방법 논문

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers

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⸱

DOI:

10.3791/52742

⸱

2015년 6월 24일

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

이 논문에서

요약

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

동작은 신경계에 의해 조절된다. 칼슘 이미징 Caenorhabditis 엘레 다양한 동작 중에 뉴런의 활성을 측정하기 위해 투명 간스 선충에 간단한 방법이다. 행동 신경 활동의 상관 관계, 동물 고정화되지 않아야하지만 이동할 수 있어야한다. 많은 행동 변화는 긴 시간 규모 동안 발생과 행동의 많은 시간 동안 기록이 필요합니다. 이것은 또한 배양하는 데 필요한 식품의 존재에 웜을 만든다. 어떻게 웜 배양과 신경 활동은 긴 시간 규모에 걸쳐 영상화 할 수 있습니까? 아가로 오스 Microchamber 이미지 (AMI)는 이전에 문화를 개발하고 작은 유충을 관찰하고 지금 C의 성인 무대까지 초기 (L1)의 모든 삶의 단계를 연구하도록되어 있었다 엘레. AMI는 C의 다양한 삶의 단계에서 수행 할 수 있습니다 엘레. 장기 칼슘 이미징 COM 짧은 노출 외부 트리거를 사용하여 동물을 고정하지 않고 달성된다전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 녹화 전자 증배 bined. 축소 또는 스캔은 병렬로 40 벌레까지 이미지에이 방법을 확장 할 수 있습니다. 따라서, 방법은 C의 모든 삶의 단계에 긴 시간 규모에 걸쳐 이미지의 행동과 신경 활동에 설명 엘레.

서론

Caenorhabditis elegans는 행동1을 연구하기 위한 모델 시스템으로 확립되었습니다. 유전학에 대한 용이성으로 인해 행동의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 많은 행동이 장시간 척도에서 발생합니다. 장기간에 걸쳐 운동성 동물을 관찰하기 위해 두 가지 주요 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 첫 번째 접근법은 자동화된 스테이지 또는 카메라2-8을 사용하여 움직이는 동안 동물을 따라가는 것이고, 두 번째 접근법은 카메라9-14의 시야만큼 작은 범위로 움직임을 제한하는 것이다. 두 방법 모두 장점이 있습니다. 추적을 통해 긴 공간 범위에서 동물을 추적할 수 있지만 한 실험에서 식별할 수 있는 동물의 수는 제한됩니다. 동물의 이동을 제한하면 제한된 구획 배열을 사용하여 동시에 많은 개체로 관찰을 확장할 수 있습니다.

선충은 투명하기 때문에 생형광 이미징을 비침습적으로 수행할 수 있습니다15. 칼슘 이미징은 흥분성 세포의 활동에 대한 기능적 판독을 제공하며 예쁜꼬마선충16-20에 대해 확립됩니다. 칼슘은 탈분극 시 열리는 원형질막의 채널을 통해 세포로 들어갑니다. 따라서 칼슘은 신경 활동의 대리 역할을 합니다. 칼슘 센서는 비율계량 센서와 비비율계량 센서의 두 가지 주요 등급으로 분류할 수 있습니다. 두 부류 모두 칼슘의 결합에 유도되는 칼슘 결합 단백질의 구조적 변화를 사용합니다. 비율계량 센서에는 두 개의 형광 단백질이 포함되어 있습니다. 저파장 형광 단백질이 여기되면 빛 에너지의 일부가 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 또는 푀르스터 공명 에너지 전달(Förster Resonance Energy Transfer, FRET)21이라는 과정에서 거리의 함수로 고파장 형광 단백질로 전달됩니다. Non-ratiometric 센서는 원형 치환된 GFP를 기반으로 하며 칼슘 결합22에 의해 발생하는 형광단의 담금질을 사용합니다. 각 클래스에는 장점이 있습니다. 비율계량 센서는 움직임이나 표현 아티팩트에 덜 민감하지만, 비비율계량 센서는 일반적으로 더 높은 동적 범위를 갖습니다. 비율계량 및 비비율계량 센서 모두 예쁜꼬마선충(C. elegans) 16-20,23,24에서 흥분성 세포의 활동을 연구하는 데 유용했습니다.

