방법 논문

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성 체외

DOI:

10.3791/52779

⸱

2016년 6월 18일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

초록

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호중구 과립구는 인간의 혈액에서 가장 풍부한 백혈구입니다. 호중구는 감염 부위에 가장 먼저 도착합니다. 호중구는 식세포작용(phagocytosis), 탈과립화(degranulation) 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성을 포함한 여러 항균 메커니즘을 개발했습니다. NET은 히스톤으로 장식된 DNA 골격과 골수페록시다아제(MPO) 및 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)를 포함한 여러 과립 마커로 구성됩니다. NET 방출은 호중구의 특징적인 형태학적 변화를 수반하는 능동적인 과정으로, 호중구의 DNA가 세포 외 공간으로 배출되는 과정입니다. NET은 미생물과 싸우는 데 필수적이지만, NET의 통제되지 않은 방출은 여러 질환과 관련이 있습니다. 임상적 관련성과 NET 형성 메커니즘에 대해 자세히 알아보려면 NET 정량 분석이 가능한 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다.

여기에서는 in vitro에서 인간 호중구의 NET 방출을 평가할 수 있는 세 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 멤브레인 불투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 인간 호중구에서 세포 외 DNA 방출을 측정하는 고처리량 분석입니다. 또한 NET 특이적 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량화할 수 있는 두 가지 다른 방법이 설명됩니다. 이러한 마이크로플레이트 기반 방법을 함께 사용하면 인간 호중구의 NET 형성 메커니즘과 조절을 효율적으로 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 사용할 수 있습니다.

서론

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NET 형성은 호중구가 병원체와 싸우는 새로운 메커니즘입니다. 1 NET의 핵심은 핵 DNA입니다. 1 이 DNA 네트워크는 호중구 과립 단백질 및 히스톤과 관련이 있습니다. 1 NET 형성의 주요 형태는 염색질 축합 제거, 과립 및 핵 막의 소실, 호중구 엘라스타아제의 핵으로의 전좌, 히스톤의 시트룰린화, 마지막으로 DNA 기반 NET의 유출을 특징으로 하는 호중구의 사멸을 필요로 합니다. 2 개NET은 다양한 미생물을 포획하고 죽이며 선천성 면역 무기 레퍼토리의 필수적인 부분입니다. 그러나 통제되지 않은 그물 형성은 수많은 자가염증성 질환과 관련이 있습니다. 3,4 관련성이 점점 더 확립되고 있음에도 불구하고 NET 릴리스의 메커니즘과 규정에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

NET을 방출하여 죽는 호중구는 자가사멸 또는 괴사성 호중구와 다릅니다. 3,5 호NET 방출 호중구는 NET 형성에 특징적인 몇 가지 특징을 보여줍니다. 과립 성분은 NET의 DNA와 관련이 있습니다. 1 개골수과산화효소(MPO)와 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)는 모두 휴지 세포의 1차 과립에서 발견되지만 NET의 DNA에 결합하기 위해 핵으로 전위됩니다. 1 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체는 NET에 특이적이며 자가사멸성 또는 괴사성 호중구에서 발생하지 않습니다. 1,3,5 염색질 축합은 NETosis의 또 다른 전형적인 특징입니다. 2 개NET 릴리스는 또한 펩티딜 아미니다아제 4(PAD4)에 의한 히스톤의 시트룰린화를 필요로 합니다. 6 시트룰린 화 히스톤은 NET 방출을 거친 호중구의 특징입니다. 6

여기서는 높은 처리량 규모로 NET을 정량화할 수 있는 훌륭한 도구를 제공하는 세 가지 방법을 소개합니다. 첫 번째 분석은 다양한 변화가 있는 현장에서 사용되었으며 마이크로플레이트 형식으로 세포 외 DNA 방출을 정량화합니다. 두 번째 및 세 번째 분석은 NET 특이적 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체를 측정하여 NET을 확인합니다.

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프로토콜

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조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. 5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다.

주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1)

주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. 7,9

  1. 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
  2. 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다.
  3. 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균.
  4. 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75 % -70 % -65 %이 15 ML 원뿔 튜브 및 레이어 2 ㎖의 백혈구 서스펜션의 각 그라데이션의 상단에.
  5. 브레이크 해제와 함께 30 분 동안 원심 분리기 800 XG.
  6. 모든 셀 75 % / 80 %에서 레이어 (호중구) 70 % / 75 % 인터페이스를 수집합니다.
  7. PBS에 두 번 (350 XG, 10 분, RT)을 세포를 씻으과 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.

마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 세포 외 DNA 자료의 속도론 2. 측정

참고 :이 방법은 막 불 투과성 DNA 결합 96 웰 마이크로 포맷에 DNA 자료를 나타내는 염료 (그림 2)의 형광의 변화를 측정 할 수 있습니다.

