방법 논문

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

DOI:

10.3791/52752

⸱

2015년 5월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

초록

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웨스턴 블롯 등의 설립 방법과 더불어, 새로운 방법을 쉽고 빠르게 synucleopathies의 실험 모델에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS D)를 정량화하기 위해 필요하다. 과발현 인간 A53T의 αS를 자발적으로 체중 감소, 쇠약, 및 심각한 운동 장애 등의 증상을 특징으로 나이 여덟 22 개월 사이 극적인 임상 표현형을 개발하는 트랜스 제닉 마우스 선 (M83)는이 연구에 사용 하였다. 이 마우스 αS D (질병 관련 αS)의 분자 분석을 위해, ELISA 특별히 아픈 쥐에서 αS D를 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 마우스 모델에서 중추 신경계의 분석은 주로 꼬리 뇌 영역과 척수 αS D의 존재를 보여 주었다. 즉, 임상 질환으로 이어지는 다른 실험 조건 사이의 αS D 분포의 차이는 uninocul에 없었다ated 정상적으로 형질 전환 마우스를 노화와 병 마우스의 뇌 추출물 접종 생쥐에서. Ser129에 대한 항체를 사용하여 αS D 면역 반응의 구체적인 검출은 본질적으로 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학에 의해 얻어진 그 상관 관계를 ELISA로 αS를 인산화. 예기치 않게, 유사한 결과 αS의 C 말단 부위에 대해 여러 가지 다른 항체를 관찰 하였다. "프리온 같은"기구의 관련을 암시 αS D의 전파는, 쉽게 감시되고 따라서, ELISA 접근법을 사용하여이 마우스 모델에서 정량화 할 수있다.

서론

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파킨슨병(PD)의 실험 모델에서 질병과 연관된 α-시누클레인(αSD)을 검출하는 현재의 방법으로는 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯이 있으며, 이들은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않습니다. 이 신경퇴행성 질환은 정상적으로 용해성인 시냅스전 단백질인 αS1,2(Lewy체와 Lewy 신경섬유)의 집합체 형태로 주로 알파-시누클레인 침착을 특징으로 합니다. 일반적으로 마진적으로 인산화된 αS는 이러한 침착에서 세린 129 잔기에서 과인산화되며3, Ser129 인산화된 αS에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 모니터링될 수 있어 병리의 신뢰성 있는 마커를 제공합니다.

최근 연구는 환자의 신경계에서 αS 침착의 전파에 "프리온 유사" 메커니즘이 관련될 수 있다는 것을 제안합니다4,5. 이러한 연구는 αSD를 함유한 뇌 추출물을 변이된 A53T 인간 αS 단백질과 관련된 심각한 운동 장애를 나타내는 M83 형질 전환 마우스 모델에 접종하여 시누클레인병의 가속화를 보고했습니다6. 같은 방식으로, 동일한 M83 마우스 모델에 재조합 αS를 뇌 내 접종하여 침착의 가속화를 확인했습니다5. 인간 DLB 환자의 뇌 추출물 또는 섬유상 재조합 αS를 C57Bl/6 야생형 마우스에 접종한 후에도 인산화된 αS 침착의 유도가 보고되었습니다7,8. Sacino et al.9는 최근에 섬유상 인간 αS를 주사한 후 M83 마우스에서 광범위하고 진행성인 뇌 αS 침착 형성이 유도될 수 있으나, E46K 형질 전환 마우스 또는 유도된 αS 침착이 일시적이고 주사 부위에 제한된 비 형질 전환 마우스에서는 그렇지 않다고 지적했습니다. 최근 원숭이에 대한 연구는 인간에 더 가까운 종에서 PD 유래 추출물 접종 후 αS 집합체의 전파를 확인했습니다10.

