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방법 논문

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

8.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52730

⸱

2015년 6월 24일

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

이 논문에서

요약

우리는 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs) 매개 시냅스 전달의 시냅스 전 메커니즘을 분석하기 위해 직접 라이브 이미징을 허용하는 복부 해마 – 측좌 회로의 유전자 키메라 제제를 in vitro에서 개발했습니다. 이 제제는 또한 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

초록

시냅스 전 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs)의 활성화에 의한 축삭 신호의 지속적인 향상 및 신경전달물질 방출 증가는 아세틸콜린(ACh)에 의한 신경조절의 중요한 메커니즘입니다. 온전한 축삭돌기 내부와 신경 말단의 신호 전달 메커니즘을 시험관 내에서나 생체 내에서나 조사하는 데 어려움이 있기 때문에 시냅스 가소성의 시냅스 전 구성 요소에 대한 연구의 진전이 제한적이었습니다. 여기에서는 시냅스 전후 뉴런의 유전적 프로필을 선택적으로 변화시키면서 전달의 시냅스 전후 구성 요소를 모두 분석하기 위해 직접 실시간 이미징을 허용하는 체외 복부 해마(vHipp)-측좌(nAcc) 회로의 유전자 키메라 제제를 소개합니다. 우리는 vHipp 마이크로슬라이스의 돌기가 시냅스 전 축삭 입력으로서 nAcc에서 분산된 뉴런인 시냅스 후 표적과 함께 여러 개의 신뢰할 수 있는 글루타메이터 시냅스를 형성한다는 것을 보여줍니다. nAChR의 다양한 아형의 시냅스 전 국소화가 감지되고 동시 전기생리학적 기록 및 라이브 셀 이미징에 의해 시냅스 전 니코틴 신호 매개 시냅스 전달이 모니터링됩니다. 이 제제는 또한 in vitro에서 글루타메이터 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

서론

회로 흥분성의 콜린성 변조인지의 기본적인 양태에 기여하고, 변경된 콜린성 변조는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 정신 분열증 및 중독 1-4 포함한 신경 퇴행성 질환 및 신경 기능이다. 중추 신경계의 시냅스 전달의 콜린성 촉진의 설립 메커니즘은 사전 시냅스 사이트에서 번역 된 nAChRs 직접 활성화를 통해입니다. 간접적으로 특정 nAChR을 서브 타입, 그리고 상대적으로 높은 칼슘 전도에 직접적으로 인해를 통해 세포 내 신호 폭포 -이 사전 시냅스 수용체의 활성화는 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 전 시냅스 터미널의 증가에 이르게 5함으로써 신경 전달 물질 방출을 향상. 실제로, 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 신경 전달 물질을 포함한 다양한, GABA, 아세틸 콜린의 방출의 변화와 연관되어있다차 도파민 6-10. 이 프로세스는 다양한 간접적 시냅스 전기 생리 학적 방법을 이용하여 검토했지만, 광학 기자 [CA는 2+] i 및 시냅스 소포 재활용 프리 시냅스 현상의 직접적인 시간적으로 정확한 측정을 허용한다.

nAChRs의 사전 시냅스 현지화는 전자 현미경 (EM) 레벨 11, 12에 nAChRs 직접 면역 금 표지와 함께 설득력있게 입증되었다. 다른 여러 기술들은 배양 된 신경 세포 (13, 14)에 nAChRs subunit- 형광 단백질 키메라의 위치를 검출 포함한 간접적 nAChR을 현지화를 해결하기 위해 사용되고, 시냅스 말단 (15, 16)에 nAChR을 전류의 전기 생리 학적 기록 [캘리포니아 니코틴 유도 변화를 모니터링 에 의해 시냅스 터미널에서 라이브 세포 이미징 (17), 및 신경 전달 물질 방출의 간접적 인 모니터링에 의한 시냅스 신경 터미널에서 2 +] I스티 릴 양친 매성 FM 염료 (FM1 -​​ 43와 FM4-64) 및 / 또는 synapto-pHluorin에 의해 및 글루타메이트에 대한 아세틸 콜린과 iGluSnFr에 대한 CNiFERs 같은 특정 형광 신경 전달 물질 기자, 볼 시냅스 소포의 세포 외 유출을 포함 형광 지표와 라​​이브 세포 이미징 기법, 18 ~ 20. 전반적으로, nAChRs의 사전 시냅스 현지화를 식별이 현재의 접근 방법이 복잡하고, 신뢰할 수있는 식별 및 사전 시냅스 활동의 생리 학적 모니터링을 할 수 있도록 특별한 시스템과 기술을 필요로한다.

