공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em&gt; 생체</em&gt; : 단일 선박 스트로크의 모델

요약

여기에서는 생체 내 마우스의 체성 감각 피질에서 Rose Bengal 광혈전 혈전을 유도하기 위한 반침습적 광학 현미경 접근 방식을 설명합니다. 이미징 절차의 기술적 측면은 광혈전 이벤트의 유도에서 적용 및 데이터 수집에 이르기까지 설명됩니다.

초록

최근 이미징 염료 및 광학 기술의 발전으로 인해 생체 내 이미징 기술의 활용이 증가하여 손상되지 않은 동물의 세포 이벤트를 이미지화할 수 있게 되었습니다. 또한 생체 내에서 뇌졸중과 같은 생리적 질병 상태를 유도하는 능력은 그 유용성을 증가시킵니다. 본원에 기술된 기술은 뇌졸중 후 중추신경계 내의 세포 반응의 생리학적 평가를 가능하게 하고, 연구되고 있는 다른 병리학적 상태에 대해 적용될 수 있다. 제시된 기술은 생체 내에서 감광성 염료 Rose Bengal의 레이저 여기를 사용하여 단일 혈관에서 국소 허혈 이벤트를 유도합니다.

비디오 프로토콜은 로즈 벵골 광혈전 이벤트의 유도를 위해 마우스의 체성 감각 피질 위에 얇은 두개골 창을 준비하여 기저 경막 물질과 뇌의 손상을 최소화하는 것을 보여줍니다. 수술 준비는 처음에 맞춤형 수술/이미징 플랫폼이 있는 해부 현미경으로 수행된 다음 도립 대물 어댑터가 장착된 컨포칼 현미경으로 전송됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 획득한 대표 이미지와 스트로크 유도의 타임 랩스 시퀀스가 제공됩니다. 이 기술은 동일한 영역을 다음 날에 반복적으로 이미지화할 수 있어 뇌졸중 후 병리학적 과정에 대한 종단적 생체 내 연구를 용이하게 한다는 점에서 강력합니다.

서론

바로 로즈 벵갈 유도 다음과 같은 생체 내 세포 반응의 기술 설명을 허용 시각화는 그대로 마우스에 photothrombosis. 로즈 벵골 (4,5,6,7- 테트라 클로로 -2 ', 4', 5 ', 7'- tetraiodofluorescein)는 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중 (마우스 및 래트)을 유도하기 위해 사용되는 감광성 염료이다. 564 nm의 레이저 광에 얇게 두개골을 통해 꼬리 정맥을 통해 조사 및 후속 RB의 볼 루스 주입 후, 혈전 생리적 ^뇌졸중을 일으키는 ^한 유도된다. 이 방법은 원래 1977 년에 로젠과 엘 Sabban 설명하고, 이후 1980 년대 중반 ^{1, 2에서} 왓슨에 의해 채택되었다. 요컨대, 로즈 벵갈이어서 조직 인자, 혈액 응고 캐스케이드의 개시제를 활성화 반응성 산소 종의 생성을 생성 녹색 여기 광 (우리의 경우에 561 nm의 레이저)을 조사한다. 응고 캐스케이드의 유도는 레 허혈성를 생산임상 스트로크 ³ 병리학 관련 이온.

스트로크는 뉴런, 아교 세포, 내피 세포 및 면역계 세포 등 다양한 종류의 상호 작용으로 인해 복잡한 기전을 갖는다. 최고의 기술을 선택하는 것은 특정 세포 프로세스....

프로토콜

참고 : 모든 동물의 절차는 텍사스 건강 과학 센터 샌 안토니오 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 도착 도착 가이드 라인과 일치했다되었다.