장기 형광 이미징을 수행할 때 실험자는 몇 가지 잠재적인 문제를 처리해야 합니다. 1. 여기광을 통한 행동 방해: 웜은 단파장 형광 여기광에 민감하며 칼슘 이미징에 사용되는 보라색에서 파란색 범위의 빛을 피합니다25,26. 웜은 후방 또는 전방 탈출 반응으로 반응합니다25,26. 따라서 빛의 양을 제어해야 합니다. 2. 형광 센서 단백질의 표백: 형광 단백질의 표백은 종종 장기 이미징을 방해합니다. 그러나 일반적으로 백화 현상을 관찰하는 데 필요한 빛의 강도는 동물의 행동에 방해 효과를 일으키는 빛의 강도보다 높습니다. 따라서 표백은 이러한 유형의 칼슘 이미징에서 이론적인 문제일 뿐입니다. 3. 마이크로 챔버 내부의 웜은 고정되어 있지 않고 깨우기 동작 중에 계속 움직이며 웜이 움직이지 않으면 이미지가 흐려질 수 있습니다. 이러한 모든 문제는 낮은 광 강도에서 매우 짧은 노출 시간을 사용하여 해결할 수 있습니다. 이는 노출 시간이 짧고 발광 다이오드(LED)의 외부 트리거링을 제공하는 고감도 EMCCD 카메라를 사용하여 실현할 수 있습니다. 웜을 가능한 한 짧게(카메라의 노출 시간 동안에만) 조명광에 노출시키기 위해 LED는 노출 중에 카메라가 방출하는 TTL(Transistor-Transistor Logic) 신호를 사용하여 외부에서 트리거되어 카메라 칩이 노출되는 정확한 시간 동안 웜의 조명을 생성합니다. 이는 또한 EMCCD 칩이 데이터 판독 중에 어두워진다는 것을 의미하며, 이는 이 칩의 판독 성능에 최적입니다.

이전에는 예쁜꼬마선충 유충 9의 장기 형광 이미징을 위해 아가로스 마이크로챔버가 개발되었습니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 장기 칼슘 이미징에 아가로스 마이크로 챔버를 사용하는 방법, 칼슘 이미징을 수행하는 방법 및 이 방법을 확장하여 많은 개별 벌레를 병렬로 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 악기, 문화 미디어 및 요리

  1. 초점 샘플을 유지 할 수 있고 그가 자동 단계가 장착되어 현미경을 사용합니다. 주문 제작 뚜껑 히터를 구축하거나 상용 솔루션을 구입할 수 있습니다. 카메라의 노출은 제조업체의 지침을 사용하여 TTL 신호를 통해 LED 조명을 트리거하는 LED-EMCCD 카메라 시스템을 설정합니다.
    참고 : 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
  2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 :
    1. 미세 유체 시설에서 PDMS 스탬프를 제작 또는 상업적 주조에 의해 생성 된 PDMS 스탬프를 가지고있다. 상업적 주조를 사용하려면 장치 (예를 들면 15 μm의) 깊이를 회사의 AutoCAD 파일을 전송하고 지정. 파운드리에서 제공 한 후, 메스를 사용하여 16 우표로 PDMS 칩을 잘라.
    2. 공기 플라즈마를 이용하여 유리 슬라이드에 개별 스탬프 접합. 접착 용, PDMS 스탬프 및 공기 플라즈마에 유리 슬라이드를 모두 노출시합 1 분 (0.5 mbar에서 높은 플라즈마 설정을 사용하여). 접착을위한 표면이 플라즈마 처리시 위쪽으로 향하도록해야합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드에 PDMS 스탬프를 놓습니다.
  3. 3.5 cm 바닥 접시를 타고 수직 밀링 머신과 날카로운 회전 커터를 사용하여 요리의 바닥의 중심에서 18 X 18mm의 사각형 영역을 잘라. 마찰에 의해 생성 된 열에 의해 녹아 플라스틱 않도록 커터 느린 공급의 낮은 회전 속도를 사용한다. 한 번에 여러 요리를 준비합니다.
    참고 : 아래 접시 실험 후 여러 번 재사용 할 수는 순수한 에탄올 O / N에 몸을 담근 후 세척됩니다.
  4. 아가로 오스 :
    1. 100ml에 3g 고 융점 아가 디졸브 S-기저 (5.85 g 염화나트륨 1 g을 K 2 HPO 4, 6 g을 KH 2 PO 4 에탄올 1 ml의 콜레스테롤 (5 ㎎ / ㎖), H 2 O 1 L은 비등에 의해) 고압 증기 멸균에 의해 소독. 2 mL의 에펜 도르프 튜브에 아가 로스 STOR 용해의 분취 만들기전자. 또한, 고 융점 아가 정확하게 같은 저 융점 아가로 오스의 배치를 준비한다.
    2. 98 °의 C - (95)에서 아가 로스 사용 가열 블록 상에 고 융점의 분취 량을 3 배치에 앞서. 35 ° C -이 30 가열 블록에 다음 용융 될 때까지 98 ° C - (95)에서 아가 로스 가열 블록에 사용 저 융점 분취 한 배치에 앞서.