αS 변화와 파킨슨병 간의 연관성은 αSD가 파킨슨병의 잠재적 바이오마커라는 것을 시사합니다11. 최근 연구는 인간 뇌척수액(CSF) 및 혈장에서 α-시누클레인의 올리고머 용해성 집합체를 탐지하여 파킨슨병의 잠재적 바이오마커로 하는 기존의 샌드위치 시스템 ELISA를 사용하여 같은 항체로 αS를 포획하고 검출한 것을 보여주었습니다12. 이 방법에 기반하여, 생물학적 시료, 뇌를 포함한 다중 단백질이 인식되었는데, 조립된 형태에 여러 에피토프 복사가 존재하기 때문입니다13. 아주 최근에, 증명된 Lewy체 병리를 가진 환자의 CSF에서 병리학적 αS를 고도로 특이적인 αSD(5G4)에 대한 ELISA 키트 및 면역침전 분석을 사용하여 검출했습니다14. 이러한 방법은 PD/DLB 환자를 다른 치매 유형과 구별할 수 있습니다.

αS 침착의 "프리온 유사" 전파는 M83 형질 전환 마우스 모델에서 αSD를 특이적으로 식별하도록 설계된 ELISA 접근법을 사용하여 추가로 연구되었습니다. 이 연구에서, 우리는 병든 M83 마우스로부터 αSD를 접종한 것과 관계없이 병든 마우스에서, 그리고 특히 이 M83 형질 전환 마우스 모델에서 병리학적 과정에 의해 특히 타겟팅된 뇌 영역에서 αSD를 정량적으로 검출하는 데 사용된 상세한 ELISA 프로토콜을 보고합니다4.

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프로토콜

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모든 절차와 동물을 포함하는 프로토콜은 EC 지침 609분의 86 / EEC 및 오는, 동물 실험 (프로토콜 11-0043)에서 윤리의 고려에 대한 프랑스의 국가위원회의 비준을 따라했다. 동물 보관 및 ANSES의가 (0801 69387 승인 B) 리옹에 실험 시설을 승인에 마음에 든다고했다.

마우스 1. 준비

  1. 펜토 바르 비탈 나트륨의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사.
  2. 마우스 두개골에서 뇌 전체를 검색 및 추출까지 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
  3. 자궁 경부 척수의 압축을 풉니 다.
    참고 : 추출 αS 중 하나를 표 1에 나와있는 실험을 사용할 수 없습니다 시상 단면 후 또는 해부 마우스의 뇌에서 뇌 반쪽의 하나에서.
Experimen티 마우스
접종 (뇌에 해당) 		생존 기간
수 (dpi) 		중간 / 최대 생존
(일 이전) 		엘리사에 의해 D 감지 αS
/ WB / IHC
1 Uninoculated 마우스 441 ± 166 736분의 419 8/8
(2) 접종 한 마우스 (0.2 mg)을 150 ± 52 241분의 140 9/9

M83 마우스에서 수행 실험 표 1. 목록은. 예방 접종은 후, (포도당 1 % 중량 / 권 5 %) 아픈 마우스의 뇌 균질의 20 μL와 striato - 대뇌 피질의 영역에서 실험이 6 주에 실시 하였다 3 % 이소 플루 란 흡입 6 주 오래 된 동형 접합 M83 마우스의 마취. dpi로는 : 일 inocul 게시ATION.

뇌 반쪽 2. αS 추출

  1. Sagittally 두 개의 반쪽을 얻기 위해 뇌를 잘라. 그라인딩 볼을 넣은 ribolysis 튜브에 각각 절반을 단다.
  2. 에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM의 염화나트륨, 5mM의 EDTA, 1mM의 DTT, 1 % 인산 및 프로테아제 저해제 칵테일을 함유 고염 (HS) 버퍼를 준비한다. 20 % (중량 / 부피) 균질를 얻기 위해 뇌의 절반에 높은 소금 버퍼를 추가합니다.
  3. 6.0 M에서 기계 균질화를 사용하여 뇌의 반쪽에서 샘플을 준비 / S 23 초 동안 두 번. 첫 번째 23 초 균질화 한 후, 두 번째 23 초주기 전에 2 분 동안 얼음에 균질을 포함하는 튜브를 배치합니다.
  4. 5 분 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 200 μL 씩에 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ° C에서 그들을 유지, 상층 액을 복구 할 수 있습니다.