1. 두피 준비를위한 마취

1. 마취를 유도하는 산소와 혼합 2~3% 이소 플루오 란으로 유도 챔버에 놓고 마우스. 마우스가 유도로 호흡 속도 감소를 관찰합니다. 마우스가 코 콘으로 이동 준비가되어 있는지 여부를 확인하려면 마우스의 발을 꼬집어. 주 : 마취 레벨이 어떤 생체 제조에서 중요한 단계 및 관리에 글로벌 허혈 발생할 수준을 유도하지 않도록주의해야한다.
2. 마우스가 충분히 마취되면, 수술 / 이미징 플랫폼에 동물을 전송하고 노즈콘에서 마우스의 코를 배치하고 마취 상태를 유지 1-1.2 % 이소 플루오 란을 적용한다. 마우스가 온도 공동에 누워 있는지 확인ntrolled 가열 패드 나머지 절차 내내 체온 (37 ° C +/- 0.5 ° C)를 유지한다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈을 통해 수의사 연고를 놓습니다.
3. 시스템과 함께 제공되는 꼬리 클립이나 발을 사용하여 산소 포화도 시스템을 사용하여 마우스의 생리 모니터. 호흡 속도가 50-65 호흡 / 분 사이에 유지되어 있는지 확인합니다. 동물의 장기 생존을 보장....

결과

이 방법의 목적은 561 nm의 레이저 광과 두개골의 박형화 꼬리 정맥을 통해 조사 및 후속의 RB 루스 주사 다음 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중 (마우스 및 래트)을 유도했다. 도 4의 이미지는 0, 1, 1.5, 2 분으로 조사 영역의 다음 단일 용기 내 혈전 형성의 진행을 보여준다. 혈전 형성하기 전에 전체 선박 로즈 벵갈 흐르는 확보로 인해 흰색입니다. 선박의 조사의 유도에 따라이 선박의 부분에 명백한 어둡게하고 혈전 형성 (프레임 1과 1.5 분)의 유도를 나타냅니다. 완전한 폐쇄 후 혈관 내 응고 (검은 부분) 앞의 장미 벵골 염료 (흰색 영역)의 현저한 축적이있다. 이분 프레임은 동맥의 완전한 폐색을 보여준다.

허혈성 뇌졸중의 TTC 염색의 존재가 활용 될 수 확인합니다. TTC는 공동mmonly 건강한 조직에서 붉은 TTC 포르 마잔 생성물의 형성에 의해 뇌경색의 검출에 얼룩을 사용했다. 포르 마잔 생산 (흰색 조직)의 결여는 경색 .......

토론

인간의 응용 프로그램에 동물 실험에서 스트로크 병태 생리를 번역 할 수있는 능력은 실패로 고생하고있다. 그러나, 이러한 모델 photothrombosis 같은 동물 모델의 사용은 개선 된 뇌졸중 병태 생리에 대한 이해와 스트로크 다음 신경 보호를 제공하기위한 새로운 치료 적 접근법의 탐색을 허용한다. 작은 대뇌 피질의 스트로크와 photothrombotic 모델에 의해 생성 microinfarctions은 높은 유병률을 가지고 있으며, 미국 인구 (약 1천1백만명) 매년 ^16의 약 4 %에 영향을 미치는 무증상 또는 "침묵"뇌졸중 ^13-15에 임상 적이다. 자동 스트로크는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 또는 일과성 허혈 발작 (TIA) ^(17)에서 볼 수 있듯이 이러한 마비, 감각 손실과 어려움으로 큰 스트로크에 존재하는 고전적인 뇌졸중 증상이, 발표자가 없습니다. 또한, 침묵 뇌졸중은 열공 뇌졸중, 다른 어떤깊은 뇌 구조 또는 뇌간 내에서 하나의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
로즈 벵골	시그마	330000
이소플루란 마취	MWI 수의학 공급	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM 포도당 및 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
장비
해부 가위	생명 산업 제품	500-410
작동 가위 14 cm	생명 산업 제품	12-055
집게 Dumont 하이테크 #5 스타일, 스트레이트	생명 산업 제품	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
스테레오 셋업의 이어 바 홀더	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent 설치류 마취기	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane 기화기	DRE, Inc.	34001
F 에어 캐니스터	DRE, Inc	80120
베인 회로 호흡 튜브	DRE, Inc	86111B
베인 튜브용 설치류 어댑터	DRE, Inc	891000
산소 탱크용 O2 레귤레이터	DRE, Inc	CE001E
설치류 유도 챔버	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 인치 P-3 바늘	봉합사 익스프레스	1639G
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