동물의 2. 선택

  1. 깨끗한 동물을 얻기 위해 시드 NGM 판에 낮은 밀도로 벌레를 성장. 음식과 단 몇 동물의 많음이 접시에가 있는지 확인합니다.
  2. 영상 L1 유충를 들어, 신선한 시드의 NGM 접시에 프레첼 단계에서 배아를 포함 약 30 알을 전송합니다. 나중에 유생 또는 성인 C.를 전송 엘레는 신선한 시드 NGM 판에 30 벌레를 전송합니다.

아가로 오스 Microchambers 3. 준비

  1. 요리의 준비 :
    1. 하단에 18 X 18mm의 정사각형 구멍에 플라스틱 접시를 타고 거꾸로 위를 향 입구에 배치합니다. 오프닝에 20 × 20mm의 양면 접착 테이프의 조각을 배치하여 구멍을 닫습니다. 접착 테이프가 바닥에되도록 요리를 돌아서 및 하드 표면에 접시를 놓습니다. 무료 메스를 사용하여 구멍을 잘라.
    2. P1000 피펫을 사용하여, 접시에 S-바살 3 % 고 융점 아가 로스 2 ㎖를 채운다. 개방을 둘러싸고있는 영역으로 아가로 오스를 놓고 공고히 할 수 있습니다. 아가로 오스는 고체 때까지 기다립니다.
    3. 요리 돌아서 접착면이 접시에 남아 노출 될 수 있도록 양면 접착 테이프를 덮고있는 보호 필름을 벗겨.
      주 : 결과적으로, 접착 테이프의 미세 링 개구의 외측을 둘러싸는 것. 아가 이후 샘플을 둘러싸는 수분 저류로서 기능한다.
  2. microchambers의 주조 :
    1. 일을 노출60 초 - 20 공기 플라즈마로 성형 전자 PDMS 표면.
      주 :이 플라즈마 처리는 기포의 포착을 방지하여 선명한 인쇄를 생성하는 PDMS 친수성 ​​표면 렌더링한다.
    2. 9 유리 슬라이드 - (5)를 적층함으로써 동일한 높이의 두 개의 스페이서를 구축합니다. 장소, 긴 변, 제 1 스페이서 스택 후 단일 유리 슬라이드, 다시 스페이서 스택 평행. 스페이서를 통해 직교 PDMS 스탬프가 들어있는 유리 슬라이드를 놓습니다. PDMS 스탬프의 성형면과 단일 유리 슬라이드 사이에 약 1.5 mm의 공간이되도록 스페이서의 높이를 조정한다.
    3. PDMS가 액체 아가로 수직 슬라이딩 스탬프 신속 PDMS 스탬프 가까운 단일 유리 슬라이드 상에 뜨거운 액체 고 융점 아가로 오스의 드롭을 배치하고. 아가로 오스가 응고 보자. 그것은 일반적으로 약 2 분 소요 불투명 한 외관을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하나의 이동과 수직으로 스탬프를 당깁니다.
      참고 : GL 편리UE 스페이서는 양면 접착 테이프와 함께 슬라이드. 우표의 수직 운동은 아가로 오스에 갇혀 얻기에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다.
  3. 미세한 백금 와이어 픽업을 사용하여 아가로 오스에 OP50 박테리아와 함께 계란 나 웜을 전송합니다. 속눈썹을 사용하여 음식과 함께 한 계란 또는 챔버 당 하나의 벌레를 배포합니다. 하나 아가로 오스 패드에 약 30 알을 입력합니다.
  4. 이 접시의 구멍에 잘 맞도록 약 15 X 15mm의 정사각형으로 채워진 microchambers을 포함하는 아가로 오스 슬래브를 잘라. 집게로 광장 아가 슬래브를 들고 20 × 20 ​​mm의 유리 커버 슬립에 뒤집어 놓습니다. 한 번 떨어졌다 다시 들어 올려 또는이 세균과 벌레가 자신의 방 밖으로 밀려 발생할 수 있기 때문에 주위를 밀어하지 않습니다.
  5. 요리의 조립 :
    1. 플라스틱 접시의 개방에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 부드럽게 양면 접착 테이프로 만든 반지에 유리 커버 슬립을 누르십시오.유리를 깰 않도록주의하십시오.
    2. 거꾸로 접시를 뒤집어 30 ° C로 냉각 microchambers 함유 액체 한천 슬래브 저 융점 아가로 오스와 저장조 사이의 갭을 ​​채우기 위해 P1000 피펫을 사용한다. 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다.
    3. 뚜껑 접시를 밀봉합니다. 거꾸로 현미경 가열 뚜껑을 사용합니다. 직립 현미경 정상 뚜껑을 사용하고 파라 필름으로 접시를 밀봉.
  6. microchambers의 준비를 마친 후, 실체 현미경 하에서 여부를 확인합니다. 올바른 충전은 매우 중요하다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.

