방법 논문

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

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⸱

DOI:

10.3791/52756

⸱

2015년 6월 25일

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

교신 저자: Gilbert Weidinger <gilbert.weidinger@uni-ulm.de>

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

초록

제브라피쉬는 척추동물의 발달, 생리학, 질병, 조직 재생을 연구하는 데 매우 중요한 모델 유기체가 되었습니다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 유전자 발현 또는 신호 경로에 대한 유도 가능한 조직 특이적 조작을 허용하는 실험 도구가 필요합니다. 따라서 당사와 다른 사람들은 최근 TetON 시스템을 제브라피쉬에 사용하기 위해 조정했습니다. TetON 시스템은 시간적, 공간적으로 제어되는 유전자 발현을 촉진하며, 최근에는 이 도구를 사용하여 제브라피시 꼬리 지느러미 재생 중 Wnt/베타-카테닌 신호의 조직 특이적 기능을 조사하고 있습니다. 여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 유도 가능한 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 여기에는 안정적인 형질전환 TetActivator 및 TetResponder 라인의 생성, 전이유전자 유도 및 핀 재생에서 조직 특이적 유전자 발현 검증 기술이 포함됩니다. 따라서 이 프로토콜은 제브라피시에서 기능적인 TetON 시스템을 설정하고 후속 사용, 특히 지느러미 재생을 연구하기 위한 청사진 역할을 합니다.

서론

제브라 피쉬의 개발, 생리학, 질병, 및 재생의 여러 측면을 연구하는 기초가 튼튼한 척추 동물 모델 생물이다. 유전자 발현 또는 신호 전달 경로의 유도, 조직 특이 적 조작 후 배아 생물학적 과정, 실험 도구에 대한 모델로 제브라 피쉬의 성장 채택으로 점점 더 중요 해지고있다. 특히, 성인 제브라 피쉬의 기관 및 부속 재생에 대한 연구는 이러한 재생 과정에서 신호 전달 경로의 시공간 요구 사항의 해부 도구의 부족으로 고통을.

현재, 세가지 다른 시스템 조건, 조직 - 특이 성인 지브라 피쉬의 장기를 재생 유전자 발현 달성하는데 사용되어왔다 : Cre 호텔-LOX 시스템 트랜스포존 매개 체세포 형질 전환을 사용하여 열 - 충격 유도 유전자의 모자이크 식 및 코스닥 시스템 1 -3. 코스닥은 테트라 사이클린 계속의 변형을 말한다발현은 테트라 사이클린 항생 물질 또는 유도체, 예 독시사이클린의 존재 하에서 활성화 롤 전사 활성 시스템. 그것은 지금까지 성인 물고기에 사용 된 바와 같이 Cre 호텔-LOX 시스템은, 발현 공간적으로 조직 특이 적 조절 요소에 의해 제한되는 타목시펜 제어 Cre 호텔 재조합 효소 (CreERT2)에 의존한다. STOP 카세트의 CRE 구동 제거는 모든 세포 유형 1 활성화되어야 프로모터에 의해 구동되는 목적 유전자의 발현을 촉진한다. mosaically 표현 체세포 유전자의 트랜스포존 매개 창조 개별 세포 계통의 유도 유전자 발현 시스템을 제공한다. 전형적 재생 기관 (2)의 분리 된 세포 계통의 유전자를 운반하는 키메라 개인에 열 충격 프로모터 결과의 전사 제어하에 관심있는 유전자를 운반하는 트랜스포존과 TOL2 지브라 피쉬의 수정란 사출. 두 시스템은 조건부 조직 SPE를 허용하는 동안cific 유전자 발현은 LOX-Cre 호텔 시스템은 가역적없고, 트랜스포존 기반 클론 표지를 사용하는 전략은 스토캐스틱 자연에서 겪고있다. 따라서, 우리 등 최근 시간적 및 가산 및 가역 가변 3-5 인 공간적 조절 유전자 발현 촉진 제브라에 사용하기위한 유전자 코스닥 시스템을 채택 하였다.

여기서 사용 코스닥 시스템은 독시사이클린 (D​​OX) -inducible 전사 활성이 (역방향의 테트라 사이클린 transactivator, irtTA 짧은 TETA 개선) 조직 특이 적 유전자 조절 서열의 제어하에있는 트랜스 제닉 드라이버 라인 (TetActivator)을 포함한다. (; TetRE 구정 응답 요소) (그림 1A) 둘째, 유전자 변형 응답자 라인 테트라 사이클린 연산자의 전사 제어에 관심의 유전자를 품고 (TetResponder)가 필요합니다. 따라서 TetActivator 및 TetResponder 선의 특정 조합의 사용은 조건부 조직 정시 허용유전자 발현의 FIC 조작.

우리는 최근 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미 3 재생 성인에서의 Wnt / 베타 카테닌 신호의 조직 특이 적 기능을 위해 프로브 TETON 시스템을 활용했다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리는 지느러미 재생의 연구에 특히 제브라 피쉬에 Teton 시스템의 설정 및 사용에 대한 작업 흐름을 설명합니다. 이것은 상세한 안정적인 형질 전환 TetActivator과 TetResponder 라인을 생성하는 방법에 대한 지침 및 배아와 성인 제브라 피쉬의 형질 전환 유전자의 유도를위한 프로토콜을 포함한다. 더욱이, 우리는 성인 핀 저온부 지브라 피쉬의 제조를위한 프로토콜을 포함하여 핀 재생성에 조직 특이 적 유전자 발현의 확인을위한 기술을 설명한다. 또한, 우리는 TetResponder 식의 TetActivator 형질 전환 유전자의 설계, 형질 전환 방법의 선택, 및 검출을위한 고려 사항에 대해 설명합니다. 따라서,이 프로토콜의 전반적인 목표는 청사진 역할을하는 것입니다설정해서 기능성 코스닥 시스템 지브라 피쉬의 관심있는 조직에 적용 할 수있는 조건부 조직 특이 적 유전자 발현을 달성하기위한.

