의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

요약

셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.

초록

말라리아는 중요한 글로벌 이환율과 사망률을 발생합니다. 어떤 일상적인 백신은 현재 사용할 수 없습니다. 백신의 부족에 대한 주요한 이유 중 하나는 적합한 백신 후보를 식별하는 도전이다. 말라리아 단백질은 원핵 생물과 진핵 세포 기반 발현 시스템이 제대로 감소 면역 원성에 이르는 부적절한 폴딩, 일반적으로 불용성 당화 및 겪게된다 사용하여 표현. 밀 배아, 토끼 망상 적혈구 용 해물 및 대장균 파쇄 무 세포 발현 시스템은 현재 말라리아 단백질의 발현을 위해 사용된다. 그러나, 발현 시간과 단백질의 부적절한 당화의 길이는 여전히 과제로 남아. 우리는 "시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템"이라 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 시험 관내에서 변형체 단백질의 발현을 보여준다. 2 헬라 세포 기반 표현의 자유 시스템은 75 분, transcrib의 3 μL에서의 mRNA를 전사ED의 mRNA는 90 분에 단백질을 변환하기에 충분하다. 1 단계의 발현 시스템은 전사 및 번역에 결합 발현 시스템이고; 전사 및 공동 번역은 3 시간에 발생합니다. 프로세스는 추가적인 에너지를 제공하여 6 시간 동안 연장 될 수있다. 2 단계 발현 시스템에서 mRNA를 먼저 전사 된 후 단백질 발현을위한 번역, 혼합 하였다. 우리는 말라리아 단백질을 표현하는 방법에 대해 설명합니다; 소수성 PF3D7_0114100 마우어의 갈라진 - 2 트랜스 (PfMC-2TM) 단백질, 친수성 ​​PF3D7_0925900 단백질 및 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 단백질을 함유 PF3D7_1361800 딜 반복. 단백질은 2 단계 및 1 단계 식 전략을 이용한 마이크로 부피로 표현된다. 친 화성 정제 방법이 또한 기재되어있는 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템을 이용하여 발현 된 단백질의 25 μL를 정화한다. 단백질의 수율은 브래드 포드 분석에 의해 결정되고 표현정제 된 단백질은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 표현 재조합 단백질은 면역, 면역 분석 및 단백질 서열 분석에 사용될 수있다.

서론

말라리아 연구에서 원핵 또는 진핵 세포 기반 시스템을 사용하여 면역 원성 단백질의 발현 도전 남아있다. 변형체 게놈과 알 수없는 포스트 번역 메커니즘 ^14,7의 AT의 풍요 로움은 항체 생산 및 백신 연구에 적절하게 접어 면역 원성 단백질을 획득과 관련된 어려움에 기여한다. 대장균 등의 원핵 시스템은 재조합 단백질 발현을 위해 사용되어왔다. 원핵 생물 시스템은, 효과적인 저렴한 비용으로 재조합 단백질의 높은 수율을 생산 여러 클로닝 벡터를 가지고있다. E. 호스트 대장균 세포는 변형이 용이하고 신속하게 세포 성장. 그러나, 이러한 시스템은 원핵 아미노산 치환, 번역 후 변형, 봉입체 ⁽²⁴⁾ 내의 오염, 제품 및 이종 재조합 단백질의 축적의 위험 부족 등 한계가있다.

안에Mehlin 등의 알에 의해 연구. (2006) 1000 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 표현 하였다. 발현 된 단백질의 약 7 %가 용해 ^{(14)이었다.} 관찰 불용성 유전자의 바이어스 특성 및 풍부한 게놈 ^14의 변형체로 이상적으로 사용되는 코돈 고주파 때문이다. 이....

프로토콜

기생충 세포 배양 1. 준비, 기생충 펠렛의 컬렉션

1. 1 L에 RPMI-1640 분말 10g, 겐타 마이신 황산염 66 ㎎, 2g 중탄산 나트륨, 5.9 g의 HEPES 완충액, 50 mg을 하이포크 산틴 3.8 g의 덱 스트로스를 추가하여 RPMI-1640-HEPES 매체를 준비 멸균 DH ₂ O. 1 L의 증류수 모든 분말이 용해 될 때까지 테이블 마그네틱 교반기를 사용하여 혼합. 0.22 μm의 필터를 사용하여 미디어의 미세 여과를 수행합니다. 멸균 병에 미디어를 보관합니다.
2. 감염되지 않은 (신선한) 워시 RPMI를 사용하여 A + 적혈구를 입력합니다. 적혈구 용적률 5 % (9.5 ㎖의 RPMI + 10 % 인간 혈청 세척 신선한 적혈구 0.5 ml)로 준비한다.
3. 15 % 인간 혈청 + RPMI (인간 혈청 15 ㎖의 RPMI의 85 ml)을 기생충의 재배를 시작합니다. 10 % 인간 혈청 및 RPMI (인간 혈청 10 ㎖와 RPMI 90 ml)을 적혈구에서 기생충의 배양을 계속합니다.
4. 문화 P. 원충 (3D7 및 FCR-3 균주) 유형5 % 적혈구 용적률 20 %의 기생충 배양 접시에서 또는 75cm ³ 문화 플라스크에서 A + 인간의 적혈구. 트레와 젠슨....

결과

특정 항체와의 반응성을 통해 발현 된 재조합 단백질의 유효성이 발현 된 단백질의 적당한 폴딩을 확인하는 중요한 첫 단계이다. 재조합 말라리아 단백질은 하나의 단계 및 시험 관내 인간 세포 무료 발현 시스템의 두 단계를 사용하여 표현 하였다. 재조합 단백질 정제 니켈 킬레이트 친 화성 방법입니다. 우리는 다음 SDS-PAGE 분리 된 재조합 단백질의 서쪽 블로 팅에서 전체 merozoite의 rhoptries에 대한 항혈청을 사용했다.

그림 1은 1 % 아가 로스 젤에서 PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 및 PF3D7_1436300의 PCR 증폭 된 유전자 단편을 보여줍니다. DNA 밴드 절제하고, DNA는 DNA 추출 스핀 열에서 동결로 정제.

게놈 DNA에서 (표 2) 성공적으로 증폭 된 유전.......

토론

체외 인간 세포 무료 발현 시스템 및 정제에 두 단계를 사용하여 단백질을 성공적으로 표현 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ^℃로 RNA를 전사; 의 RNAse 억제제의 존재하에 30 ℃에서 단백질 3) 번역; 4) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 5로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 친 화성 정제 기반 프로토콜을 개발. 한 단계 IVT 결합 단백질 번역 시스템을 이용하여 단백질의 성공적인 표현을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ° C에서 전사 및 단백질의 번역; 3) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 4로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 친 화성 정제 기반 프로토콜을 개발.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2단계 in vitro human cell free expression system	Thermo Fisher	88856	단종 항상 -80°C에서 보관하십시오. 따뜻한 물에서 해동하지 마십시오
1-step in vitro 결합 번역 시스템	Thermo fischer	88860	항상 -80°C에서 보관하십시오. 따뜻한 물에 해동하지 마십시오
ProBond 정제 시스템	Invitrogen	K850-01	RT에 보관
Probond 니켈 킬레이트 수지	Invitrogen	R801-01	4oC에 보관하십시오.
A+ 인간 혈액	주간 혈액 은행		상점 4 °C.