비 : 멸균 물 1 L에 tricaine 메탄 설포 네이트 분말 1g을 용해.
- 여성 Xenopus의이 솔루션에 laevis의 플 런지는 탈출을 방지하고 동물이 완전히 (다리 핀치에 어떤 반응없이) 진정 될 때까지 약 45 분을 기다리는 비커를 다룹니다.
- 다음 깨끗한 알루미늄 호일에의 뒷면에있는 동물을 배치 비누로 개구리를 씻고 수돗물로 씻어.
- 복부 측 부분과 집게 난소 레벨에서 피부 클램프.에탄올 70 %와 함께 사용하기 전에 청소 가위로 약 1cm의 절개를합니다. 섹션이 충분히 깊은 있는지 확인 및 개발의 여러 단계에서 여러 난자가 발견되는 난소 조직의 절제를 허용하는 기본 복벽에 도달 할 수 있습니다.
- ND96 매체 (96 mM의 NaCl을, ....
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결과
PG 자극의 24 시간 (도 2B, 2C) 후 Xenopus의 난자와 백분율 난자 GVBD 결정의 운동 성숙 :
eIF4G1-DN 돌연변이 병진 영향을 연구하기 위해, 제노 푸스에서 PG에 대한 응답은 (H 2 O, GFP) eIF4G1-WT와 다른 제어 상태와 비교 된 cRNA eIF4G1-DN 마이크로 인젝션 된 난자 laevis의. 컨트롤에 관계없이 주입 된 cRNA 또는 eIF4G1 과발현의 성격의 난자 미세 주사의 발생을 평가 할 수 있습니다.
마이크로 인젝션 된 제어 조건에 의해 특징 10 모세포 (H 2 O 및 GFP)의 운동 maturations는 WT 유사하며 GVBD을받은 횟수는 PG 자극 (도 2B) 후 매우 12에서 서로 근접하고 24 시간이다. 24 시간 .......
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토론
번역은 여러 가지 신경 퇴행성 질환 등 다양한 인간 질환의 physiopathology에 관여하는 메커니즘입니다. 파킨슨 병의 예를 들어 여러 보고서 유전 변이 8,12,13과 관련된 번역에 손상을 제안했다.
여러 셀룰러 모델은 번역을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, eIF4G1 및 8의 eIF4E 파트너 간의 상호 작용을 감소시키는 등의 우성 네가티브 돌연변이 작용 eIF4G1에서 돌연변이 병진 영향을 연구하기 위해, 제노 푸스 난 모세포는 laevis의 사용. 이 생화학 실험 물질의 상당량을 선도하고 난자 성숙의 다른 단계의 육안 관찰을 용이하게 합성 mRNA를 미세 주입을 용이하게 하나의 단일 거대 세포로 구성되어 있기 때문에이 모델은 단순성의 이점을 갖는다. 이러한 과정은 안정한 세포에 비해 시간도 효율적라인 생성. 또한, 난자 준비 및 RNA microinjections 여러 프로토콜은.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille)의 보조금으로 지원되었습니다. MCCH는 Fondation de France의 지원에 감사를 표하며, V5-플라스미드를 기증해 주신 IRCL, V5-플라스미드를 기증해 주신 Sonenberg 교수님, 항-GFP 항체를 기증해 주신 Dissous 박사(Pasteur Institute, Lille), 제노푸스 난모세포를 구입한 UMS 3387(Rennes 대학), 원고 본문을 비판적으로 읽어주신 Taymans 박사(JPArc, Lille)에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 트리카인 메탄 설포네이트 | 산도즈 | MS-222 | 난모세포 취급 |
| 겸 | 모리아 | 듀몬트 MC40 | |
| 스트렙토마이신/페니실린 | 시그마 | 781 | |
| 피루브산 나트륨 | 시그마 | P2256 | |
| 대두 트립신 억제제 | 시그마 | T9128 | |
| 테트라사이클린 | 시그마 | T7660 | |
| 수의사 흡수성 Vicryl 실 | Johnson& Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche 진단 | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | 합성 mRNA |
| DNAse/RNAse 무료 H2O | 준비 Life Technologies | 10977 | |
| 아세트산 나트륨 | Merck | 6268 | |
| 앱솔루트 에탄올 | 시그마 | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| 에티듐 브로마이드 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE 키트 | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| 포름알데히드 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| 포름아미드 | Fluka | 47671 | |
| 젤 독 이미저 | Biorad | ||
| 난자 피펫 100 8" 유리 모세혈 | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | 미세주입 |
| 교체용 유리 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µ m 필터 | Millipore | SLHA025NB | |
| 프로게스테론 | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | 웨스턴 블롯 |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A4612 | |
| 류펩틴 | 시그마 | L8511 | |
| 아프로티닌 | 시그마 | A1153 | |
| 벤자미딘 | 시그마 | B6506 | |
| PMSF | , 시그마 | P7626 | |
| 바나데이트 나트륨 | 시그마 | S6508 | |
| 램리 완충액 | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE, Novex 4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE 전기 영동, 미니 프로티안 TGX | Biorad | 456-1036 및 -1096 | |
| 수평 반건조 블로팅 시스템 | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL 멤브레인 | Amersham Life Science | 10401180 | |
| 메탄올 | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan 생명 과학 | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | 폴리아데닐화 분석 |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| 클로로포름 | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy 미니 키트 | Qiagen | 74106 | |
| RTL 버퍼 | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse 세트 | Qiagen | 79254 | |
| 프라이머 | Eurogentec | ||
| T4 RNA 리가제 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| 고용량 c-DNA 역전사 키트 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq 중합효소 | Life Technologies | 10342020 |
참고문헌
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....
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재인쇄 및 허가