우리는 I-SceI 제한 효소 또는 짧은 유전자 조절 서열 사용하여 안정적인 TetActivator 라인의 TOL2 매개 세대를 허용 TetActivator 벡터 만든 (증강 조각, WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스없이 1247;. 그림 1B). 이 구조는 단순 포진 바이러스 VP16의 전이 활성화 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층)]와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 TetActivator 카세트가 포함되어 있습니다. 이 공동 발현 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터의 형광 단으로 AmCyan 때문에 TetActivator (TETA)의 발현을 용이하게 모니터링 할 수있다; 1 비율 5,6 : P2A 펩타이드는 1에서 분리 된 단백질과 같은 TETA과 AmCyan의 생산을 초래할한다 리보솜 건너 뛰기를, 중재. 구조는 또한 T의 'poylinker 5 포함etActivator 카세트는 종래의 클로닝 방법을 사용하여 관심의 유전자 조절 서열의 삽입을 용이하게한다.

(큰 게놈 영역을 포함하는 박테리아 인공 염색체로 재조합 될 수있다 (BAC), 또한, 우리는 전술 TetActivator 카세트 플러스 카나마이신 선택 카세트 (도 1C. WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스 없음 1180)로 이루어진 구조를 작성한 일반적으로 발현 패턴 트랜스 의해 모방 함) 유전자의 개시 코돈으로. 두 구조는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다.

프로토콜

형질 전환 TetActivator 물고기 라인의 1 세대

  1. TetActivator 구조의 생성
    1. 벡터 #에서 TetActivator 카세트의이자 상류의 복제 조절 서열은 1247 표준 기술을 사용하여. 대안 적으로, TetActivator 카세트 (벡터 # 1180)이 표적 유전자의 제 엑손에 삽입 된 BAC를 생성하는 재조합 기술을 사용하고 TOL2은 반복을 참조 상세한 recombineering 프로토콜 (BAC 백본 내로 도입 반전 곳 7, 8).
    2. 독소가없는 플라스미드 DNA 또는 시판 키트를 사용하여 BAC DNA의 준비를 준비합니다.
  2. 형질 전환 TetActivator 물고기 라인의 세대
    1. 표준 절차 9 항에 TetActivator 구조의 미세 주입을 수행합니다.
      1. TOL2의 TRA에 대한 출장 센스 RNA 코딩과 함께 한 세포 단계의 배아로 250 페이지의 혈중 알코올 농도의 DNA에 25-50 플라스미드 DNA의 페이지 또는 주사트랜스포존 매개 형질 전환에 대한, 또는 I-SceI 제한 효소 매개 형질 전환을위한 I-SceI 제한 효소 단백질 nsposase.
        참고 : 형질 전환 방법의 선택에 고려 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
        참고 : DNA가 세포질로 전달되지 않을 때 형질 전환의 효율이 저하 될 수 있기 때문에, 세포질이 아닌 노른자에 바람직 주입.
    2. 성인에 주입 G0 배아를 올립니다. 선택적으로, 화면 G0의 AmCyan 형광 배아 우선적으로 원하는 발현 패턴을 보여주는 배아를 성장. 이 TOL2 매개 형질 전환에 대한, 특히 세균 라인 전송의 속도를 증가시킬 수 있습니다.
    3. (예를 그림 1D에 표시됩니다) 형광 실체 현미경을 사용하여 F1 배아 또는 유충의 예상 발현 패턴에 야생 형 물고기와 AmCyan 형광의 모습 개별 G0 물고기를 교잡에 의해 성공적으로 세균 라인 통합을 평가합니다.
    4. 형광 양성 올립니다F1 배아 성인기 안정 F2를 형질 전환 물고기를 얻기 위해 야생 형 물고기를 짝짓기.
    5. 각각의 라인이 발현 수준, 발현 양상, TetResponder 라인, leakiness을 유도 할 수있는 능력, 그리고 침묵에 그들의 감수성에 다를 수 있기 때문에, 올리고 다른 G0 설립자 물고기에서 유래 적어도 3 개의 서브 라인의 특징.
      참고 : 견고 배아에서 발현되는 많은 유전자는 부분적으로 또는 완전히 말기 유충 또는 성인 물고기에 침묵이다. 라인은 성인 생선에 이용되는 것을 의미하는 경우 따라서, 성인기 그들의 TetActivator 발현과 기능을위한 여러 독립적 인 선을 특성화.
      참고 : 우리는 표 1에 나열되어 모두 배아와 성인 물고기의 TetActivator의 조직 특이 적 발현을위한 TetActivator 라인의 패널을 생성 한이 라인 정보는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다..

형질 전환 (T)의 2 세대etResponder 물고기 라인

참고 : 우리는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다 I-SceI 제한 효소 또는 안정 TetResponder 라인의 TOL2 매개 세대, 허용 TetResponder 구조 (.도 1E WEIDINGER 실험실 플라스미드 데이터베이스없이 1444)를 생성합니다. 이 구조는 관심의 유전자와 YFP 파생 YPet 코딩 서열의 코딩 서열 (CDS)의 삽입을 용이하게 폴리 링커 지역에 따라 테트라 사이클린 연산자가 포함되어 있습니다. 따라서, 구조체는 YPet하여 원하는 단백질의 C 말단 융합 TETA - 매개 발현을 위해 설계된다. 태그 된 융합 단백질의 발현을 방지해야하는 경우, P2A T2A 펩티드 또는 폴리펩티드는 별도 6,10 YPet로서 관심의 단백질의 공동 발현을 용이하게 CDS 관심의 유전자와 함께 도입 될 수있다.