4. 칼슘 이미징

  1. 이러한 HBR16 27 ([pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 : UNC-54-3'UTR, UNC-119 (+)] goeIs5)와 같은 유전자 인코딩 된 칼슘 센서를 발현하는 형질 전환 균주를 사용합니다.
  2. 넓은 필드 표면 형광를 갖추고 복합 현미경을 사용합니다. 에 EMCCD 카메라의 TTL 출력을 연결합니다카메라 샘플 조명 될 프레임을 기록 할 때마다하도록 LED의 TTL 입력. 약 5 밀리의 노출 시간을 사용합니다. 50-300의 범위에서 EM 게인을 사용합니다.
  3. 매 15 이미지화되는 각 웜에 24 시간 동안 버스트 영화 실행을 지정 - 먼저 30 분 (DIC) 20 초, GCaMP를 기록하고 mKate2 신호의 최종 이미지를 취할 GFP의 형광 20 초에 촬영 발현 수준의 제어. 각 버스트 동안 2 / 초의 프레임 속도를 사용한다.
  4. 비주얼 데이터 검사 용, 형광 강도의 작은 변화의 시인성을 향상시키기 위해 거짓 컬러 맵을 사용한다. F는 형광의 평균 기본 가치와 ΔF / F와 같은 플롯 형광 데이터,. 칼슘 데이터 분석의 상세한 설명은 문헌 (20)에서 찾을 수있다.

여러 웜 5. 병렬 AMI

  1. 현미경에 microchambers을 포함하는 접시를 놓고 샘플에 집중하고 autofo 참여기분이야. 카메라 웜 당 1,920 프레임 데이터의 적절한 양을 초래할 것이다 : 24 시간, 20 초에서 30 분마다 시간을 40 이미지 프레임의 버스트를 획득하도록 소프트웨어 프로토콜을 설정한다. 이 단계를 사용하여 각 벌레를 방문 할 수 있도록 검색을 설정합니다. 하나 실행에 약 30 벌레를 촬영하는 것을 목표로하고 있습니다.
  2. 낮은 배율을 사용하여, 즉, 축소하여 이미지 여러 웜. 카메라 칩으로 여러 microchambers을 커버하고 동시에 여러 인접 microchambers을 필름에 낮은 배율을 사용합니다. 화상 취득의 종료 후, 동물을 다루는 하나의 관심 영역을 잘라내어 개별 챔버에 대한 데이터를 분리한다.
  3. 빠르게 이동 데이터를 평가하기 위해, 프레임 빼기 28-32을 사용합니다.

C의 6 이미징 다른 생활 단계 엘레

  1. C의 모든 삶의 단계에 대한 아가로 오스 microchambers를 사용하여 엘레 (L1)에서 성인을 포함 dauers에. DIF에 해당하는 실 치수를 사용하여표 1에 나타낸다 ferent 수명 단계.
생활의 단계 챔버 크기 챔버 깊이 일반 녹화 시간 확대
(L1) 190 X 190 μm의 10-15 μm의 달걀 - 중간 (L2) 400X
(L2) 370 X 370 μm의 15 μm의 달걀 - (L3) 200X
영속 유충 370 X 370 μm의 25 μm의 사일 200X
(L3) 700 X 700 μm의 45 μm의 L2 - L4 200X
(L4) 700 X 700 μm의 45 μm의 젊은 L4 - 젊은 성인 100X
젊은 성인 700 X 700 μm의 45 μm의 12-24 시간 100X

서로 다른 삶의 단계 표 1. 회의소 크기. 표시됨은 8 × 8mm 카메라 칩에 최적화 된 다양한 단계에 유용 챔버 크기와 배율.

