나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

요약

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

초록

명반과 같은 전통적인 백신 보조제는 차선의 CD8+ T 세포 반응을 유도합니다. 백신 개발의 이러한 주요 과제를 해결하기 위해 다양한 나노입자 시스템이 병원체의 특징을 모방하도록 설계되어 배출되는 림프절에 대한 항원 전달을 개선하고 항원 제시 세포의 항원 흡수를 증가시켜 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응 유도에 최적화된 새로운 백신 제형을 개발했습니다. 이 기사에서는 서브유닛 항원과 면역자극제의 동시 전달을 위한 효과적인 백신 운반체 역할을 하고 강력한 세포독성 CD8+ T 림프구(CTL) 반응을 유도할 수 있는 ICMV(interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles)라고 하는 "병원체 모방" 나노입자 시스템의 합성에 대해 설명합니다. 동적 광 산란 및 제타 전위 분석기를 사용하여 백신 나노 입자의 유체역학적 크기 및 표면 전하를 특성화하는 방법을 설명하고 나노 입자 매개 항원 전달을 배액 림프절로 분석하기 위한 컨포칼 현미경 기반 절차를 제시합니다. 또한, 루시페라아제 발현, 항원 특이적 CD8+ T 세포를 수용 마우스로 이식한 후 나노 입자 백신 접종을 통해 CTL의 확장 및 이동 패턴에 대한 비침습적 조사를 실시간으로 수행하는 새로운 생물 발광 전체 동물 이미징 기술을 보여줍니다. 또한 나노 입자를 접종한 마우스에서 내인성 T 세포 반응의 종적 정량화를 위해 말초 혈액 단핵 세포의 테트라머 염색 및 유세포 분석을 설명합니다.

서론

전통적인 백신 개발은 주로 시행 착오의 실험 방법을 이용 하였다. 그러나, 생체 재료 및 면역 활성화의 분자 결정의 발견의 다양한 배열의 최근 발전과 함께, 그것은 합리적으로 병원균 ^{1, 2에서} 파생 된 생물 물리학 및 생화학 적 단서와 백신 제제를 설계 할 수있게되었습니다. 특히, 다양한 입자 약물 전달 플랫폼은 림프절에 상주 열화 백신 성분을 보호하고, 제시 세포를 항원 (장갑차)에 그들의 공동 전달을 향상 그들이 소단위 항원과 면역 자극 에이전트와 공동으로로드 될 수있는 백신 캐리어로서 검토되어왔다 노드 (림프절)은, 따라서 면역 자극 및 활성화 ^3-5을 극대화. 이전에 강력한 백신 플랫폼,로 입증 된이 보고서에서 우리는, "병원균 모방"나노 입자 시스템의 합성을 설명이라고 interbilayer 가교 다중 층 소포 (ICMVs)강력한 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 전신과 점막 조직 구획 ^6-9 모두에서 체액 성 면역 반응의 도출을위한 M. 특히, ICMVs 접종 실질적으로 종래의 보조제 (예를 들면, 명반과 몬타나 이드) ^(7)와 함께 백신에 비해, 말라리아 항원에 대해 혈청 IgG의 수준이 향상되고 또한 종양 세포 및 쥐 ⁹ 바이러스 챌린지 모델에 대해 강력한 C....

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 기존의 정책과 지침에 따라 사용 및 미시간 대학에서 동물 케어 (UCUCA)에 대학위원회의 승인을 수행 하였다.

1. 합성 및 ICMVs의 특성 단백질 항원과 보조제 분자와 공동로드

1. 믹스 1 : 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N의 1 몰비 - [4- (p의 -maleimidophenyl) 부 티르 아미드] 클로로포름 (MPB), 배치 당 1.26 μmol으로 총 지질 양을 유지하는 (즉, DOPC 500 μg의과 MPB 630 μg의) 20 ㎖의 유리 바이알 (직경 = 28mm, 높이 = 61mm)이다.
2. 원하는 농도에서 지질 용액에 같은 모노 포스 포릴 지질 A (MPLA) 또는 친 유성 염료 (예를 들어, DID)와 같은 지용성 약물을 추가합니다. 철저하게 추가 건조 nitroge으로 정화하여 유기 용매를 제거N 가스 및 진공 O / N에 따라 샘플을 배치.
3. 수용성 약물 (예, 단백질 항원)....