확인하고 시냅스 전달의 사전 및 사후 시냅스 구성 요소를 모두 분석에 직접 액세스를 제공합니다 핵 중격 의지 (NACC) 회로 - 여기서 우리는 복부 해마 (vHipp)의 체외 공동 문화 시스템에 대한 프로토콜 및 장비에 대해 설명합니다. 우리는 전 시냅스 nAChRs의 현지화 및 칼슘 신호와 신경 전달 물질 방출 ALO 매개 nAChR을의 라이브 세포 이미징의 예를 보여NG vHipp 축삭. 여기에 제시된 프로토콜 천연 (및 간단한) 확장은 다른 유전자형으로부터 뉴런 구성된 전후 시냅스 접촉의 제조이다. 이러한 방식으로 변조 전 및 / 또는 후 - 시냅스 메커니즘 특정 유전자 산물의 기여는 직접 평가할 수있다.

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프로토콜

모든 동물 실험 (2012 개정, NIH 간행물 번호 80-23) 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행되었고, 연구 기관 동물 관리의 승인을 스토니에 연구위원회에 사용되었다 브룩 대학 (# 1618과 # 1792).

1. vHipp-NACC 시냅틱 공동 문화

  1. 희생 마우스 (출생 후의 일 0 - 야생형 (WT) 또는 α7 nAChRs 유전자 변형 마우스 라인 3) CO 2. 각각의 강아지 목을 벨 및 사후 사실상의 유전자형에 대한 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 꼬리를 저장합니다. 멸균 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
  2. 전체 뇌를 노출 가위와 집게로 두개골의 상단을 제거합니다. 서로 꼬리 쪽의 대뇌 피질 부분은, 해부 현미경 vHipp 5,21 등 후방 피질을 포함하는 코로나 섹션을 얻을 시점에서 시작.
  3. V를 해부하다개발 마우스 뇌 아틀라스 (22) (그림 1A)에 따라 CA1-subiculum 지역을 포함 HIPP 조직을 제거합니다. 추운 문화 미디어 (4 ° C의)를 포함하는 35mm 배양 접시로 전송, 작은 얇은 조각 (μm의 약 100 × 100 μm의 microslices)으로 잘라.
  4. 37 ° C의 배양기에서 적어도 30 분 동안 배지 (~ 500 μL)를 24 웰 조직 배양 플레이트 내부 12mm 폴리 D 라이신 / 라미닌 - 코팅 유리 커버 슬립을 사전 부화. microslices 도금하기 전에 용지를 제거합니다.
  5. (microslices의 ~ 20 개 함유 ~ 50 μL) 미디어의 최소량과 커버 슬립의 중심에서 화재 연마 파스퇴르 피펫 접시는 이식편의 부착을 용이하게한다. 하나의 동물에서 발생하는 플레이트 vHipp의 microslices (중 + / + 또는 - / - 유전자 변형 α7 라인의 유전자형) 각 coverslip에에.
  6. 외식은 커버 슬립에 정착 한 후, 부드럽게 일까지 추가 미디어 (~ 100 μL)를 추가E 벽되도록 매체의 레벨은 아니지만 그 커버 슬립의 중앙에서 완전히 둘레에 이식편을 커버하기에 충분히 높다.
  7. 37 ° C에서 O / N 배양 한 후, 5 % CO 2 배양기, 출생 후 1 일 (WT) 쥐에 배아 일 18 NACC 신경을 분산하고 외식에 추가 할 수 있습니다.
    1. 개발 마우스 뇌 아틀라스 (20) (그림 1B)에 따라 NACC 조직을 해부하다.
    2. 15 ML 튜브 및 전송 (500 500 μm의 microslices × μm의 주위에) 작은 조각으로 잘라.
    3. 37 ° C에서 15 분 동안 0.25 % 트립신 (2 ㎖)로 처리. 워시 조직 덩어리를 차가운 세척 미디어 3 회 (5 ㎖, 4 ° C의) 차가운 문화 매체에서 한 세척 한 다음 (5 ㎖, 4 ℃). 서스펜션은 각 세척 단계에서 5 분간 휴식 한 다음 조심스럽게 상층 액을 부어하도록 허용합니다.
    4. 가볍게 화재 광택 파스퇴르 피펫으로 배양 배지 2 ㎖ 부드러운 분쇄하여 세포를 떼어 놓다.
    5. 트랜스5 분 동안 2,000 X rpm에서 또 다른 15 ML 튜브와 원심 분리기에 FER 세포 현탁액. 상층 액을 제거하고 6 새끼 당 1 ml의에서 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 부드럽게 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 언론에 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산.
    6. vHipp 외식 각 coverslip에에 분산 NACC 세포의 0.25 ML을 추가합니다.
    7. 가습 37 ° C의에서 문화를 유지, 5 % CO 2 배양기. 기계적으로 시냅스 형성을 촉진, 안정 및 습도를 유지하기 위해 적신 멸균 거즈 패드에 문화 판을 놓습니다.

