동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

요약

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

초록

이동하는 세포의 능력은 암 및 암전이에에서 배아 발생 및 상처 치유 수명에 걸쳐 세포 기능의 다양한 중요하다. 강렬한 연구 노력에도 불구하고, 세포 이동의 기본 생화학 및 생물 물리학 적 원리는 아직도 완전히 특히 생리 관련 3 차원 (3D) 미세 환경에서 이해되지 않습니다. 여기서는 3D 세포 이동 동작의 정량적 검사가 가능하도록 설계 시험 관내 분석을 기술한다. 이 방법은 이전에 빈 세포 외 기질 (ECM)로 마이그레이션하는 세포의 mechanosensing 능력과 성향을 이용한다. 우리 모델 시스템으로서 콜라겐 겔에서 고도로 침윤성 유방암 세포의 침윤, MDA-MB-231을 사용한다. 주 동안 배양 세포 집단의 확산 및 개별 세포의 이주 역학 라이브 세포 이미징을 사용하여 모니터링 및 시공간 - 분해 된 데이터를 추출하기 위해 분석 될 수있다. 게다가상기 방법에 따라서 세포 이동에 생물 물리학 적 미세 인자의 역할을 조사하기 간단하지만 강력한 방법을 제공하고, 다양한 세포 외 기질을위한 용이하게 적응할 수있다.

서론

세포의 이주는 배아 발달, 지혈, 면역 응답으로서뿐만 아니라, 혈관 질환, 염증, 암과 같은 병리학 ^한 공정에서 다양한 생리 학적 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 이동의 기초 생화학 및 생물 물리학 적 요인을 해부하여 세포 기능의 기본 원리를 이해뿐만 아니라, 조직 공학, 안티 전이 및 항 염증성 약물 개발 등 다양한 생물 의학 응용 프로그램을 전진뿐만 따라서 근본적으로 중요하다. 생체 관측 기술적 도전이기 때문에, 많은 노력은 세포 이동의 시험관 재현부에 집중되어왔다.

세포의 이동을 연구하는 체외 방법에서 크게 특히, 두 개의 차원 (2D) 표면 분석을위한 스크래치를 설계 또는 ^분석이 상처 ^{치유되었습니다.} 이러한 분석은 간단한 실험 장치를 제공, 쉬운 가축세포 이미징 및 세포 이동의 기초가 다양한 생화학 적 메커니즘에 유용한 통찰력을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 생체 마이그레이션에 대한 이해의 중요한 측면이다 세포 외 기질 (ECM) 건축과 리모델링을 고려하지 않습니다. 최근에는 점차 3D 배양 모델은 종종 콜라겐 계 매트릭스 ^3에서, 더 나은 상황 생체 유사한 플랫폼을 제공....

프로토콜

1. 세포 수확

1. 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 MD-MBA-231 세포를 얻습니다. 0.5 % 트립신 - EDTA 용액을 이용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리합니다. T25 플라스크에서 배양 세포 트립신 EDTA 용액 1 ㎖를 사용합니다.
2. 4 분의 200 × g에서 원심 분리하여 15ml의 원뿔형 튜브 펠렛의 세포 상등액을 흡인하고, 세포를 재현 탁 배양액 5ml에.
3. 혈구를 사용하여, ρ, 셀 밀도를 계산.
   주 : 셀 시드 내측 겔을 제조하기 위해, 세포 현탁액을 이후 10 × 최종 세포 파종 밀도에 도달하기 위해 희석된다. 따라서, 10 × 세포 현탁액 농축이 요구된다.
4. 10 × 세포 농도를 달성하는 데 필요한 유체의 체적을 계산한다 :
   
   참고 : 마지막 셀 시드 밀도를 _최종 C, 약 2의(15); 10 ⁶ 세포 / ㎖의 MD-MBA-231 ....

결과

여기에 제시된 동심 겔 분석 고도로 침윤성 유방암 세포를 사용하여 수행하고, MDA-MB-231, 2.4 ㎎ / ml의 내측 콜라겐 젤, 예로서 = 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 세포 시딩 밀도와. 도 2에 도시 된 바와 같이, 통상적으로 배양 몇 일 후, 세포 내외 겔 인터페이스를 위반하고 외측 겔 침투하기 시작했다. 셀 인구는 반경 방향 바깥쪽으로 주로 확산.

외측 겔 중합 조건은 세포 이동 특성에 관한 행렬의 밀도 및 기계적 성질의 역할을 연구하기 위해 수정 될 수있다. (3) 1.5 mg을 외측 겔 각 셀의 움직임을 도시한다 / ㎖, 2.4 ㎎ / ㎖, 및 4.0 ㎎ / ㎖의 콜라겐은, pH가 7.4에서 중합. 공 촛점 시간 경과 화상이 8 시간에 대한 내측 및 외측 겔 사이의 경계에서 획득 한 세 가지 콜라겐 concen에서 세포의 변위 된trations 흰.......

토론

이 프로토콜에서 우리는 생체 내에서 발생하는 ECM과 위상학적으로 유사한 매트릭스 환경에서 세포의 3D 이동 거동을 연구하기 위한 시험관 내 분석을 설명합니다. 현재 사용 가능한 다른 방법과 비교하여 이 분석에는 세 가지 주요 강점이 있습니다. 첫째, 이 분석을 통해 집단 수준과 개별 세포 수준 모두에서 세포 이동 메커니즘을 동시에 검사할 수 있습니다. 이것은 집단 세포 이동¹³을 연구할 수 있는 가능성을 열어주며, 이는 현재까지 주로 2D 분석¹⁴으로 제한되어 왔으며, 동시에 집단 내에서 개별 세포의 행동을 관찰합니다. 자연적으로 그룹 또는 클러스터로 이동하지 않는 세포의 경우, 이 분석은 다양한 국소 미세 환경을 가진 다수의 세포로부터 이동 특성을 자세히 분석하는 방법을 제공하며, 이는 이동 효율성 및 방향성 지속성의 생물물리학적 기원에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다^7,15.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 배양 인큐베이터	Fisher Scientific Pte Ltd	모델: 371, S/No 318854-6055
컨포칼 현미경	Nikon A1R		인큐베이터 챔버가 장착된 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)	Life Technologies	11965-092
소 태아 혈청(FBS)	Life Technologies	10082-147
형광 CellTracker 염료 CMTMR	Life Technologies	C2927
유리 바닥 접시	IWAKI Cell Biology	3931-035	직경 12mm 직경의 유리 바닥 웰이 있는 35mm 직경 접시
혈구계	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer 개선)
마이크로프로세서 pH 측정기	Hanna Instruments	pH 211
뉴트라겐 Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	산 가용화 소 콜라겐 유형 I(재고 pH ~ 2)
대물 렌즈	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
페니실린-스트렙토마이신	라이프 테크놀로지	15140-122
pH 측정기	Sartorius	S/No 29153352	기본 pH 측정기 PB-11
트립신-EDTA	라이프 테크놀로지	15400-054

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