해부 두뇌 지역에서 3 αS 추출

  1. 해부끝 해마를 해부 할 때를 제외하고 함께 보관이 forcipes를 사용하여 낮은 전력 돋보기 (8 배 확대)와 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 전체 뇌. 뇌의 무결성을 유지하기 위해 10 분을 초과하지 마십시오. 뇌를 놓고 바로 옆이 순서대로 다음과 같은 뇌 영역을 검색 :
    1. 단지 전구 뒤에 배치 집게를 사용하여 두 개의 후각 전구 별도의 하나. 아래쪽으로 이동에 의해 뇌에서 분리. 두 번째 전구에 대해이 작업을 반복합니다.
    2. 조심스럽게 두 대뇌 피질 사이에 집게를 쐐기 두 대뇌 피질의 분리를 용이하게하기 위해 앞으로 이동합니다. 한 집게와 장소에 두뇌를 유지, 해마에서 대뇌 피질을 분리하는 또 다른를 사용합니다.
    3. 집게에게 피질 아래 2mm를 놓습니다. 해마의 상단이 보일 때까지 집게에 부드러운 압력을 유지한다. 피질의 첫 번째 부분을 벗겨, 두 번째 부분 반복합니다. 두 개의 대뇌 피질을 분리 집게를 사용하여해마에서 시작하여 뇌의 앞쪽으로 이동.
    4. 해마 중 하나 주위에 오픈 집게를 놓습니다. 부드럽게 최대한 복구, 제거 해마의 하단에있는 집게를 닫습니다. 두 번째 해마에 대해이 절차를 반복합니다.
    5. 선조체의 하나 아래 열린 집게를 놓고 부드럽게 뇌에서 분리. 선조체에서 남아있는 피질을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 두 번째 선조체에 대해이 절차를 반복합니다.
    6. 부드럽게 뇌에서 소뇌의 분리를 용이하게하기 위해 2mm 소뇌의 윤곽에 의해 우울하기 위해 집게를 사용합니다. 다만 소뇌 뒤에 집게를 놓고 앞으로 집게를 이동하여 제거합니다.
    7. 이 뇌간에 가입되는 시점을 명확하게보기 위해 중뇌 인상 집게의 넓은 부분을 사용합니다. 교차점에서 수직 절개 후 뇌간을 제거합니다.
    8. , 중뇌 뒤 집게를 배치하는 나는네 개의 둥근 구조로 구성 s의. 중뇌가 완전히 남아있는 뇌에서 분리 될 때까지 수직으로 절개.
  2. 가변 % HS 버퍼 (중량 / 부피), 가능한 조직의 양에 따라, 즉, 10 및 30 mg의 간 중량 5 % 파쇄, 30 및 80 mg의 간 중량 10 %, 및 20 %의 균질 준비 80 mg의 위의 무게.
    1. 균질 예상 %를 얻기 위해 해부 뇌 영역에 HS 버퍼의 적절한 볼륨.
    2. 소용돌이와 조직을 완전히 고속 버퍼에 포장되어 있는지 확인합니다.
    3. 붕규산 유리 튜브 및 두 방앗, 및 B. 이루어지는 조직 분쇄기로 해부 뇌 영역 또는 자궁 척수로부터 제조 된 샘플 균질화
    4. 튜브에 직접 분쇄 할 각 뇌 영역을 따르십시오. 튜브에 유봉을 삽입하고 철회. 조직을 떼어 놓다하기 위해이 운동을 약 10 회 반복한다. 그리고 C에 유봉 (B)를 사용상기 (20)의 움직임과 함께 조직 연마 ontinue. 1 ml의 전송 피펫 1.5 ML 튜브에 균질을 전송합니다.
  3. 어떤 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. , 상층 액을 검색 200 μL 씩에 그들을 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하십시오.