결과

아가로 오스는 microchambers C. 임의 생활 단계에 적용될 수있다 엘레. 도 1a에서 알 수있는 바와 같이, L1에 lethargus 동안 유생 수면 행동이 관찰 될 수있다. 깊은 190 X 190 μm의, 10 μm의 아르 챔버 크기는있는 바와 같다. 장시간 스케일이 필요한 경우,보다 큰 챔버가 사용될 수있다. 더 큰 크기 (370 X 370 ㎛ 인, 25 ㎛의 깊이)와 챔버를 사용하여,도 1b에서 알 수있는 바와 같이, C.의 개발을 허용 엘레 계란에서 성인까지. 그림 1C 성인까지 알에서 챔버에서 자란 벌레의 프레임 빼기를 사용하여 동작의 장기적인 변화의 분석을 보여줍니다. 웨이크 및 lethargus 중 선택 버스트 프레임 공제 후 평균 강도가 표시됩니다. 웜의 이동성 낮은 프레임 빼기 값 이후의 평균 강도가 낮을​​. 표시 한 웨이크 상태와 애벌레 단계 당 하나의 lethargus 조건에서 버스트 흔적을 선택한다.개발하는 동안 평균 강도의 관찰 증가는 동물의 증가 대비 및 크기에 주로 기인한다. 그림 1D는 영속 유충, 불리한 환경 조건 33시에 종사하는 다른 삶의 단계를 보여줍니다. 챔버 크기는 370 X 370 μm의, 15 μm의 깊이. 영속 유충 단계에서 종료를 야기하는, 영속 유충이 박테리아 음식없이 챔버에 넣고 있습니다. 그림 1E는 이미 챔버로 많은 계란을 누워있다 성인 벌레를 보여줍니다. 성인에 사용되는 챔버 크기는 깊이 700 X 700 μm의, 45 μm의했다. 마지막으로, 그림 1 층은 성인 자웅 동체 및 성인 챔버 내부의 남성 짝짓기를 보여줍니다.

운동성이 웜에 칼슘 이미징. GCaMP 칼슘 센서 가능합니다 2A, L1 유충 (27)에 대한 명령 interneuron AVA의 B 쇼 칼슘 이미징 피규어. 2c는 SA를위한 칼슘 활성을 나타내는 D,도성인 동물에서 신경 세포의 날 유형.

장기 영상을 스케일링 주사함으로써 확대 및 축소가 가능하다.도 3a는 5 메가 픽셀 카메라로 하나의 카메라 칩 (30)의 웜 동시 촬상의 화질을 도시한다.도 3b는 동시에 묘화 4 웜 칼슘의 이미지 품질을 나타낸다.

figure-results-1
C의 모든 삶의 단계에 AMI 1. 적응 그림 190 X 190 μm의 챔버에서 초기의 L2 단계까지 이른 (L1)에서 몇 군데 간스. (A) 유충. 370 X 370 μm의 챔버에서 성인까지 달걀에서 (B)를 개발. 웜의 (C) 이동성 프레임 빼기를 사용하여 평가 하였다. 각 유생 역에 대해 하나의 선택 버스트 영화 프레임 공제 후 이미지의 모든 사진의 평균 강도는 표시합니다웨이크 및 lethargus 행동 GE. 370 X 370 μm의 챔버에서 음식의 부재 (D)의 영속 유충. 700 X 700 μm의 챔버에 배치 많은 계란 (E) 성인 자웅 동체. (F) 남성의 결합 및 700 X 700 μm의 챔버 내부의 자웅 동체. 나중에 젊은 성인을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
AMI 그림 2. 칼슘 이미징. AVA NMR-1 프로모터를 사용하여 L1 유충의 명령 interneuron에 GCaMP3와 () 칼슘 이미징. 두 거짓 컬러 이미지를 나타낸다. 왼쪽 이미지에서 AVA의 활성이 낮고, 웜은 역방향 운동을하지 않는다. 오른쪽 그림에서 아바의 활동이다 높은 및 웜은 뒤로 이동합니다. (L1) 웜 시간 이상 (B) 칼슘 과도. (C, D) 성인 동물의 칼슘 과도를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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축소에 의해 병렬로 그림 3. 이미징 여러 웜. (A) 동시 190 X 190 μm의 챔버를 사용하여 프레임 당 30의 L1 웜의 이미징 및 100X 배율 (10 배 목표를 사용) 및 16.6 X 14mm 카메라 칩. (B) 370 X 370 μm의 챔버 및 100X 배율과 16.6 X 14mm 카메라 칩의 관심 영역을 사용하여 프레임 당 사 (L3) 웜의 동시 영상.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