  1. TetResponder 구조의 생성
    1. 테트라 사이클린 연산자의 '관심 3의 유전자의 클론 CDS5 YPet CD를 '표준 절차에 따라. 종결 코돈이자 CDS의 유전자에서 제거되었는지 확인합니다.
    2. 시판 키트를 사용하여 독소가없는 플라스미드 DNA의 준비를 준비합니다.
  2. 형질 전환 TetResponder 물고기 라인의 세대
    1. TetResponder의 미세 주입이 표준 절차 (9)에 따라 구성 수행합니다.
      1. 트랜스포존 매개 형질 전환 또는 meganuclease-를 이용한 형질 전환을위한 I-SceI 제한 효소 효소 TOL2의 트랜스에 대한 출장 센스 RNA 코딩과 함께 한 세포 단계의 배아의 세포질에 플라스미드 DNA의 25-50 페이지를 주입한다.
        참고 : 형질 전환 방법의 선택에 고려 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
        참고 : DNA가 세포질로 전달되지 않을 때 형질 전환의 효율이 저하 될 수 있기 때문에, 세포질이 아닌 노른자에 바람직 주입.
    2. 에 주입 G0 배아를 올립니다dulthood.
    3. F1 배아 또는 F1 유충의 독시 싸이클린 처리 한 다음 이전에 설정된 TetActivator 라인과 개별 G0 물고기 짝짓기에 의해 형질 전환 유전자를 성공적으로 세균 라인 통합과하고 유도를 평가합니다.
      참고 : 일반적으로 우리는 유비퀴틴 프로모터 중심 TetActivator 줄을 사용 (유비퀴틴 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm2, 짧은 유비퀴틴 : TETA AmCyan 3)이 라인은 배아와 성인에서 상당히 유비쿼터스 발현을 드라이브로, 기능 TetResponder 캐리어을 선별하는 따라서 물고기와 잘 관심의 모든 조직에서 TetResponder를하고 유도를 평가하기에 적합합니다. 이 줄은 요청에 따라 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다.
    4. E3 배아 매체를 포함하는 별도의 10cm 배양 접시에 각 클러치의 배아를 수집 (재료 표 참조) 28.5 ° C에서 배양 접시.
    5. 개별 번호가 탱크에 배아 준 장소 G0 물고기 (사육 상자, 재료 표 참조) 배아 화면 때까지에디션. 이 유전자의 세균 라인 전송을 보여 G0 물고기의 복구를 할 수 있습니다.
    6. 배아의 절반이 TetActivator 전이 유전자 (경우에 이형 TetActivator 캐리어 TetResponder 설립자 물고기에 교차되었다)을 수행 할 것으로 예상되는 경우, 적절한 발달 단계에 AmCyan 형광의 모양으로 TetActivator 전이 유전자를 포함하는 배아를 선택합니다.
    7. 2.3 절에 설명 된대로 독시 싸이클린 (D​​OX)와 배아를 처리하여 TetActivator의 전사 활성을 유도한다.
    8. YPet 형광의 출현에 대한 화면 F1 배아. 즉, 클러치의 배아가 예상되는 표현 영역 및 개별 배아 사이의 작은 변화에서 작은 염색체를 표시해야하고, 균일 한 YPet 식을 생산 라인 (G0 물고기)를 선호한다. 대표적인 예 그림 1 층과 그림 1G에서 화살촉을 참조하십시오.
    9. 에서 확인 된 유도 TetResponder 전이 유전자를 전송 메이트 G0 물고기야생 형 물고기와 2.2.8 단계 및 성인에 모든 F1 배아를 올립니다.
    10. 성인 F1의 유전자 변형 물고기 중 하나 PCR 기반의 유전자형에 의해를 확인 (섹션을 참조하거나 F2 배아 및 YPet 형광 (2.5 참조)의 출현의 DOX 처리 다음에 TetActivator 라인에 개별 F1 물고기를 건너.
    11. 하고 유도 개별 라인 다를 수 있기 때문에, 구축 및 다른 G0 설립자 물고기에서 유래 적어도 3 가지 TetResponder의 서브 라인의 특징. 특히 달성 발현 수준인지 응답자는 다를 수있는 모든 유형의 세포에서 활성화 될 수있다. 또한, 침묵에 감수성 라인 사이에 다릅니다. 마지막으로, 어떤 경우에는 독시사이클린이 없을 TetActivator 라인과 함께 생성 된 누설 발현이 발달 결함이나 독성을 유발하는 것으로 예상되는 경우, 특히 관심의 단백질의 적절한 발현을 매개하는 라인을 선택하는 것이 바람직 할 수도있다.
      참고 : 구정배아에서 견고하게 유도되어 응답자 라인은 부분적으로 또는 완전히 말기 유충 또는 성인 물고기에 침묵 할 수있다. 라인이 성인 물고기에 사용되는 의미한다면, 여러 독립적 인 줄은 성인하고 유도를 위해 특성화해야한다. 관심있는 유전자의 유도 발전과 호환되는 경우, 태아에 GOI 발현을 유도하고, 선택하고, 가장 강력하고 최소한 모자이크를 보여주는 만 개인을 높이기 위해, 이중 유전자 변형 배아 (TetActivator의 X의 TetResponder)를 작성하는 데 유용합니다 입증되었습니다 유도.
    12. )을 유지하고 2.5 절에 설명 된대로 설립 TetResponder 라인, 유전자형 성인 물고기를 전파합니다.
  3. 배아의 독시사이클린 처리
    1. 2,000x 독시 싸이클린 (D​​OX) 주식을 준비합니다. 50 밀리그램 / ㎖ (97 mM)을 농도를 달성하기 위해 50 %의 EtOH에 DOX 해결. 스토어 DOX 주식은 -20 ° C에서 빛으로부터 보호.
    2. 배아에서 E3 매체의 대부분을 가만히 따르다로 대체25 μg의 / ㎖ DOX의 최종 농도 DOX 함유 E3 배아 매체 (50 ㎖ E3 당 2,000x DOX 스톡 2.5 μL). Dechorionation가 필요하지 않습니다.
    3. YPet 형광의 등장으로 관심있는 태그 유전자의 발현을 평가하기 전에 6 시간의 최소 28.5 ° C까지 배아를 돌려줍니다.
    4. 만 EtOH를 용매로 배아를 처리하여 TetActivator / TetResponder 조합의 leakiness을 평가합니다.
      참고 : TetResponder의 mRNA를 검출하는 현장 하이브리드 (ISH) 또는 RT-PCR에서 관심있는 태그 유전자의 형광보다 leakiness의 민감한 조치로 사용할 수 있습니다. leakiness의 범위는 특정 TetActivator / TetResponder 라인의 조합에 따라 달라집니다 그리고 그것은 조직 및 발달 단계 사이도 다를 수 있습니다.
  4. 성인 제브라 피쉬의 마취
    1. 10cm 직경 페트리 접시 또는 포함 된 생선 시스템 물 1 ㎎ / ㎖ Tricaine (에틸 3- 아미노 벤조 에이트 methanesu 가득 작은 비커를 준비lfonate, MS-222).
    2. 컨테이너 포함 마취에 물고기를 전송하고 완전한 평형의 손실 (물고기가 옆에있다), 아니 운동과 11을 터치에 대한 응답으로 표시된 바와 같이이 마취의 레벨 4에 도달 할 때까지 기다립니다.
    3. 조심스럽게 핀셋이나 유리 슬라이드 위에 숟가락, 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑, 또는 아가로 오스 코팅 된 배양 접시를 사용하여 물고기를 전송하고 지느러미 절단 또는 이미징을 수행 (3.2 절 참조).
    4. 선어 시스템 물의 대량 함유 용기에 물고기 돌아가서 모니터. 아가미의 움직임은 3 분 이내에 다시 시작되지 않는 경우, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 아가미를 통해 물을 불어 도움이됩니다.
  5. TetResponder 물고기의 PCR 기반의 유전자형
    1. 12 핀 꼬리 부분 절단을 수행합니다. 개인 번호 탱크에 물고기를 놓고 (사육 상자, 재료 표 참조). 이 성공적으로 유전자형 다음 형질 전환 어류의 복구 할 수 있습니다.
    2. 트라96 웰 PCR 플레이트 게놈 DNA (13)의 분리를 위해 20 μL의 DNase의없는 물이 자동으로 입력의 개별 우물에 nsfer 지느러미 조직.
      1. 각 120 μL 1 M NaOH를 잘 추가하고 열 순환기를 사용하여 95 ℃에서 20 분 동안 샘플을 품어.
      2. 4 ° C에 침착 샘플들은, 각 웰에 1 M Tris-HCl (pH8.0)을 14 μL를 추가하고, 간단히 와동 샘플. 16,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기 샘플은 세포 파편 펠렛합니다. 필요할 때까지 4 ℃에서 게놈 DNA를 저장합니다.
    3. 디자인 프라이머는 특히 TetResponder 전이 유전자의 단편을 증폭한다. 표준 PCR 반응에 고립 된 DNA의 2 μL를 사용하여 아가 로스 겔에 PCR 제품을 분석 할 수 있습니다.