ELISA에 의해 αS 4. 검출

  1. 0.01 ng를 / ㎖으로 코팅 된 항체를 희석. 50 mM의 나 2 CO 3 / NaHCO3를 완충액 (pH 9.6)에 반 αS 토끼 폴리 클로 날 또는 단일 클론 클론 (42) 항체를 사용합니다.
  2. 코트는 96 웰 마이크로이 코팅 용액을 잘 당 100 μL, 그리고 4 ° CO / N에 둡니다. 검출 항체를 사용하여 ELISA를 syn514 용 코팅 용액에 안티 αS 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 42 LB509, AS11, 4D6 또는 8A5 클론. 코팅 용액으로 안티 αS 모노클로 날 항체 클론 (42)을 사용하여항 pSer129 αS 검출 항체와 조합.
    주 : 플레이트 ELISA 일주일 전에 4 ℃에서 유지 될 수있다 필요한 경우 수행된다.
  3. 물론 당 0.05 % 트윈 20 (PBST)와 플레이트를 인산 완충 생리 식염수 300 μL로 5 회 씻어 접시 세척기를 사용합니다. 이후이 단계에서 배양 실온에 있습니다.
  4. T20 PBS를 잘 당 버퍼를 차단의 200 μl를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 흔들어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
  5. (: 20 % 균질 100을, 10 %의 균질 1:50 PBST BSA 1 %에서 5 %의 균질 1시 25분 희석 1)를 각 웰에 100 μl를 추가 뇌 균질 액을 희석한다. 150 rpm으로 진탕하면서 다음 2 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
  6. 자료 목록에 언급 된 희석에서 BSA와 PBST 1 %를 다른 αS 검출 항체를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
  7. 안티를 추가150 rpm에서 진탕하면서 1 시간 동안 1 % BSA로 보충 PBST로 8000 : - 마우스 또는 항 - 토끼의 IgG HRP 접합체 (1) 희석 하였다. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
  8. 각 웰에, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 솔루션 '3,3의 100 μl를 추가하고 150 rpm으로 흔들어 동안 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
  9. 그럼 마이크로 플레이트 리더와 450 nm에서 흡광도 측정에 1 N의 HCl 100 μl를 첨가하여 반응을 정지.
  10. 데이터 분석을 위해, 분석 시료의 각각에 대해 측정 된 OD 값으로부터 임의의 마우스 뇌 샘플 (블랭크 웰)을 제외하고 모든 시약 웰에서 얻어진 OD 값을 뺀다.

5. 에피토프 매핑

  1. 오스만 (16)에 의해 기술 된 방법에있어서, 에피토프 맵핑을 수행한다. 간략하게, 10 중첩 아미노산 니트로 셀룰로오스 12 개의 아미노산을 함유하는 인간 α-synuclein의 시퀀스의 스폿 펩타이드.
  2. 50mM 트리스 / 150 mM의 염화나트륨 완충액 pH 1 차단0, 0.05 % 트윈 20, 5 % 우유 분말을 함유. 2-10 ° CO / ml의 N에서 당 2 μg의 항체 농도에서 차단 용액에 항체 인큐베이션.
  3. 세포막을 50mM 트리스 / 150 염소 항 - 마우스 IgG HRP 컨쥬 게이트 0.05 % 트윈 20을 함유하는 인큐베이션 mM의 염화나트륨 완충액 pH 10을 사용하여 세 번 씻는다. 다음 같은 버퍼를 사용하여 다른 5 배 웨스턴 블롯 TMB 염색 키트를 사용하여 얼룩 막 씻으십시오.