  1. + 분석 매체에서 호중구의 현탁액 (HBSS 준비2 × 106 세포 / ml의 농도에서 1 % (v / v)의자가 혈청 + 5 mM의 포도당).
  2. 막 투과성 DNA 결합 염료의 5 μmol / L를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
  3. 나누어지는 인간 호중구 (50 μL / 웰) 마이크로 96 웰 블랙, 투명 바닥 위에. 확인 분석 배지를 웰의 전체 바닥을 포함합니다. 그렇지 않은 경우, 측면에 부드럽게 판을 누릅니다.
  4. 37 ° C에서 10 분간 플레이트 포함 호중구을 따뜻하게.
  5. 한편 최종 농도의 두 배에 자극의 솔루션을 준비하는 것은 사용되는 (37 ° C 따뜻한 분석 매체에서). 긍정적 인 NET 컨트롤이 최대 NET 자료를 트리거하기 위해 4 시간 동안 100 나노 포르 - 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)와 인간 호중구를 사용할 때 자발적 NET 형성이 낮은 5,8 남아있다. 4 시간 동안 5,8 PMA 자극은 최대 NET 자료를 보장합니다.
  6. 측정 (4 시간, 37 ° C, 여기에 대한 530 nm의 및 배출을위한 590 ㎚)에 대한 마이크로 형광 계를 준비​​합니다.
  7. 50 μL 호중구 현탁액 50 μL 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극한다. 최대 DNA 해제 신호를 측정하기 위해 잘 한 0.5 μg의 / ㎖ 사포닌을 사용합니다.
  8. 리더 플레이트를 놓고없이 진탕 매 2 분에서 4 시간 동안 형광의 변화를 측정한다.
  9. 데이터 분석을 위해, 시간에 따른 형광의 증가 정규화를 계산한다.
    1. 사포닌을 포함한 모든 우물 용 엔드 포인트 값에서 빼기 기준 형광 (그림 2A, B). 사포닌 형광 상승이 가장 높은 신호이어야한다. 이것은 "DNA 최대 방출"(도 2A)로 지칭된다.
    2. 최대 DNA 릴리스 미지 시료의 형광의 증가를 분할하여 미지 시료에서 DNA 방출의 비율을 계산합니다.
    3. 복제의 평균 결과는 "최대 DNA의 출시 %"(그림 2C)로 제시.

NET 양식 3. 정량MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험에 의해 ATION

참고 : 우리의 실험실에서이 분석 수정 (MPO-DNA) 또는 설립 (HNE-DNA)를 MPO-DNA와 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량 5.

  1. 코트 96 웰 높은 결합 하룻밤 캡처 항체 (50 μL / 웰) 용량 ELISA 플레이트 : 안티 - MPO (1 : 2,000 희석) 또는 안티 HNE (1 : 2,000).
  2. PBS로 세척 ELISA 플레이트는 세 번 (200 μL / 웰)와 RT에서 2 시간 동안 5 % BSA 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 블록 (200 μL / 웰). PBS로 3 회 세척 할 것.
  3. 시드 96 웰 마이크로 / 웰로 100 ㎕를 분석 배지 중 100,000 세포의 밀도로 호중구 및 NET 형성을 자극한다. 세포를 품어 : 37 ° C 4 시간.
  4. 그들을 잘 혼합, 호중구 상층 액 2 U / ㎖ DNase를 추가하여 제한된 DNase의 소화를 수행합니다. 실온에서 보관하십시오.
  5. 11 μL 25 밀리미터 EGTA (최종 농도 2.5 mm)를 추가하여 15 분 후 DNase의를 중지합니다. 잘 섞다. 스와 수집청소의 microfuge 튜브 pernatants. 스핀 샘플 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 파편을 제거한다. 청소의 microfuge 튜브에 자신의 상층 액을 전송합니다. 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
  6. 이전에 준비 "NET 표준"의 나누어지는을 사용합니다.
    주 : NET-표준은 적어도 5 개의 다른 독립적 인 인간 공여자로부터 수득 PMA 자극 호중구의 DNase 소화 상등액의 혼합이다.
    1. 오랫동안 동일한 표준을 사용하여 수집하고 각 공여자로부터 호중구 상청액 대량 나누어지는한다. 예를 들어 PMA 자극 호중구의 DNase의 소화 상층 액을 2 ㎖를 수집하는 것은 200 분량 씩 200 ELISA 플레이트에 충분한 (10 μL 각)가 발생합니다. 인터넷 표준을 특성화 데이터는 그림 5에서 발견된다.
    2. 4 시간 동안 100 nm의 PMA와 인간 호중구를 자극하고 DNase의이 단계 3.4-3.5있어서 자신의 상층 액을 소화 적용됩니다.
    3. 수집, 수영장, 나누어지는 (10 μL) 무료ZE (-20 ° C) 호중구 상층 액.
    4. 적어도 5 개의 개별 기증자로부터 획득 한 나누어지는 / 기증자 해동, "표준 NET의"를 준비하려면를 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
    5. 해동 샘플을 취소하고 다음 실험을 위해 신선한 것을 사용합니다.
    6. PBS + EGTA에서 NET-표준의 2 용액을 희석 : 1을 준비합니다.
  7. DNase1 소화 시료 (표준 및 알 수없는 상층 액) PBS + EGTA 20 배 희석 캡처 항체로 코팅 된 ELISA 플레이트에 그들을 나누어지는.
  8. 4 ° C에서 밤새 ELISA 플레이트를 품어 PBS로 세 번 씻는다.
  9. 검출 항체 용액을 적용 (100 μL / 웰) : 말 래 디쉬 퍼 옥시다아제 접합 항 DNA 항체 (1 : 500, 마우스). 어둠 속에서 1 시간 동안 품어.
  10. PBS와 네 세척 후 TMB 퍼 옥시 다제 기판을 추가 : 100 μL / 웰, 30 분. 블루 착색은 퍼 옥시 다제 활성 (현재 그물)에 대한 표시입니다.
  11. 잘 100 μL / 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그만큼블루 솔루션은 노란색 (그림 5A)를 설정합니다.
  12. 마이크로 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
  13. 데이터 분석을 위해, NET 표준에 비해 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 계산한다.
    1. 모든 샘플에서 분석 배지의 배경 광 밀도 값을 뺀다.
    2. 상대 NET 콘텐츠 (Y 축) (도 5a)에 대한 희석하여 표준 시료의 흡광도 값 (X 축)을 그린다.
    3. 이 표준 곡선의 nonsaturated 범위를 사용하면 (그림 5A) (사용되는 소프트웨어에서 최상의 지수 맞게 사용) 추세선을 설정합니다. 이 추세선 방정식 그물의 양을 양적하기 OD 값의 변환을 결정한다.
    4. 인터넷 표준 (그림 5A)의 비율로 미지 시료에 그물의 양을 줄 것이다 3.13.3에서 추세 줄 식으로 미지의 측정 된 OD 값을 삽입합니다.
    5. 계산하다복제 (삼중)의 평균 (그림 5C) "MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체 (표준의 %)의 양"으로 최종 데이터를 제시한다.