성인 제너 레이팅 Zebrafish의 꼬리 지느러미에 형질 전환 유전자 발현 3. 조직 별 유도

  1. TetActivator의 설립; 이중 형질 전환 어류 TetResponder
    1. TetResponder CARRI와 TetActivator 캐리어 메이트ERS.
    2. TetActivator 카세트를 운전 규제 요소가 활성화 될 때 발달 단계에서 TetActivator 전이 유전자를 운반하는 배아를 선택합니다. 형질 전환 배아 쉽게 스테레오 형광 현미경을 이용하여 형광 AmCyan의 외관에 의해 식별 될 수있다.
      참고 : TetActivator 전이 유전자 양성 물고기 대안 예를 들어 마취 된 물고기의 이미지에 의해 성인기 동안 식별 될 수있다. 꼬리 지느러미의 절단과 중생의 AmCyan 형광의 출현 다음과 같습니다.
    3. 성인에 선택된 배아를 올립니다.
    4. 관심의 조직에 TetResponder의 발현을 유도 할 수있는 능력에 의해 (바람직하게는) PCR 기반의 유전자형 또는으로 (TetActivator 외에 TetResponder을 수행 물고기) 더블 형질 전환 성인 물고기를 식별합니다. 재생 꼬리 지느러미에 TetResponder 유도 및 검출을위한 프로토콜은 2.3 절과 4 절에 설명되어 있습니다.
      주 : 과도 TetResponder 표현식이 호환되는 경우또한 배아 또는 애벌레 개발,이 전술 한 바와 같이 배아 개발하는 동안 DOX 처리 다음 TetActivator 및 TetResponder 유전자를 운반하는 이중 유전자 변형 배아를 식별하는 데 유용하다 (2.3 절, 그림 1H). 더블 긍정적 인 배아는 AmCyan과 YPet 형광 표시됩니다. 성인에 긍정적 인 배아를 올립니다.
  2. 재생 지느러미에 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미의 절단 및 유전자 발현의 유도
    1. 마취 물고기의 꼬리 지느러미 부분 절단을 수행 12 (2.4 절 참조). DOX와 중 즉시 물고기를 치료하거나 물고기 하우징 시스템에 반환.
    2. 사육 상자를 준비합니다 (그림 2A를, 재료 표 참조) (생선 시스템 물 1 L에 2,000x 50 ㎎ / ㎖ 주식의 500 μl를 추가) 25 μg의 / ㎖ DOX를 포함하는 물고기 시스템 1 L의 물을 가득합니다.
      참고 : 유전자 발현 유도는 절단은 가능 직후후 절단 (3 DPA) 삼일에서 유도가 회생 성장하는 동안 유전자 발현이나 기능을 평가하기 위해 사용되어야하는 동안 재생하는 동안 초기 이벤트에 대한 효과 sessment.
    3. 물고기가 벗어날 수 있도록 뚜껑 (그림 2A)와 사육 상자 닫기 상자에 10 이전에 절단, 이중 형질 전환 어류까지 전송합니다.
    4. 스트레스를 줄이기 위해 어둠에 번식 상자를 놓습니다. 우리는 일반적으로 일정한 농도 및 온도를 보장하기 위해 28.5 ° C의 공기 인큐베이터에 상자를 배치합니다.
    5. EtOH로 전용 (1L 물고기 시스템 물 250 μL)와 음성 대조군 이중 형질 전환 생선을 취급합니다.
      참고 : 우리가 지느러미 재생 여기에 사용되는 DOX 복용량의 부작용을 관찰 적이 있지만 단일 유전자 변형 또는 DOX로 치료 야생 형 물고기, 추가 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
    6. 젖은 아가로 오스 코팅 배양에 2.4 절과 핀셋이나 숟가락을 사용하여 전송 물고기에 설명 된대로 물고기를 마취 요리. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 꼬리 지느러미를 확산.
    7. 형광 스테레오 현미경 (그림 2B)를 사용하여 중생 내 YPet의 모양에 대한 화면 물고기.
      주 : 일반적 TetResponder 구동 형광 견고 DOX 처리 6 시간 다음 관찰 할 수있다. 그러나, 우리는 생성 된 각각의 라인 TetResponder 식의 역학 특성을하는 것이 좋습니다.
    8. TetResponder 유전자 유도를 종료하거나 치료를 계속 물고기 하우징 시스템에 물고기를 돌려줍니다.
      참고 : 치료 용> 24 시간 (장기 치료)는 물을 교환하고 철저하게 매일 사육 상자를 청소하는 것이 필수적이다.
    9. 장기 치료, 사료 물고기 먹이 후 사육 상자에 반환하기 전에 신선한 생선 시스템 물을 깨끗한 용기에 물고기를 전송하여 2-3 일마다시.

