인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

요약

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αS^D)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

초록

웨스턴 블롯 등의 설립 방법과 더불어, 새로운 방법을 쉽고 빠르게 synucleopathies의 실험 모델에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS ^D)를 정량화하기 위해 필요하다. 과발현 인간 A53T의 αS를 자발적으로 체중 감소, 쇠약, 및 심각한 운동 장애 등의 증상을 특징으로 나이 여덟 22 개월 사이 극적인 임상 표현형을 개발하는 트랜스 제닉 마우스 선 (M83)는이 연구에 사용 하였다. 이 마우스 αS ^D (질병 관련 αS)의 분자 분석을 위해, ELISA 특별히 아픈 쥐에서 αS ^D를 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 마우스 모델에서 중추 신경계의 분석은 주로 꼬리 뇌 영역과 척수 αS ^D의 존재를 보여 주었다. 즉, 임상 질환으로 이어지는 다른 실험 조건 사이의 αS ^{D 분포의} 차이는 uninocul에 없었다ated 정상적으로 형질 전환 마우스를 노화와 병 마우스의 뇌 추출물 접종 생쥐에서. Ser129에 대한 항체를 사용하여 αS ^{D 면역} 반응의 구체적인 검출은 본질적으로 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학에 의해 얻어진 그 상관 관계를 ELISA로 αS를 인산화. 예기치 않게, 유사한 결과 αS의 C 말단 부위에 대해 여러 가지 다른 항체를 관찰 하였다. "프리온 같은"기구의 관련을 암시 αS ^D의 전파는, 쉽게 감시되고 따라서, ELISA 접근법을 사용하여이 마우스 모델에서 정량화 할 수있다.

서론

파킨슨병(PD)의 실험 모델에서 질병과 연관된 α-시누클레인(αS^D)을 검출하는 현재의 방법으로는 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯이 있으며, 이들은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않습니다. 이 신경퇴행성 질환은 정상적으로 용해성인 시냅스전 단백질인 αS^1,2(Lewy체와 Lewy 신경섬유)의 집합체 형태로 주로 알파-시누클레인 침착을 특징으로 합니다. 일반적으로 마진적으로 인산화된 αS는 이러한 침착에서 세린 129 잔기에서 과인산화되며³, Ser129 인산화된 αS에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 모니터링될 수 있어 병리의 신뢰성 있는 마커를 제공합니다.

최근 연구는 환자의 신경계에서 αS 침착의 전파에 "프리온 유사" 메커니즘이 관련될 수 있다는 것을 제안합니다^4,5. 이러한 연구는 αS^D를 함유한 뇌 추출물을 변이된 A53T 인간 αS 단백질과 관련된 심각한 운동 장애를 나타내는 M83 형질 전환 마우스 모델에 접종하여 시누클레인병의 가속화를 보고했습니다⁶. 같은 방식으로, 동일한 M83 마우스 모델에 재조합 αS를 뇌 내 접종하여 침착의 가속화를 확인했습니다⁵. 인간 DLB 환자의 뇌 추출물 또는 ....

프로토콜

모든 절차와 동물을 포함하는 프로토콜은 EC 지침 609분의 86 / EEC 및 오는, 동물 실험 (프로토콜 11-0043)에서 윤리의 고려에 대한 프랑스의 국가위원회의 비준을 따라했다. 동물 보관 및 ANSES의가 (0801 69387 승인 B) 리옹에 실험 시설을 승인에 마음에 든다고했다.

마우스 1. 준비

1. 펜토 바르 비탈 나트륨의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사.
2. 마우스 두개골에서 뇌 전체를 검색 및 추출까지 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
3. 자궁 경부 척수의 압축을 풉니 다.
   참고 : 추출 αS 중 하나를 표 1에 나와있는 실험을 사용할 수 없습니다 시상 단면 후 또는 해부 마우스의 뇌에서 뇌 반쪽의 하나에서.

Experimen티

마우스 접종 (뇌에 해당)

생존 기간 ....