2. 면역 세포 화학

  1. 문화 수정 - 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당 (5 체외에서 7 일) / PBS (~ coverslip에 500 μL, 20 분, RT).
  2. 0.25 % 트리톤 X-100 / PBS와 Permeabilize 하시려면 배양 (~ 커버 슬립 당 ​​500 μL, 5 분, RT).
  3. PBS 10 % 정상 당나귀 혈청 블록 문화 (~ coverslip에 500 μL, 30 분, RT) antibod 이전Y 염색. 4 ° C에서 O / N 일차 항체에 품어. 안티 포성 글루타메이트 트랜스 포터 1 (1 : 250), 안티 GAD65 (1 : 100); 안티 nAChRs (항 α 5 소단위, 1 500 500 α 4 -ECD 1) 다음과 같은 일차 항체를 사용합니다.
  4. (coverslip에 3 회 / ~ 500 μL, 5 분) PBS로 일차 항체를 세척 한 후 (~ coverslip에 500 μL, 1 : 500) 알렉사 488에 복합 이차 항체에 문화를 품어 또는 커버 슬립 당 ​​알렉사 594 (~ 500 μl를 1 : 37 ℃에서 1 시간 동안 500).
  5. 이전 라벨 표면 α7 * nAChRs에 대한 고정 37 ° C에서 45 분 (문화 미디어에서 1,000 ~ coverslip에 500 μL, 1) 알렉사 594에 결합 αBgTx의 문화를 품어.
  6. 마운트 및 밀봉 된 커버.
  7. 플랜-고차 색지움 목표 (0.8 NA 1.4 또는 NA와 오일 63X 20X)을 구비 한 형광 현미경과 CCD 카메라로 이미지를 캡처.