핀 다시 생성에 TetResponder 발현 4. 특성

t "> 주 :. 우리가 일반적으로 3 DPA에서 저온부의 형광 이미징을 사용하여 재생 꼬리 지느러미에 조직 특이 적 유전자 발현을 확인 재생성의 다른 조직 구획 형성하고 명확 조직 섹션을 식별 할 수있는이 시점에서, 및 냉동 절편은 재생 이후 단계에서보다 간단하다. 그림 (c)는 중생에 구별 될 수있다 조직의 도메인을 묘사하고 이러한 도메인에 대한 몇 가지 분자 마커를 보여줍니다. 다음 프로토콜은 직접 영상 또는 면역 염색에 대한 종 방향 또는 횡 방향 저온부의 준비에 대해 설명합니다 .

  1. 성인 꼬리 지느러미의 냉동 절편
    1. 누구의 꼬리 지느러미 3.2 절에 설명 된대로 DOX 3 DPA 때까지 DPA에서 절단 된 물고기를 치료
    2. 2.4 절에 설명 된대로 물고기를 마취
    3. 부드럽게 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 물고기를 전송하는 숟가락이나 핀셋을 사용합니다.
    4. 4-5 뼈 세그먼트에서 핀 중생을 다시 절단초기 절단 평면의 근위은 메스를 사용하고 신선한 생선 시스템 물에 물고기를 반환합니다.
    5. 미세 핀셋을 이용하여 (재료 표 참조 PBS)를 조심스럽게 전사 1X 인산 완충 생리 식염수에 파라 포름 알데히드 (PFA) (/ V W) 4 %를 함유하는 페트리 접시 작은 (예를 들면, 35mm)으로 재생한다. 중생하지만 조직의 밑둥 부분을 만지지 마십시오.
    6. 배양 접시 바닥에 평평하게 조직을 넣고 4 ℃에서 O / N을 고정한다.
    7. 워시는 뼈 매트릭스를 석회하는 O / N 4 ° C에서 0.5 M EDTA-PBS (PH 7.5)에서 다시 생성 1X PBS 0.1 % 트윈 (PBT)가 PFA를 제거하고 부화 포함 두 번 다시 생성합니다.
    8. 10 % 자당 PBS, 20 % 자당 PBS 30 % 자당 PBS 30 %에서 RT에서 재생시킵니다 부화 자당 PBS : 1에서 조직 동결 배지 : 1의 비율로 30 분마다 (TFM 재료 표 참조). 그 후, 조직 동결 매체> 2 시간 동안 4 ℃에서 핀을 품어.
    9. 현미경 슬라이드에 cryomolds를 놓고 작성조직 동결 배지 m​​. 기포를 도입하는 피.
    10. 전송 지느러미 재생시킵니다 (그림 2D)의 종 방향 또는 횡 방향 섹션을 얻기 위해 적절하게 cryomolds과 동양의 조직으로 다시 생성합니다. 그 중생을 확인 절편을 용이하게하는 직선이다.
    11. 전송 냉동 과정 (그림 2D)를 시작하기 위해 드라이 아이스의 침대에 배치 된 금속 선반 위에 현미경 슬라이드와 함께 cryomolds.
    12. 조직 동결 매체가 고체가되면, 벤치에 cryomold 장소와 매체를 동결 조직이 플라스틱 중간 인터페이스에서 해동하도록 몇 분 동안 실온에서 앉아 보자.
    13. cryomold에서 냉동 블록을 밀어 펜 또는 이와 유사한을 사용합니다. 조직 절편 때까지 -80 ° C에서 상자에 보관 cryoblocks.
    14. 크라이 마이크로톰을 사용하여 10 ~ 14 μm의 두께 저온부를 준비하고 접착 현미경 슬라이드에 섹션 (재료 표 참조) 수집합니다. NE 때까지 -20 ℃에서 보관 슬라이드eded.
  2. YPet 형광 기반으로 핀 섹션에 TetResponder 발현의 특성
    1. PBT에 RT에서 두 세척하고 PBS에서 세척 한, 5 분마다 다음 현미경 슬라이드에 부착을 향상시키기 위해 -20 ° C로 냉각하고 100 % MeOH로 30 분 동안 핀부 치료.
    2. 두 세척 10 분 PBS의 각 다음 : PBS에서 4 10 분 ', 6 diamidino-2-phenylinodole (DAPI) (5,000 일) 동안 배양 섹션으로 핵을 시각화.
    3. 75 % 글리세롤-PBS 마운트 부분 또는 시판 antifade 마운트, 그리고 커버 슬라이드 커버.
    4. 이미지 YPet 및 공 촛점 또는 넓은 필드 형광 현미경 AmCyan 형광 (그림 1E).
      주 : 행할 수 모호 (YPet 반응 아니지만 AmCyan) 항 GFP 항체와 함께 세포 형 특이 항원에 대한 항체와 YPet, 면역 형광 또는 면역 발현 세포 유형의 식별을 용이. 대안 적으로, 약한 YPet 발현의 검출을 용이하게하기 위해, RNA YPet 대해 계내 혼성화에 RNA가 하나에서 수행 될 수있는 핀 또는 핀 파라핀 섹션 전체 마운트.

