이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.
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방법 논문
수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포
이 논문에서
요약
초록
메타유전체학(metagenomics), 메타전사체학(metatranscriptomics) 및 메타단백질체학(metaproteomics)과 같은 메타오믹스(Meta-omics) 기술은 미생물 군집 구조와 대사를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 강력하기는 하지만, 균유전체학(metagenomics)만으로는 기능적 잠재력만 설명할 수 있습니다. 다른 한편으로, 메타단백질체학(metaproteomics)은 군집의 발현된 현장 대사 및 기능을 설명할 수 있게 합니다. 여기에서는 세포 용해, 단백질 및 DNA 분리를 위한 프로토콜뿐만 아니라 펩타이드 분해 및 카트리지 필터 장치(예: Sterivex 필터 장치)에 수집되고 RNA 안정화 용액(예: RNAlater)에 보존된 해양 미생물 세포에서 추출에 대해 설명합니다. 질량 분석 기반 단백질체학 연구에서 펩타이드 및 단백질의 식별은 펩타이드 탠덤 질량 스펙트럼을 번역된 뉴클레오티드 염기서열 데이터베이스와 비교하여 수행됩니다. 검색 데이터베이스에 샘플의 메타게놈을 포함하면 질량 스펙트럼에서 식별할 수 있는 펩타이드와 단백질의 수가 증가합니다. 따라서 이 프로토콜에서는 DNA가 동일한 필터에서 분리되어 나중에 메타유전체학(metagenomic) 분석에 사용할 수 있습니다.
서론
미생물은 유비쿼터스하고 지구의 생물 지구 화학 사이클 1에 필수적인 역할을한다. 현재, 미생물 군집의 구조와 기능을 특성화 할 수 많은 분자 접근 방법이있다. 4 - 일반적인 16S rRNA 유전자 분석 환경 (2)로부터 DNA가 PCR 증폭 된 서열이다. 16S rRNA 유전자 분석의 단점은 대사 기능 만에 거의 정보, 계통 신원 및 커뮤니티 구조에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 메타 지노믹스, metatranscriptomics 및 metaproteomics은 사회 구조와 대사에 대한 정보를 제공하기 때문에 대조적으로, 이러한 접근한다. 8 - 메타 지노믹스, 또는 생물의 유전자 군집의 함유량의 분석은, 커뮤니티 5의 구조 및 기능적 가능성에 대한 정보를 제공한다. 강력한 있지만,이 기능은 대사 전위에 대응하지 않을 수도생물의 활동. 유기체의 유전자형은 RNA로 전사 또한 표현형의 결과, 단백질로 번역 될 수있는 각각의 유전자에 의해 표현된다. 따라서, 환경에서 미생물 활성 작용의 이해를 돕기 위해, 포스트 게놈 분석 9를 수행한다. 그것은 주어진 환경에서 전사되는 유전자 밝혀 때문에 Metatranscriptomics, 또는 RNA 전 사체의 분석에 유용합니다. 그러....
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프로토콜
1. 시약 준비
- SDS-추출 용액을 제조 하였다 : 0.1 M 트리스 -HCl pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 10 mM의 EDTA, 1 % SDS를. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독.
- 폴리 아크릴 아미드 겔에 필요한 재고 시약을 준비합니다.
- 1.5 M 트리스 - HCL pH가 8.8를 준비합니다. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터.
- 0.5 M 트리스 - HCL pH가 6.8. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터.
- 10 % SDS를 준비합니다. 필터를 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 저장소.
- 에 - 겔 트립신 소화 및 펩타이드 추출에 필요한 솔루션을 준비합니다.
- 100 mM의 중탄산 암모늄을 준비합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독.
- 1 M DTT의 주식을 준비합니다. -80 ° C에서 100 mM의 중탄산 암모늄 및 저장 중에 현탁.
- 550 mM의 요오도 아세트 아미드 주식을 준비합니다. 현탁100 mM의 -80 ° C에서 중탄산 암모늄 및 저장.
- 100 NG를 ....
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결과
데모, 우리는 표면과 캐나다 북부의 해안 바다의 엽록소 최대에서 수집 한 두 개의 해수 샘플에 프로토콜을 수행 하였다. 바다에서, 해수 6-7는 L이 3 μm GF / d를 전치 필터를 통과하면서, 그때는 월시 균체 외. (20)의 프로토콜은 다음 0.22 μm의 카트리지 필터 장치에 수집되었다. 세포는 추가 처리 될 때까지 즉시 RNA 안정화 용액에 저장 하였다. 이 여기에 제시된대로 연구실로 돌아온 우리는 프로토콜을 수행. 농축 된 세포 용 해물을 나누었다; DNA는 볼륨의 나머지 10 %에서 침전되는 동안 단백질은 체적의 90 %에서 침전시켰다. 우리는 24 ~ 26 μg의 단백질 및 이들 샘플에서 높은 품질의 DNA의 250-308 NG (그림 1)을 회복했다. 겔의 트립신 분해 펩티드의 추출과, 우리 Orbitrap 엘리 결합 나노 LC를 사용하여 MS / MS 분석을 실시한 후, 펩티드테 질량 분석기 (써모 피셔 사이언 티픽, 월섬, MA, 미국). .......