결과

ICMVs의 합성에 관련된 단계는도 1 내지 ^6에 도시된다. 간략하게, 모든 친 유성 약물 또는 형광 염료를 함유하는 지질 막이 친수성 약물의 존재 하에서 수화된다. 이러한 ^칼슘과 같은 가의 양이온은, 다중 층 소포에 음이온 성 리포좀의 융합을 드라이브에 추가됩니다. DTT 등, 지질 층 apposing, 마지막 외부 말레이 미드 그룹을 나머지의 "스테이플"말레이 미드 기능화 지질에 첨가되는 가교제는 다이 티올, 티올-PEG 잔기와 반응에서 급냉된다. 각 배치의 작은 부분은 용이 DLS 및 제타 전위 분석 시스템과 입경 분산도 지수, 및 제타 전위를 측정함으로써 품질 제어 측정을 실시 할 수있다. 그 결과 입자는 OVA-캡슐화 P에 대한 평균 130 ± 20 나노 미터의 크기, 0.22 ± 0.02의 다 분산 지수 및 -54 ± 3 MV의 제타 전위와 상대적으로 균일하다기사 (그림 1B 및 1C). 입자의 건조.......

토론

본 문서에서 제공된 프로토콜 ICMVs 불리는 합성과 새로운 지질 계 나노 입자 시스템의 특성을 설명하고, 항원 특이 적 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 나노 입자 기반 백신 제형의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다. ICMV 합성은 종종 손실의 결과로 일반적으로 제조하기위한 유기 용매를 필요로하는 다른 일반적으로 사용되는 고분자 나노 입자 시스템 (예를 들면, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드) 산성 입자)에 비해 큰 장점 모든 수성 상태에서 완료 단백질 항원은 ^{29, 30를} 항원. 또한, 광범위한 성능 및 안정성에서 ICMVs 이점 따라서 장갑차 ^{(31, 32)} 내에서 동일한 세포 내 구획에 표적 항원과 보조제의 동시 전송을 허용하는, 소수성과 친수성을 모두 ^{6 분자를} 캡슐화. 모델 백신 나노 입자로 ICMVs를 사용하여, 우리가 절차를 설명했다(1) 나노 입자의 합성 및 특성화 dLNs에 나노 입자의 배수 (2) 검증, 및 항원 특이 적.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1입니다. 단백질 항원 및 보조제 분자와 함께 로드된 ICMV의 합성 및 특성화
>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)	Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-디올레올sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)	Avanti Polar Lipids, INC.
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA)	Avanti Polar Lipids, INC.	699800
20 ml 유리 바이알	Wheaton	0334125D
Symphny 진공 오븐	VWR	414004-580
Ovalbumin (OVA)	Worthington	3054
Bis-Tris 프로판 (BTP)	Fisher	BP2943
Q125 Sonicator (125  승 20  kHz)	Qsonica	Q125-110
디티오트레이톨 (DTT)	Fisher	BP172
2 kDa 티올화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-SH)	Laysan Bio	MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP	Malvern
ZetaSizer Cuvettes	Malvern	DTS1070
2. 컨포칼 현미경을 사용한 형광 태그 ICMV의 림프절 배출 검사
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)	Life Technologies	D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)	Life Technologies	A37571
Tissue-Tek OCT 동결 매체	VWR	25608-930
조직 크라이오몰드	VWR	25608-922
3. 전체 동물 이미징을 사용한 나노 입자 백신 접종 후 항원 특이적 루시페라제 발현 CD8+ T 세포의 확장 모니터링
C57BL/6 마우스	Jackson	000664
Albino C57BL/6 마우스	Jackson	000058
OT-1 C57BL/6 마우스	Jackson	003831
70 μ m 나일론 여과기	BD	352350
EasySep™ 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트	StemCell	19853
IVIS® 전체 동물 이미징 시스템	Perkin Elmer
4. 항원 특이적 CD8+ T 세포의 유세포 분석을 위한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 펩타이드-MHC 테트라머 염색
K2EDTA 튜브	BD	365974
ACK 용해 완충액	Life Technologies	A10492-01
Anti-CD16/32 Fc Block	Ebioscience	14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer	MBL	TS-5001-1C
Anti-CD8-APC	BD	553031
Anti-CD44-FITC	BD	553133
Anti-CD62L-PECy7	Ebioscience	25-0621-82
4′,6- 디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI)	SIGMA	D8417-10MG
CyAn 유세포분석기	Beckman Coulter
FlowJo Software	FlowJo

870012850375