결과

조직 특이 유도 유전자 발현, 유전자 변형 TetActivator 및 TetResponder 라인을위한 기능 TETON 시스템을 구축하기 위해 생성 (그림 1A) 할 필요가있다. 초기 제브라 피쉬 배아 및 후속 세균 라인 통합으로 구축 또는 TetResponder (그림 1E) -이 TetActivator (C 그림 1B)를 마이크로 인젝션하여 수행됩니다. 기능성 TetActivator 구조물 중 하나, 또는 관심 유전자 (도 1C)의 조절 요소를 포함하는 BAC에 TetActivator 카세트 재결합하여 TetActivator 카세트 (도 1B)의 상류 단 조절 서열 (인핸서 요소)의 클로닝에 의해 생성 될 수있다. TetActivator 구조의 생식 계열 통합은 개인이 예상 발현 양상 (그림 1D)에서 G0 물고기와 F1 배아에서 AmCyan 형광의 모양을 주입 교잡에 의해 평가 될 수있다. 생식선 INTEG, DOX와 YFP / YPet 형광 (그림 1 층)의 외관 처리하여 : 배급과 TetResponder 전이 유전자의 기능은 (TETA AmCyan 유비퀴틴 여기) 설립 TetActivator 물고기 개별 G0 주입 물고기를 건너에 의해 평가 될 수있다. 강력하고 균일 한 YFP / YPet 식을 보여주는 물고기는 안정적인 TetResponder 라인 (그림 1G)를 설정하는 것이 바람직합니다. 설립 안정 TetActivator 및 TetResponder 물고기 라인, 특정 TetActivator / TetResponder 조합을 갖는 교차에 의해 발생 될 수 있습니다. TetActiator과 TetResponder 유전자의 운반은 TetActivator이 활성화 발달 단계 (그림 1H)에서 YFP / Ypet의 DOX 처리 종료 출현 다음 배 발생시 식별 할 수 있습니다. 또한, 이중 형질 전환 어류는 DOX 처리 및 재생 꼬리 지느러미에 TetResponder 전이 유전자 유도 (- B 그림 2A) 다음 식별 할 수 있습니다.

< P 클래스 = "jove_content은"> 우리는 일상적으로 재생 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미의 유도, 조직 특이 적 유전자 발현을 달성하기 위해이 시스템을 사용합니다. 중생의 다른 조직 구획이 명확하게이 시간 점 (그림 2C)에서 조직 섹션에 식별 할 수 있기 때문에 우리는 3 DPA 지느러미 재생시킵니다의 저온부의 형광 이미징에 의해 조직 특이 TetResponder의 유전자 발현을 확인합니다. 세로 또는 가로 핀 재생 부분은 조직을 cryoprotecting과 지느러미가 적절하게 (그림 2D)를 재생 삽입 후 냉동 절편에 의해 얻어진다. 단면 처리 후, TetResponder 전이 유전자 발현 (Ypet / YFP 형광)는 형광 또는 공 초점 현미경 (도 2e)를 사용하여 묘화 될 수있다. 말단 아체 (화살촉)과 표피 (화살표) 식없는 동안 her4.3 프로모터 중심 TetActivator이, 근위 내측 아체에서 TetResponder 발현을 유도합니다.

