High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.
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방법 논문
세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
호중구 과립구는 인간의 혈액에서 가장 풍부한 백혈구입니다. 호중구는 감염 부위에 가장 먼저 도착합니다. 호중구는 식세포작용(phagocytosis), 탈과립화(degranulation) 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성을 포함한 여러 항균 메커니즘을 개발했습니다. NET은 히스톤으로 장식된 DNA 골격과 골수페록시다아제(MPO) 및 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)를 포함한 여러 과립 마커로 구성됩니다. NET 방출은 호중구의 특징적인 형태학적 변화를 수반하는 능동적인 과정으로, 호중구의 DNA가 세포 외 공간으로 배출되는 과정입니다. NET은 미생물과 싸우는 데 필수적이지만, NET의 통제되지 않은 방출은 여러 질환과 관련이 있습니다. 임상적 관련성과 NET 형성 메커니즘에 대해 자세히 알아보려면 NET 정량 분석이 가능한 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다.
여기에서는 in vitro에서 인간 호중구의 NET 방출을 평가할 수 있는 세 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째는 멤브레인 불투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 인간 호중구에서 세포 외 DNA 방출을 측정하는 고처리량 분석입니다. 또한 NET 특이적 MPO-DNA 및 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량화할 수 있는 두 가지 다른 방법이 설명됩니다. 이러한 마이크로플레이트 기반 방법을 함께 사용하면 인간 호중구의 NET 형성 메커니즘과 조절을 효율적으로 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 사용할 수 있습니다.
서론
NET 형성은 호중구가 병원체와 싸우는 새로운 메커니즘입니다. 1 NET의 핵심은 핵 DNA입니다. 1 이 DNA 네트워크는 호중구 과립 단백질 및 히스톤과 관련이 있습니다. 1 NET 형성의 주요 형태는 염색질 축합 제거, 과립 및 핵 막의 소실, 호중구 엘라스타아제의 핵으로의 전좌, 히스톤의 시트룰린화, 마지막으로 DNA 기반 NET의 유출을 특징으로 하는 호중구의 사멸을 필요로 합니다. 2 개NET은 다양한 미생물을 포획하고 죽이며 선천성 면역 무기 레퍼토리의 필수적인 부분입니다. 그러나 통제되지 않은 그물 형성은 수많은 자가염증성 질환과 관련이 있습니다. 3,4 관련성이 점점 더 확립되고 있음에도 불구하고 NET 릴리스의 메커니즘과 규정에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
NET을 방출하여 죽는 호중구는 자가사멸 또는 괴사성 호중구와 다릅니다. 3,5 호NET 방출 호중구는 NET 형성에 특징적인 몇 가지 특징을 보여줍니다. 과립 성분은 NET의 DNA와 관련이 있습니다. 1 개골수과산화효소(MPO)와 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)는 모두 휴지 세포의 1차 과립에서 발견되지만 NET의 ....
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프로토콜
조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. 5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다.
주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1)
주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. 7,9
- 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
- 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다.
- 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균.
- 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75....
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결과
이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식 2는 그림. 인간의 호중구는 웰 (96) 마이크로의 준수에 DNA 자료의 형광 마이크로 플레이트 리더 반응 속도를 사용하여. 그림 3은 데이터 분석의 각 단계를 설명합니다. 먼저, 사포닌 (도 3a)으로 처리 호중구의 최대 DNA 신호를 계산한다. 형광의 증가는 항상 최고 형광 값 및 배경 형광 레벨 (차이로서 계산된다 도 3a). 이는 각 웰에 대해 계산된다. 이 .......
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토론
그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. 1 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 첫 번째 분석은 막 불 투과성 DNA 결합 염료의 형광 반응 속도를 다음과 같습니다. 이 분석은 슬로프 및 호중구에서 DNA 방출 속도에 많은 양의 정보를 제공한다. 이 정보는 NET 형성으로 이어지는 초기 신호 이벤트를 연구 조사에 매우 중요합니다. 모든이 정보는 인큐베이션의 끝에 DNA 분리 측정 종료점 분석에서 손실된다. 세포 외 DNA 염료 계 분석은 그물에 특이하지 않다. 이것단지 DNA 자료를 측정한다. 그물을 확인하기 위해 널리 NET-형성 호중구에 면역을 수행하고 과립 마커 (MPO, HNE) 또는 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
인간 호중구 분리 작업을 지속적으로 지원해 주신 조지아 대학교 보건 센터 실험실 직원들에게 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 UGA 연구 담당 부사장실에서 제공한 Dr. Rada의 창업 기금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항인간 호중구 엘라스타제 토끼 Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x 코팅 |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x 코팅 |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µ 소화에 사용되는 g/ml |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 세포 사멸 감지 ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate 분광 광도계 | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate 소프트웨어 | Biotek | 분석 도구(ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% 최종 농도/부피 |
| 1M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | 10mM 최종 농도를 사용합니다. |
| 1M 포도 | 당 시그마 | 는 5mM 최종 농도를 사용합니다. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM 최종 사용 |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| 원뿔형 튜브 15ml | Thermoscientific | 339650 | |
| 원뿔형 튜브 50ml | 열과학 | 339652 | |
| 퍼콜 (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | 염화나트륨, Sigma, S7653-250G |
| 덱스트란 | 스펙트럼 | D1004 | |
| RPMI 1640 매체 | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 웰 분석 플레이트 블랙 플레이트 투명 바닥 | Costar | 3603 |
참고문헌
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al.
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재인쇄 및 허가