6. 통계 분석

  1. 외경을 모델로 혼합 효과 회귀 분석을 수행하기 위해 R 소프트웨어와 NLME 패키지를 사용합니다. 각각의 비교를 위해, 혼합 효과 회귀 모형을 수행합니다. 무증상 그룹에서 증상을 구분하는 고정 효과를 사용합니다.
  2. 주어진 마우스 반복의 변화를 반영하기 위해 임의의 효과를 사용합니다. 잔류 물을 검사하여 homoscedasticity 확인하고, 필요한 경우 및 핀 헤이 베이츠 1에 아울러 집단 내 에러의 분산 구조를 모델링 분산 함수를 사용7. (P)의 중요성 임계 값 0.05을 설정

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결과

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이 연구에서 사용 된 ELISA를 특별히 아픈 M83 마우스에서 높은 소금 버퍼에 준비 뇌 균질 질병 관련 αS (αS D)를 확인했다. 특히 pSer129 αS (P = 0.0074)를 인식하는 항체를 사용하여 ELISA 쉽게 젊은 (구 2-5개월), 건강 M83 마우스 (그림 1)에서 이전, 아픈 마우스 (> 8 개월)를 구별한다. 몇 가지 다른 항체는 유사하게 높은 신호 만 아픈 마우스의 뇌 균질 (> 0.6 OD)를 보여 주었다. 이 4D6에 대한 경우 (P = 0.01) 단백질 (124-134, 115-122의 C- 말단 부분의 다른 시퀀스에 대하여, LB509 (P = 0.0047) 및 8A5 (P <0.001), 그리고 129-140입니다 각각)과, 훨씬 적은 정도로 단백질 (p = 0.0003)의 N 말단 (2-12)에 대하여 syn514. 또한, AS11 모노클로 날 항체는 C57BL / 6S의 예방 접종 후 인간의 섬유의 재조합 αS ...

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토론

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ELISA의 사용은 구체적 M83 트랜스 제닉 마우스 모델에서 질병 중에 마우스 뇌 균질 물로부터 직접 αS D를 검출하는 것으로 입증되었다. 사실,이 ELISA 쉽게 높은 소금 버퍼 만 전체 뇌 균질를 사용하여 건강한 M83 마우스에서 아픈 M83 마우스를 구별 할 수있다.

이 ELISA를 사용하여 성공적인 결과를 위해 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 제대로 해부하는 동안 손상을 방지하기 위해 필요한 손재주를 개발하여 마우스 뇌의 다른 영역을 해부; 독점적 HS 버퍼에 샘플 희석을 수행하는 단계; 항체의 선택은, 모든 항체는 ELISA 형식으로 작동하기 때문이다.

αS D 수준의 일부 변화는 다른 생쥐 사이 그럼에도 불구하고 분명했다. 이러한 결과는 시험의 사크 의해서만 아픈 M83 마우스에서 검출 전형적인 αS D 패턴의 웨스턴 블롯 검출 동등Ser129에 대...

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공개 사항

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저자는 경쟁 이해 관계를 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 예방 접종에 대한 데미안 가일 라드 감사 및 후속 동물 실험을하고 싶습니다. 이 작품은 ANSES (식품, 환경 및 산업 보건 및 안전을위한 프랑스 기관)에 의해 재단 프랑스 파킨슨에서 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
LB509Abcamab27766Detection antibody 1/2,000
AS11Produced at AnsesDetection antibody 1/1,000
4D6Abcamab1903Detection antibody 1/2,000
PSer129Abcamab59264Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Detection antibody 1/1,000
syn514Abcamab24717Detection antibody 1/500
clone 42BD Biosciences610787Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonDetection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PCoating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferpH 7.5에서 조정하고 4 °C에서 보관
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSpH 7.5에서 조정
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815100 mM 스톡 용액, 독성
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150배 농축
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
탐폰 카보네이트 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10배 농축
TMBSigmaT0440ELISA에 사용
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302에피토프 매핑에 사용
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120이 단계에서 얼음위에 보관
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-10628X 배율
Forceps Dumont#7WPI14097해부 단계에 사용
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290
```

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
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  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
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  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
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