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그림 1 : 유전자 변형 TetActivator과 TetResponder 라인의 세대. (A) 만화 코스닥 시스템을 이용한 조직 - 특이 적 유전자 발현 유도를위한 전략을 도시. (B) 형질 전환 TetActivator는 (WEIDINGER 실험실 플라스미드 데이터베이스 NO. 1247)를 구축합니다. 5 'TetActivator irtTAM2 (3 층)의 폴리 링커는 C를 용이하게관심의 조절 서열의 loning. AmCyan 코딩 서열은 P2A '자기 클 리빙'펩타이드를 통해 TetActivator에서 분리된다. 카세트는, TOL2의 트랜스포존 반전 반복에 의해 형벌 된 SV40 폴리아 데 닐화 신호를 포함하고 단일 I-SceI 제한 효소 meganuclease 인식 부위가 포함되어 있습니다. BAC의 recombineering에 대한 (C) TetActivator 카세트 (WEIDINGER 실험실 플라스미드 데이터베이스 NO. 1180). 카세트 GB3 원핵 프로모터에 의해 구동되는 선택 용 카나마이신 유전자를 포함한다. 카나마이신 내성 유전자를 플 랭킹 FRT 부위는 BAC에 성공적인 통합 다음의 FLP 재조합 효소 - 매개 된 제거를 허용한다. (D) her4.3를 전송 G0 설립자 물고기의 식별 : TETA AmCyan가 세균 라인을 통해 구축합니다. 사업자는 일부 F1 배아 (화살촉)에서 AmCyan 형광의 출현을 통해 확인된다. (E) 형질 전환 TetResponder는 (WEIDINGER 실험실 플라스미드 데이터베이스 NO. 1444)를 구축합니다.이 구축 최적화 구정 응답 요소의 제어하에 폴리 링커 및 YPet CDS로 구성 (TetRE 꽉 클론 테크)와 SV40 폴리아 데 닐화 신호에 의해 종료되었습니다. 그것은 TOL2의 트랜스포존 반전 반복에 의해 측면과 단일 I-SceI 제한 효소 meganuclease 인식 사이트를 포함합니다. 기능 TetResponder TetRE를 전송 G0 설립자 물고기 (F) 식별 : Axin1-YFP가 생식 세포를 통해 구축합니다. 6 시간 (화살촉)에 대한 DOX 처리 다음 YFP 형광의 유도 : 캐리어 설립 TetActivator의 (TETA AmCyan 여기 유비퀴틴) 라인과 교차에 의해 식별된다. (G)는 DOX 치료의 12 시간 총 후 (F)에 도시 ofembryos를 닫습니다. YFP 형광 상당히 유비쿼터스 유도를합니다. 및 TetResponder (TetRE : Axin1-YFP) 유전자 (화살촉) : TetActivator (TETA AmCyan her4.3)를 운반하는 이중 유전자 변형 배아 (H) 식별. 우리 배아6 시간 동안 DOX 치료를 다시. (- H) 스케일 바 : 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 : 재생 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미의 조직 특이 적 유전자 발현에 대한 TETON 시스템의 사용. 성인 제브라 피쉬의 DOX의 치료에 사용 () 사육 상자. TetRE (나) 유도 : her4.3에 의해 Axin1-YFP TetResponder 트랜스 : TETA AmCyan TetActivator재생 꼬리 지느러미에 DOX 치료 12 시간을 다음과 같습니다. EtOH로 처리 제어 물고기 YFP 형광의 부재를합니다. (C) 만화 종단면도 3에서 DPA 핀 재생성 내에있는 조직 구획의 일부를 묘사. 냉동 절편을 위해 (D) 샘플 준비. 핀 재생시킵니다 조직 동결 매체 (TFM)에 배치 중생의 종 방향 또는 횡 방향 중 어느 부분을 얻기 위해 적절하게 지향 cryomolds을, - 채워진 및 TFM가 응고 될 때까지 드라이 아이스의 꼭대기에 앉아 금속 랙에 전송됩니다. 단면 평면은 빨간색으로 표시됩니다. 요약 : DIST : 원위부, PROX : 인접, 벤트 : 복부, : 지느러미를 DORS. (B)에 도시 된 핀으로부터 유도 핀 선 재생성의 종단면 YFP 형광 (E) 공 촛점 이미지. TETA AmCyan TetActivator 라인은 근위 - 중간 아체에서 구체적으로 YFP 유도 드라이브 : her4.3합니다. YFP형광 상처 표피 (화살표) 및 중간 엽 (화살촉) (BC) 눈금 막대의 선단부 가장 도메인을 포함한 구획 다양한 검출되지 : 500㎛ 인; (E) 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

TetActivator 라인 참고 규제 요소 사용 주로 표현
7xTCF-Xla.Siam : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan 게시되지 않은 WEHNER & WEIDINGER, 7xTCF-Xla.Siam의 Wnt 기자 1 이 Wnt 응답 조직
myl7 : irtTAM2 (3 층) -p2a-mCherry 게시되지 않은 하세 & WEIDINGER, myl7 (cmlc2) 2 성숙한 심근
her4.3 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm6 3 her4.3 4 중추 신경계
keratin4 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm5 3 keratin4 5 표피는 성인 지느러미의 기저 층을 제외하고
keratin18 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm4 3 keratin18 6 표피 기저층에 독점적으로 성인 지느러미
SP7 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm3 3 SP7 / OSX (7) (헌신) 조골 세포
유비퀴틴 : irtTAM2 (3 층) -p2a-AmCyan ulm2 3 유비퀴틴 (8) (상당히) 유비쿼터스

표 1. 사용 가능한 형질 전환 TetActivator 라인이 테이블은 형질 전환 TetActiva을 보여줍니다요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수있는 모두 배아와 성인 물고기 TetActivator의 조직 특이 적 발현을위한 토르 라인.

토론

성인 제브라 피쉬가 성공적으로 많은 내부 장기와 부속을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해는 유전자의 기능과 신호 전달 경로의 조직 특이 적 분석이 필요합니다. 이 무렵, 코스닥 시스템은 배아와 성인 제브라 피쉬의 시공간으로 제어 유전자 발현을위한 효율적인 도구를 제공합니다. 이 논문에 기술 된 TETON 시스템 구축 및 방법론이 성공적으로 우리의 실험실 (3)의 최근 연구에 사용되어왔다. 코스닥의 시스템을 구축 할 때 다음과 같은 추가적인 문제가 고려되어야한다 :