하드웨어

현미경의 초점은 전형적으로 장기간의 화상 획득 동안에 드리프트 할 것이다. 복합 현미경, 초점을 지키는 시스템하는 주요 현미경 제조 업체에서 구입하실 수 있습니다. 포커스 제어와 화합물 현미경 너무 비싼 인 경우에, 간단한 대안은 실체 현미경을 사용하는 것이다. 화합물 현미경은 높은 개구 수 (NA)가 목표의 사용을 허용하고 용이하게 자동화 될 수있다. 40X 오일 목표는 적합하다. 침수 렌즈 때문에 장기 이미징 동안 증발의 이상적인 수 없습니다. 미분 간섭 대비 (DIC)는 형태 학적 및 행동 변화를 수행하는 데 도움이 좋은 대비를 생성하지만 간단한 시야 촬상 또한 사용될 수있다. DIC 또는 시야 이미징, 현미경의 직경 - 조명 경로로 붉은 빛이 필터를 배치하여 붉은 빛을 사용합니다. 여러 microchambers 스캐닝하기위한 자동화 단계가 필요하다. 최고의 성능을 교류입니다스테이지 비선형 가속과 감속을 가지며, 주사시 동물을 방해하지 않도록 낮은 주사 속도로 설정 될 수 사용될 때 hieved. 우리는 웜의 mechanosensitive 시스템을 활성화하지 않습니다 실제로 그 느린 스캔을 제안 행동 반응 또는 스캔하는 동안 mechanosensitive 뉴런 (ALM 및 PLM)에서의 칼슘 증가를 관찰하지 않은 (데이터가 표시되지 않음). 상용 LED 시스템을 사용할 수있다. 몇몇 회사는 서로 다른 파장의 LED를 포함 즉시 사용 가능한 솔루션을 제공합니다. LED 외부 TTL 신호와 LED 트리거링 옵션을 가져야한다. 고감도 카메라 동물 이동 칼슘 이미징 필요하다. EMCCD 카메라는 시장에서 가장 민감한 카메라이다. 카메라는 노출시 TTL 출력 (또한 "화재"출력)를 가질 필요가있다. 뚜껑 히터 거꾸로 현미경을 사용하는 경우에는 뚜껑에 응축을 방지 할 필요가있다. 직립 현미경에서 접시가 배치 될 수 있도록 뚜껑 WI하단에하고 것이다 따라서 결로를 방지하고 더 뚜껑 가열이 필요하지 않습니다. 뚜껑 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 접시를 닫고 단단히한다.

PDMS 스탬프

아가 로스를 성형하기위한 구조를 포함 PDMS 스탬프의 표면 거리 PDMS 스탬프를 지원 유리 슬라이드에서 직면된다. 사용자 정의 마이크로 유체 칩을 제공하는 회사와 목록은 위키 백과에 (찾을 수 있습니다 http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies )을.