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토론
샘플 보존 metaproteomic 연구에 중요하다 이전 작업은 RNA 안정화 용액 전에 단백질 추출 (28)에 셀을 저장하는 저장 버퍼 유용한 것으로 입증 하였다. 이상적으로, 샘플은 33, 34를 처리하는 동안 단백질 발현의 변화를 부정하는 현장에 보존 될 것이다. 사실, 시츄 샘플링 및 고정 기술은 선박 배치 인스트루먼트 자율 수집 및 샘플의 보존을 허용하는 개발되었다. 그러나, 이러한 기술에 대한 액세스가 항상 가능하지 않다. 그렇지 않은 일반적인 경우 샘플은 가능한 빨리 수집 후의 보존되어야한다.
여기서 우리는 일반적으로 수생 미생물에 사용되는 카트리지 필터 부, 수집 RNA 안정화 용액 저장 세포로부터 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜 PR이어서 SDS-분해 용액 가열을 사용하여 세포 용해를 포함필요한 탈염 단계로 두배 ultracentrifugal 필터 유닛을 사용하여 농축 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 nano-LC MS/MS를 위한 시료 준비에 대한 전문 지식과 조언을 제공한 Marcos Di Falco와 LC MS/MS 분석을 위해 University of Regina의 Zoran Minic 박사에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NSERC(DG402214-2011) 및 CRC(950-221184) 자금의 지원을 받았습니다. 워싱턴 D.C.는 Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems와 FQRNT의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sterivex -GP 0.22 &뮤; m 필터 유닛 | Millipore | SVGP01050 | 샘플링 |
| RNAlater 안정화 솔루션 | Ambion | AM7021 | 샘플링 |
| 트리스 | 바이오 베이직 | 77-86-1 또는 TB0196-500G | 단백질 추출/SDS 페이지 젤 |
| DTT | 시그마-알드리치 | D0632-1G | 단백질 추출 |
| SDS | 바이오 베이직 | 15-21-3 | 단백질 추출/SDS 페이지 젤 |
| EDTA | 바이오 베이직 | 6381-92-6 | 단백질 추출 |
| 글리세롤 | 피셔 사이언티픽 | 56-81-5 | 단백질 추출 |
| 10K Amicon 필터 | Millipore | UFC801024 | 단백질 추출 |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 179337-4L | 단백질 침전 |
| 아세톤 | Fisher Scientific | 67-64-1 | 단백질 침전 |
| MPC 단백질 침전 시약 | 진원지 | mmP03750 | DNA 침전 |
| 2-프로판올 | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA 침전 |
| Qubit dsDNA BR 어세이 키트 | , Life Technologies | Q32850 | DNA 정량화 |
| , Qubit 단백질 어세이 키트 | , Life Technologies | Q33211 | 단백질 정량화 |
| 수크로오스 | 바이오 베이직 | 57-50-1 | SDS PAGE 겔 |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE 겔 |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE 겔 |
| 30% 아크릴 아미드 | 바이오 라드 | 161-0158 | SDS 페이지 젤 |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE 젤 |
| 글리신 | 바이오 라드 | 161-0718 | SDS PAGE 젤 |
| B- 메르 캅토 에탄올 | 바이오 베이직 | 60-24-2 | SDS PAGE 젤 |
| Laemmli 샘플 버퍼 | 바이오 라드 | 161-0737 | SDS PAGE 젤 |
| 정밀 플러스 단백질 만화경 사다리 | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE 젤 |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | 인 젤 트립신 다이제 |
| 스트 NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | 인 젤 트립신 다이제 |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | 인 젤 트립신 다이 |
| 포름산 | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | 인 젤 트립신 다이제 |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | 인-젤 트립신 다이 |
| 요오도아세트아미드 | 바이오 베이직 | 144-48-9 | 인-젤 트립신 다이제 |
| 메가 | V5111 | 인-젤 트립신 다이제 | |
| 단백질 LoBind 튜브 1.5 ml | 에펜도르프 | 22431081 | 인-젤 트립신 다이제스트 |
| 2 ml ROBO 바이알 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | 인-젤 트립신 다이제스트 |
| PP BM 인서트, 스프링 없음 | Candian Life Science | 4025P-631 | 인 젤 트립신 다이제스트 |
참고문헌
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasona....
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