결과

이 연구에서 사용 된 ELISA를 특별히 아픈 M83 마우스에서 높은 소금 버퍼에 준비 뇌 균질 질병 관련 αS (αS ^D)를 확인했다. 특히 pSer129 αS (P = 0.0074)를 인식하는 항체를 사용하여 ELISA 쉽게 젊은 (구 2-5개월), 건강 M83 마우스 (그림 1)에서 이전, 아픈 마우스 (> 8 개월)를 구별한다. 몇 가지 다른 항체는 유사하게 높은 신호 만 아픈 마우스의 뇌 균질 (> 0.6 OD)를 보여 주었다. 이 4D6에 대한 경우 (P = 0.01) 단백질 (124-134, 115-122의 C- 말단 부분의 다른 시퀀스에 대하여, LB509 (P = 0.0047) 및 8A5 (P <0.001), 그리고 129-140입니다 각각)과, 훨씬 적은 정도로 단백질 (p = 0.0003)의 N 말단 (2-12)에 대하여 syn514. 또한, AS11 모노클로 날 항체는 C57BL / 6S의 예방 접종 후 인간의 섬유의 재조합 αS ^.......

토론

ELISA의 사용은 구체적 M83 트랜스 제닉 마우스 모델에서 질병 중에 마우스 뇌 균질 물로부터 직접 αS ^D를 검출하는 것으로 입증되었다. 사실,이 ELISA 쉽게 높은 소금 버퍼 만 전체 뇌 균질를 사용하여 건강한 M83 마우스에서 아픈 M83 마우스를 구별 할 수있다.

이 ELISA를 사용하여 성공적인 결과를 위해 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 제대로 해부하는 동안 손상을 방지하기 위해 필요한 손재주를 개발하여 마우스 뇌의 다른 영역을 해부; 독점적 HS 버퍼에 샘플 희석을 수행하는 단계; 항체의 선택은, 모든 항체는 ELISA 형식으로 작동하기 때문이다.

αS ^{D 수준의} 일부 변화는 다른 생쥐 사이 그럼에도 불구하고 분명했다. 이러한 결과는 시험의 사크 의해서만 아픈 M83 마우스에서 검출 전형적인 αS ^{D 패턴의} 웨스턴 블롯 검출 동등Ser129에 대.......

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB509	Abcam	ab27766	Detection antibody 1/2,000
AS11	Produced at Anses		Detection antibody 1/1,000
4D6	Abcam	ab1903	Detection antibody 1/2,000
PSer129	Abcam	ab59264	Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y	Abcam	ab51253	Detection antibody 1/1,000
syn514	Abcam	ab24717	Detection antibody 1/500
clone 42	BD Biosciences	610787	Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5	Provided by Dr. Anderson		Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody	Millipore	AB5038P	Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate	Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate	Dianova	115-035-164
HS buffer			pH 7.5에서 조정하고 4 °C에서 보관
Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS			pH 7.5에서 조정
Na2HPO4 1 mM	Euromedex	1309
KH2PO4 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl  137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20	Euromedex	2001-C
BSA	Sigma	A7906
DTT 1 mM	Sigma	43815	100 mM 스톡 용액, 독성
1% phosphatase cocktail	Pierce	78428
1% protease inhibitor cocktail	Roche	04 693 132 001	50배 농축
Microplate MaxiSorpTM	Thermo Scientific	442404
탐폰 카보네이트 50 mM pH 9.6
Na2CO3, 10H2O	Sigma	71360	2.86 g/L
NaHCO3	Merk	6329	3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer	Pierce	E6423H	10배 농축
TMB	Sigma	T0440	ELISA에 사용
TMB	Analytik Jena AG	847-0104200302	에피토프 매핑에 사용
HCl 1 N	Chimie plus	40030
Ribolyser	Thermo	Fast prep FP120	이 단계에서 얼음위에 보관
Grinding tubes	Biorad	355-1197
Plate washer	Tecan	Columbus Pro
Plate reader	Biorad	Model 680
Low power magnifier	VWR	630-1062	8X 배율
Forceps Dumont#7	WPI	14097	해부 단계에 사용
Transfer pipette 1ml Samso	Samso	043231
1.5 ml tubes	Dutscher	033290

```