자신의 방에 선충을 작성

이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계이며, 다음 사항이 고려되어야한다 : A), 아가 로스의 보습이 벌레를 전송 및 이미징에 매우 중요하다. 아가로 오스, 즉, 너무 습하면, 액체 COV가여러 microchambers의 면적 거릴, 그것은 액체 박테리아 멀리 흐르게하므로 제어 된 방식으로 박테리아와 웜 식품을 분배하는 것이 가능하지 않을 것이다. 아가로 오스가 너무 건조하면 다음과 세균과 벌레가 증가 힘이 쉽게 아가로 오스의 손상을 일으키는 벌레와 박테리아를 삭제하는 데 사용 될 필요가 있음을 의미 쉽게 선택을하지 못할 수도 있습니다. 웜을 많이 채울 때 아가로 오스는 건조 할 수있다. 최악의 경우 아가로 오스는 챔버가 붕괴 될 그래서 결국 건조 될 것이다. 아가로 오스가 너무 건조한 경우에는 웜이없는 칩의 측면 상에 작은 방울 S-기저 (약 2 μL)를 배치하여 재수 화 될 수있다. 그런 다음 액체로 선택 백금 와이어를 찍어 심지어 챔버가 벌레로 가득 영역에 액체의 일부를 빼냅니다. B) 음식의 양을 성공적으로 장기 촬상 중요하다. 충분한 음식이없는 경우, 웜은 부족할 수있다. 과도한 음식은 챔버의 캐비티가 있다면액체처럼 오히려 고체처럼 행동하지 않으며 벌레가 박테리아를 밀어 챔버에서 탈출 할 수 있습니다. 전체 챔버를 채우는 세균 현탁액을 획득하는 것을 목표로하고 있습니다. 벌레는 실험 기간 동안 그들의 길이의 대부분을 따라 한천과 유리 표면에 일정한 물리적으로 접촉하고 크롤링 동작은 액체에서 탈곡하는 접시에 운동과 유사과 유사하지 않은 것으로 보인다. 실험을 망칠 수 아가로 오스의 손상 C) 기계. 좋은 선택이 필수적이다. 그것은 날카로운 모서리가 없어야합니다. 피펫 팁에 부착 소프트 속눈썹은 백금 픽업을 사용하는 대신 챔버 내로 박테리아 나 웜을 이동하는데 사용될 수있다. 그러나 대부분의 경우, overdried 아가 손상에 대한 이유이다. 픽업 또는 속눈썹이 이상적 간신히 웜 및 박테리아 해내한다 아가로 오스 상에 자체 및 수막을 터치한다. 챔버를 밀봉 할 때, 다시, 아가 로스의 수분이 필수적이다. 이하지 말아야이 밀봉 동안 세균과 벌레를 씻어 수 있기 때문에 아가로 오스 표면에 어떤 무료 액체를합니다. 큰 기포가 부드럽게 한천 슬래브의 모서리를 해제함으로써 제거 될 수있다. 자주 챔버 안에 갇혀받을 실보다 작은 작은 거품. 이러한 거품은 문제가되지 않습니다 및 흡수에 의해 사라집니다. 접시를 조립 한 후, 아가로 오스가 너무 건조하거나 젖은 것을 다시 확인합니다. 챔버는 잘 밀봉해야하며, 챔버 사이에 액체의 흐름이 안됩니다. 아가 너무 젖은 경우 챔버가 제대로 밀봉되지. 웜 탈출하거나 그들의 음식은 멀리 세척한다. 샘플이 너무 습하면, 간단한 뚜껑을 열고 2 분의 아가로 오스 건조를 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 건조하면 챔버는 붕괴 할 수 있으며, 웜 탈출합니다.

축소에 의해 확장

형광 이미징의 경우, 축소하는 낮은 배율에서 얻어진 빛의 적은 양에 의해 제한된다. 또한, 전자MCCD 카메라는 감도에 최적화 종종 상대적으로 낮은 해상도를 가지고있다. 그러나 영상 4 배 규모를 확대하는 것은 물론 가능하다. 140X (20X 목적 및 0.7X 카메라 마운트를 사용하여 달성) 배율 및 512 X 512 화소, 8 × 8 mm 카메라를 사용할 때 예를 들어, 190 μm의 X 190 μm의 네 챔버는 하나의 프레임에 맞게 할 수있다. (예 : sCMOS 카메라, 16.6 mm X 14mm 칩, 2560 X 2560 픽셀 = 5.5 메가 픽셀)을 큰 칩과 고해상도 카메라는 DIC와 밝은 필드 이미징의 최대 확장 최적화합니다. 100X 배율을 사용하는 경우 예를 들어, 190 μm의 30 L1 벌레까지 X 190 μm의 챔버 (도 3 참조)이 카메라의 각 프레임에 맞게 할 수있다. 원칙적으로, 줌 아웃 및 주사는 동물의 더 큰 수를 획득하기 위해 결합 될 수있다. 하나의 초점 평면 이미지를 만들 필요가 있도록 대부분의 뉴런은 초점이 꽤 잘있어. 뉴런 피에조 드라이브를 사용하여 검사를 AZ, 초점이 이동하는 경우에 발견되는 각각의 시간 (P)에 취해질 수OINT.

다른 동작에 적응

이 프로토콜은 긴 시간 규모에서 행동의 좋은 아이디어를 제공합니다. 물론, 버스트의 타이밍은 다른 동작과 생활 단계에 적응 될 필요가있다.