3. FM1 -​​ 43 기반 소낭 퓨전

  1. , 영상 실 - (체외에서 7 일 5) 디스크 공 초점 현미경을 회전에 챔버를 탑재 문화를 유지한다. 지속적으로 실온에서 HBS 칵테일 (1 ml / 분)를 관류.
  2. 90 초 동안 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (염색)에 10 μm의 FM1 - 43와 관류 및로드 문화를 중지, 칼슘 ADVASEP-7 (0.1 mm)를 포함하는 무료 HBS로 15 분 거리에 외부 염료를 씻어 막 결합 FM1 -​​ 43을 청소할 수 있습니다.
  3. 120 초 동안 FM1 - 43없이 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (탈색)과 문화를 자극 같은 조건을 사용하여 FM1 - 43와 문화를 다시로드, 및 CA 다시 포함 2+ 무료 HBS 씻어 ADVASEP-7 15 분.
  4. CCD 카메라와 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 53​​0 ㎚)과 캡처 이미지를 갖춘 회전 디스크 공 초점 현미경으로 FM1 -​​ 43 형광 이미지를 획득.
  5. 1 분 기준 FM1 -​​ 43 형광 이미지 (매 2의 수집) 사전 니코틴 제어와 같은; 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용하고 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 5 분 동안 매 2 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다.
  6. 전에 FM1 - 43 형광 강도 (F 염색)과 후 (F의 탈색) 각 시냅스의 부통에서 니코틴 응용 프로그램을 정량화.
  7. 이전과 니코틴 응용 프로그램 (ΔF = F 염색 -F의 탈색) 후 FM1 - 43 형광 강도의 차이를 정량화하여 vHipp 축삭을 따라 해제 FM1 - 43 형광의 총량을 계산합니다. 다음 식에 니코틴 후 형광 강도 저하의 비율을 분석 : F 감소 % = ΔF / F 염색.

4. 칼슘 이미징

  1. 다음 (5 μm의 FLUO-4 칼슘 2 + 지표와 문화를로드, 정상 HBS 빠르게 - (체외에서 7 일 5) 문화를 씻어AM 에스테르) 및 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 HBS 0.02 % 플루로 닉 F-127 (2 mL)을 첨가 하였다.
  2. (3 회 / 5 분) HBS와 FLUO-4 솔루션을 세척 할 것. (37 ° C / 5 % CO 2) 적어도 30 분 동안 인큐베이터 문화를 돌려줍니다.
  3. 동일한 촬상 실과 FM1 -​​ 43 기반 소포 융합 절에서 설명한 바와 같이 동일한 조건으로 배양 물을 유지한다 (단계 3.1 참조).
  4. 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 53​​0 ㎚)와 CCD 카메라와 vHipp 마이크로 조각에서 축삭 돌기의 FLUO-4 형광 이미지를 수집합니다.
  5. 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용, 사전 니코틴 컨트롤로 기준 FLUO-4 형광 이미지 (2 분마다 10 초)을 수집 한 다음 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 30 분마다 10 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다.
  6. 일련의 원시 FLUO-4 형광 이미지, 수출의 모든 프레임을 저장추가 분석을 위해 TIFF 포맷 이미지.
  7. 전에 vHipp 축삭을 따라 니코틴 신청 후 FLUO-4 형광의 통합 강도를 수집합니다.
  8. 하기 식으로 통합 된 형광 강도를 정규화한다 ΔF / F = 0 (FF 0) / F 0 배경 보정 전 니코틴 집적 형광 강도이며, F는 각각의 시점에서 vHipp 축삭을 따라 집적 형광 강도 F 0, 니코틴 신청 후. 분석하고 정규화 집적 형광 강도를 플롯.

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결과

사용 준비는 체외에서 vHipp-NACC 회로의 유전자 키메라 공동 문화로 구성되어 있습니다. vHipp의 microslices에서 냄새가 나는데 계획은 사전 시냅스 축삭 입력으로, 후 시냅스 대상, NACC에서 분산 된 뉴런과 시냅스 연락처를 만들 수 있습니다. vHipp에 의해 신경 지배 NACC 신경 세포에서 글루타메이트 전송의 지속 (≥ 30 분) 촉진을 유도 니코틴은 사전 시냅스 α7 * nAChRs 통해 vHipp 축삭 (5)에 따라 신호 (21)와 연장 칼슘을 축삭.