TetActivator 유전자 설계 고려 사항

우리는 이전에 보여 그 헤르페스 심플 렉스 바이러스 VP16의 상호 활성화와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 단일 유도 TetActivator 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층), IN 짧은 TETA-M2]을 효율적으로 유도를 부여하지만, 낮은 보여줄 수, 측정 leakiness이기는하지만, 그 독시사이클린 (DOX)의 부재에 활동을 유도하는 배경은 5입니다. 따라서 leakiness 5 제거 글루코 코르티코이드 수용체 (TETA-GBD) 또는 에크 디손 수용체 (ECR-TETA)의 도메인과 융합체를 이용하여 유도 시스템은 이중으로 설명 하였다. 시스템 중으로 유도 변형의 사용을 매우 강력한 독성 단백질 (예를 들어, 종양 유전자)를 표현하는 데 사용되는 경우에 따라서 고려되어야한다. 대안 적으로, 그리고 TetActivator TetResponder 라인을 설정하는 동안 상이한 발현 수준을 생산 라인의 범위를 선택할 수 있으며, 경우에 선택 leakiness 약한 유도제 강하게 유도 선 문제이다. TETA - 강남 또는 TETA-ECR 변형을 포함 TetActivator 구조는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다.

형질 전환 제브라 피쉬 라인의 생성을위한 형질 전환 방법

DNA의 마이크로 인젝션에 의해 달성되는 안정한 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 발생 주입 DNA의 초기 및 후속 배아 생식 세포의 삽입으로 구성한다. 두 가지 방법은 정기적으로 제브라 피쉬의 효율적인 세균 라인 변환 달성하기 위해 사용되었다 : I-SceI 제한 효소 meganuclease (14)를 사용하여 플라스미드 통합 효율 I) 향상 및 II) TOL2의 형질 전환 (15) 트랜스포존 매개. 첫 번째 플라스미드의 선형화를 초래함으로써 숙주 게놈 (16)에 통합 된 플라스미드의 효율성을 증대하는 것으로 생각되는 I-SceI 제한 효소 meganuclease 단백질과 함께 플라스미드 DNA의 동시 주입에 의존한다. 후자는 게놈에 트랜스 매개 통합을위한 TOL2 전이 될를 포함하는 DNA와 함께 TOL2의 트랜스의 RNA의 공동 주입을 필요로한다. TOL2 - 매개 형질 전환 전략은 일반적으로 <더 효율적으로 큰 DNA 구조물을 통합하는 데 사용할 수있는 것으로 생각된다EM> 예를 들어, 세균 인공 염색체 (BAC에) 또는 P1 파생 된 인공 염색체 (PAC에), 그러나 자주 균일 발현 수준과 멘델의 유전 법칙을 보여주는 안정적인 형질 전환 라인의 설립을 할 수있는 여러 유전자 ​​좌위에 여러 개의 단일 복사 삽입 결과 트랜스 시간 소모적. 대조적으로, I-SceI 제한 효소 meganuclease 기술은 일반적으로 덜 효율적이 아닌 권장 BAC의 형질 전환 용이지만, 하나의 게놈 유전자좌 단일 카피 또는 탠덤 배열 유전자 통합을 산출한다. 우리는 성공적으로 기능 TetActivator 또는 TetResponder 라인을 만드는 두 형질 전환 방법을 사용했다.

TetResponder 유전자 발현 분석

성인 지느러미의 조직 특이 TetResponder의 유전자 발현을 감지하기 위해 우리는 일반적으로 저온부의 형광 이미징을 사용합니다. 우리의 경험에 의하면, 형질 전환 유전자에 의해 표현 형광 단백질의 형광은 fixatio에 걸쳐 보존N, 따라서 절차를 저온 절편과 직접적 묘화 될 수있다. 다른 곳에서 설명 된 TetResponder 식의 검출을위한 추가 방법은 다음과 같습니다 섹션에, II) 형광 발색 ISH는 반 GFP 항체를 사용하여, 바람직하게는 여기에 형광 단백질 태그, YPet에 대해, 섹션에 면역 염색 I), 또는 III ) 전체 마운트 ISH는 절편 하였다.

공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 기술 지원을 크리스타 하세, 도리스 웨버와 브리짓 Korte은 감사합니다. WEIDINGER 실험실에서 작업은 도이치 Forschungsgemeinschaft 우리 4223 / 3-1의 보조금 지원, 4223 / 4-1 도이치 먼 대 Kardiologie 오스카 - 라플란드-Stipendium를 통해와 클라우스 - 게오르그 - 싶게 - Sigrid-에 의해 우리 Hengstberger-Forschungsstipendium.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
번식 상자Aqua SchwarzAquaBox 1
복합 형광 현미경(예 : Leica, Zeiss형광 조직 단면을 이미지화하는제조업체에 따라 다릅니다
예: Leica, Zeiss형광 조직 절편제조업체에 따라 다릅니다
. 냉동 절편
제조업체 4', 6-디아미디노-2-페닐이노돌(Dapi)Sigma-AldrichD9542핵
DoxycyclineSigma-AldrichD989150%에서 50%의 50<%
>
로 재고를 준비합니다.PBS의 4%(w/v) 파라포름알데히드, 고정을 위한 pH 7.5
1x 포스팟 완충 식염수(PBS)1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)1x PBS with 0.1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus 접착 현미경 슬라이드Thermo Scientific 조직 절편 수집을 위한1014356190
실체 형광 현미경예: Leica, Zeiss형광 기반 유전형 분석제조업체에 따라 다름
Thermocycler(예: Biorad, Applied BiosystemsPCR 기반 유전형 분석제조업체에 따라 다름
조직 동결 배지(TFM)조직 포Triangel Biomedical SciencesTFM-C 샘플
E3 배아 배지에서 1mg/ml에서 마취
사용을 위한		Tricaine(L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)Sigma-AldrichE10521
)은 데 는 저온 유지 장치 (예 : Leica, Thermo-Scientific)를 이미지화하는 데 는 의 ()은 ) 매닝을 위한 :

참고문헌

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