기술의 한계

여러 가지 요인이 영상의 지속 시간을 제한 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 음식의 양이다. 음식이 소비되면, 유충 개발 중지합니다. 따라서, 작은 실에서 (190 X 190 μm의) 웜은 L3 단계까지 개발 한 후 체포. 이상 촬상 시간이 필요하다면, 더 큰 챔버가 사용될 수있다. 3 일 - 장기 영상의 최대 길이는 2.5의 범위이다. 이상 촬상이 필요한 경우, 웜을 회수하고 새로운 챔버에 배치 될 필요가있다. 성인 벌레를 이미징 할 때, 다른 제한은 이러한 웜의 자손에 의해 발생합니다. 성인 벌레는 유충 부화에서 알을 낳는다. 이 유충은 챔버 내부에 남아있을 것입니다식품을 소비하고, 이미지 분석을 방해 할 수있다. 자손이 문제가 될 경우에는, 멸균 성인 용액을 사용하거나 또는 신선한 챔버로 벌레를 반복적으로 배치하는 것이다. 벌레를 복구하기 위해, 챔버를 포함하는 아가로 슬래브 메스 자유로운 절단은, 커버 슬립을 뽑아되며 웜을 회수 할 수있는 NGM 플레이트 상에 배치된다. 또 다른 한계는 상대적으로 작은 지역에 벌레의 제한 사항입니다. 장거리 이동 분석되어야 할 경우 문제가 될 수있다. 챔버에 동물을 기계적 optogenetically 21,27,34,35 자극 될 수 있으나, 챔버의 밀봉 특성 어려운 가용성 또는 휘발성 자극을 적용 할 것이다. 산소 또는 이산화탄소와 같은 생물학적으로 중요한 가스 한천에서 자유롭게 확산 할 수있다. 접시에 큰 공기 탱크는 실험에 필요한 시간에 걸쳐 일정 챔버의 가스 농도를 유지해야합니다. 그러나, 마음 로컬 산소 concentratio에 보관해야N 실에서 더 많은 접시에 문화보다 액체 문화에서 발견되는 조건과 유사 할 수 있습니다.

기존의 방법에 대한 의미

미세 유체 장치는 크게 C에서 공부 행동 및 발달 고급 엘레. 종종, 미세 유체 구조는 PDMS (12)로 만들어진다. 여기서 우리는 아가로 만든 미세 배양 챔버를 생성하는 프로토콜을 기술한다. 이 기술의 장점은 높은 품질 영상화, 생리적 측정 장기 이미징 및 합리적으로 높은 처리량과 행동의 상관의 조합이다. 고화질 높은 NA를 사용하여 목표 유리 커버 슬립으로 촬상함으로써 달성된다. 그 결과, 칼슘 이미징 및 세포 내 구조물의 촛점 이미징 형광 촬상을 행할 수있다. 동물이 다른 시스템들에서와 같이 고정되지 않기 때문에, 그 생리 학적 측정과 행동의 상관을 허용한다. 벡ause 동물이 충분한 음식을 가지고, 이들은 장기간 촬상있게 계속 개발. 이 시스템은 동물 정의 된 챔버에 하나 실행에 이미지 많은 벌레 제한 할 수 있기 때문이다. 따라서,이 방법은 쉽게 9,27,34-36을 확장 할 수 있습니다.

미래의 응용 프로그램

지금까지,이 시스템은 C. 수면 행동을 연구하기 위해 주로 사용되어왔다 엘레 L1 유충. 그러나, 모든 단계에 대한 적응이 가능 또한 dauers 및 성인에서 행동의 넓은 범위를 공부하게됩니다. 행동의 광범위한는 짝짓기에서 달걀 누워에 이르기까지이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

막스 플랑크 사회와 HB에 괴팅겐 대학원 주니어 그룹의 봉급은이 작업을 지원.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고융점 아가로스피셔 생물 시약BP(E)164-1000
탑 비전 저융점 아가로스Thermo ScientificR0801
LED 시스템CoolLEDpE-2
복합 현미경NikonTiE
실체 현미경LeicaM5
EMCCD 카메라AndoriXon 897이제 iXon Ultra 897
sCMOS 카메라AndorNeo
Plasma cleanerHarrickPDC-23G2
Lid heaterMPI 워크샵맞춤형
플라스틱 접시Falcon08-757-100A
Z-스테이지 현미경용 이전나노 스캔 Z
XY 스테이지로 판매됩니다. 현미경이전Proscan III
PDMS 스탬프Abbott Laboratories맞춤형
레드 라이트 필터ChromaET660/50m
35mm 페트리 접시팔콘팔콘 일회용 페트리 접시, 멸균, 코닝
양면 접착 테이프Sellotape/Henkel양면 25mm x 33m또는 Rubance Adhesives의 고급 양면 점착 테이프를 사용할 수 있습니다.
은

참고문헌

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094(2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208(2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198(2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782(2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853(2013).

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