그림 1은 vHipp 마이크로 조각에서 돌기 (vGluT1 긍정적) 글루타메이트하고 있음을 직접 보여 연락처가 NACC에서 분산 된 GABA 성 중간 가시 신경 세포로 만든 것을 (GAD 긍정적, 그림 1C, D). (α4 및 α5 서브 유닛 포함) α7 *와 비 α7 모두 * nACh...

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토론

공동 배양 제제는 기재된 재 저항하는 것을 시험 관내 복부 해마-중격 의지 회로. 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 변속기 (5), (21)를 강화 유도하는 공간 및 시간 프로파일이 제조 허가 비교적 간단하고 신뢰성 시험.

공동 배양 생체 -like 함수를 보여주는 시험 관내에서 생리적 조건을 제공 할 수있는 하나의 접시에 다른 특정 세포 유형의 증식으로 정의된다. 기존의 신경 세포 신경 세포의 공동 문화는 서로 다른 종류의 세포 사이의 시냅스 상호 작용 연구를위한 신경 과학 연구에 도입되었다. 그러나, 이러한 사전 및 공동 배양에서 시냅스 후 사이트를 식별하기 어렵다. 이 microslice - 해리 신경 공동 문화 프로토콜은 사전 시냅스 축삭 및 사후 시냅스 목표를 쉽게 인식 할 수 있습니다. 다른 뇌 영역에서 사용 microslices O다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

기술 지원에 대해 Yehui Qin과 Mallory Myers에게 감사드립니다. 또한 항-α4-ECD 항체를 제공해 주신 Sigismund Huck 박사님께도 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 NS22061 L. W. R.의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1. 배양 배지 (50 ml)
Neurobasal GIBCO1088802248 ml
B-27 보충제GIBCO0080085-SA1 ml
페니실린-스트렙토마이신GIBCO10908-0100.5 ml
GlutaMAX 보충제GIBCO35050-0610.5 ml
뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF)GIBCO15140-12220 ng/ml
2. 세척 매체 (HBSS, 100 ml)
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음 GIBCO14175-09599 ml
헤페스 (1M)GIBCO15630-1301 ml
3. HEPES 완충 식염수  (HBS)    pH=7.3
NaCl시그마S9888 135 밀리미터미터
KCl시그마P9333 5 밀리미터미터
MgCl2SigmaM8266 1 밀리엠
CaCl2,시그마C1016 2 밀리엠
HEPES시그마H3375 10 밀리미터미터
포도당시그마G0350500 10 밀리미터미터
4. 라이브 이미징을 위한 HBS 칵테일 pH=7.3
NaCl시그마S9888 135 밀리미터미터
KCl시그마P9333 5 밀리미터미터
MgCl2SigmaM8266 1 밀리엠
CaCl2,시그마C1016 2 밀리엠
HEPES시그마H3375 10 밀리미터미터
포도당시그마G0350500 10 밀리미터미터
테트로도톡신 Tocris10782 &마이크로; M
bicucullineTocris13110 &마이크로; M
D-AP-5Tocris10550 &마이크로; M
CNQXTocris104520 &마이크로; M
LY341495Tocris1209 10&마이크로; M
5. 칼슘 프리  에이브지    pH=7.3
NaCl시그마S9888 135 밀리미터미터
KCl시그마P9333 5 밀리미터미터
MgCl2SigmaM8266 1 밀리엠
HEPES시그마H3375 10 밀리미터미터
포도당시그마G0350500 10 밀리미터미터
6. 56 mM 칼륨 ACSF pH=7.4
NaCl시그마S9888119 mM
KCl시그마P933356 mM
MgSO4.7H시그마M18801.3 mM
CaCl2시그마C10162.5 mM
NaH2PO4시그마S82821 mM
NaHCO3시그마S576126.2 mM
포도당시그마G0350500 10 밀리미터미터

참고문헌

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