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결과

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이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식 2는 그림. 인간의 호중구는 웰 (96) 마이크로의 준수에 DNA 자료의 형광 마이크로 플레이트 리더 반응 속도를 사용하여. 그림 3은 데이터 분석의 각 단계를 설명합니다. 먼저, 사포닌 (도 3a)으로 처리 호중구의 최대 DNA 신호를 계산한다. 형광의 증가는 항상 최고 형광 값 및 배경 형광 레벨 (차이로서 계산된다 P. 활성화 왼쪽 표시 녹농균...

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토론

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그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. 1 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 첫 번째 분석은 막 불 투과성 DNA 결합 염료의 형광 반응 속도를 다음과 같습니다. 이 분석은 슬로프 및 호중구에서 DNA 방출 속도에 많은 양의 정보를 제공한다. 이 정보는 NET 형성으로 이어지는 초기 신호 이벤트를 연구 조사에 매우 중요합니다. 모든이 정보는 인큐베이션의 끝에 DNA 분리 측정 종료점 분석에서 손실된다. 세포 외 DNA 염료 계 분석은 그물에 특이하지 않다. 이것단지 DNA 자료를 측정한다. 그물을 확인하기 위해 널리 NET-형성 호중구에 면역을 수행하고 과립 마커 (MPO, HNE) 또는 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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인간 호중구 분리 작업을 지속적으로 지원해 주신 조지아 대학교 보건 센터 실험실 직원들에게 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 UGA 연구 담당 부사장실에서 제공한 Dr. Rada의 창업 기금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항인간 호중구 엘라스타제  토끼 Ab Calbiochem4810011:2,000x 코팅
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)Millipore07-4961:2,000x 코팅
DNase-1Roche10-104-159-0011 µ 소화에 사용되는 g/ml
20 mM EGTA/ PBSSigma-AldrichE3889-25G
2.5 mM EGTA/PBSSigma-AldrichE3889-25G
세포 사멸 감지 ELISA Anti-DNA PODRoche115446750011:500x 
Eon Microplate 분광 광도계Biotek
Gen5 All-in-One microplate 소프트웨어Biotek분석 도구(ELISA)
Sytox orangeLife TechnologyS113680.2% 최종 농도/부피
1M HepesCellgro25-060-Cl10mM 최종 농도를 사용합니다.
1M 포도당 시그마는 5mM 최종 농도를 사용합니다.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Thermoscientific
PMASigmaP 8139100 nM 최종 사용
ELISA PlateGreiner bio-one655061
원뿔형 튜브 15mlThermoscientific339650
원뿔형 튜브 50ml열과학339652
퍼콜 (pH 8.5-9.5) SigmaP 1644염화나트륨, Sigma, S7653-250G
덱스트란스펙트럼D1004
RPMI 1640 매체Corning Cellgro17-105-CV
96 웰 분석 플레이트 블랙 플레이트 투명 바닥Costar3603

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

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