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방법 논문

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

12.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52885

⸱

2015년 6월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

초록

체세포 네 개의 전사 인자 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, C-Myc와)의 발현을 강제력에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)으로 재 프로그램 될 수 있고, 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 표명 . 때문에 인간 배아 줄기 세포와의 유사성, iPSCs는 인간 배아 줄기 세포와 관련된 윤리적 문제를 방지, 잠재적 인 환자 맞춤형 재생 의학을위한 중요한 도구가되고있다. 임상 적용에 적합한 세포를 얻기 위해서, 트랜스 프리 iPSCs은 트랜스 활성화, 변화된 유전자 발현 및 분화 잘못을 피하기 위해 생성 될 필요가있다. 또한, 고효율 및 저가의 리 프로그래밍 방법은 치료 목적을 위해 충분한 iPSCs를 유도 할 필요가있다. 이러한 요구를 감안할 때, 효율적인 비 통합 에피 솜 플라스미드 방법은 IPSC 유도를위한 바람직한 선택이 될 것입니다. 현재 프로그래밍을 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이 섬유 아세포는, 분리가있는 난 조직 생검을 요구환자에 대한 nvasive 수술. 따라서, 인간 말초 혈액 IPSC 생성에 가장 접근하고 최소 침습 조직을 나타낸다.

이 연구에서, 비 통합 에피 솜 플라스미드를 이용하여 비용 효율적이고 바이러스가없는 프로토콜은 전혈을 원심 분리 한 후 밀도 구배 분리없이 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)로부터 iPSCs의 생성을 위해보고된다.

서론

2006 년 신야 야마나카 하나의 그룹은 성인 쥐와 인간에서 체세포 네 프로그래밍 요소 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, 이소성 발현하여 능성 상태로 전환 될 수 있음을 최초로 입증 C-Myc와), 소위 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 2를 생성하는 단계를 포함한다. 특정 환자 iPSCs 밀접 형태, 증식 및 세 생식 세포 유형 (중배엽, 내배엽 및 외배엽)로 분화 할 수있는 능력의 관점에서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 인간 배아 줄기 세포 및 바이 패싱의 용도에 관련된 윤리적 문제 부족한 반면 가능한 면역 거부 3. 따라서, iPSCs는 기초 연구, 약물 검사, 질병 모델링, 독성 평가, 재생 의학 목적으로 4 환자 맞춤형 세포의 가장 중요한 소스 중 하나로 나타납니다.

몇 가지 접근 방법은 IPSC 생성을 위해 사용되어왔다 : 바이러스 통합 벡터를(5 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 6), 바이러스의 비 - 통합 벡터 (아데노 7), 센다이 바이러스 8 BAC 트랜스포존 9, 에피 솜 벡터 (10), (11) 단백질 또는 RNA 전달 12. 바이러스 - 매개 방법의 사용은 고효율 프로그래밍을 초래할 수 있지만, 바이러스 성 벡터는 숙주 세포에 따라서 전위 랜덤 삽입 성 돌연변이 유발의 게놈 내로 통합 분화 동안 유전자 발현, 및 침묵 유전자의 활성화의 영구 변형 (13)을 배제 할 수 없다.

재생 의학을위한 iPSCs 안전하게하려면 노력은 세포 게놈에 외래 DNA의 통합없이 iPSCs를 유도하기 위해 이루어졌다. excisable 트랜스포존 및 바이러스 벡터가 개발되었지만, 필연적 절제술 후 형질 도입 된 세포를 유지하고, 발현 벡터를 트랜스 짧은 시퀀스, 셀 변경을 유도 할 수 있는지에 여전히 불분명울라 (13)를 작동합니다. 높은 프로그래밍 효율에도 불구하고, 센다이 바이러스는 병진 연구에서 그 적용을 제한 할 가능성이있는 시스템을 개발 한 회사와 고가의 접근 및 도달 스루 라이센싱 문제를 나타낸다. 또한, 단백질 및 RNA의 직접적인 도입에 대한 필요성이 도입 본질적인 기술적 제한 분자를 재 프로그래밍의 다수의 전달을 필요로하고, 전체 프로그래밍 효율이 매우 낮다 (14). 참고로, 에피 솜 플라스미드의 사용을 기반으로 비용 효율적인 프리 - 바이러스 및 비 통합하는 방법이 성공적으로 피부 섬유 아세포 (15)의 재 프로그래밍을 위해보고 된 바있다. 이전에 10, 15를보고 구체적으로, 본 연구에서 우리는, 상용 가능한 통합없는 에피 솜 플라스미드를 사용하기로 결정했다.

지금까지의 피부 섬유 아세포는 가장 인기있는 도너 셀 타입 5를 나타낸다. 그러나, 다른 세포 소스 succes에왔다sfully 각질 (16), 골수 중간 엽 줄기 세포 (17), 지방 기질 세포 (18)를 포함 iPSCs로 재 프로그래밍, 머리는 19 여포, 치과 펄프 셀 (20). 이러한 세포의 분리는 수술 절차를 필요로하고, 여러 주들은 일차 세포 배양을 설정하기 위해 시험 관내 세포 확장을 위해 필요하다.

이러한 관점에서, 셀형의 개시 선택은 중요하며, 이는 혈액과 같은 쉽게 접근 덜 침습적 조직으로부터 iPSCs를 생성 할 수있는 것이 역시 중요하다. 두 제대혈 단핵구 (CBMNCs) (21, 22) 및 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs는) 14,22-24는 iPSCs의 유도를위한 세포의 적당한 공급원을 나타낸다.

성인 PBMNC 리 프로그래밍의 효율이 22 CBMNCs보다 20-50 배 낮지 만, 이들은 샘플링 목적을 위해 가장 편리한 셀형 남아있다. 에사실, PBMNC 샘플링은 최소 침습되는 장점을 가지며, 또한, 이들 세포는 재 프로그래밍 이전에 시험 관내 실험에서의 광범위한 확장을 필요로하지 않는다. 현재까지, 다른 프로토콜은 밀도 구배 분리 후 PBMNCs 냉동과 해동 일 몇 개월에 동결 후 iPSCs 22, 23로 재 프로그래밍하기 전에 며칠 동안 확장 될 수 있다고보고있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 우리는보고는 냉동 버피 코트에서 PBMNCs의 재 프로그래밍을 설명하지 않은 알고있다. 중요한 것은 밀도 구배 분리없이 수집 냉동 버피 코트 따라서 상기 샘플 수집을 피할 IPSC 생산을위한 재료의 쉽게 액세스 풀을 나타내는 모집단 연구 대규모 바이오 뱅크에 저장된 가장 일반적인 혈액 샘플을 나타낸다.

여기서 우리는 이전에 설명 된 프로토콜 (22)에 기초하여, 인간 냉동 버피 코트로부터 처음 바이러스 프리 iPSCs의 발생을보고한다. 에또한, iPSCs이 아닌 밀도 구배 정제 PBMNC 결과를위한 제어 프로토콜로서, 밀도 구배 분리 후의 냉동 PBMNCs로부터 생성 하였다.

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프로토콜

말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs)는 후 동의서와 남부 티롤 지방의 윤리위원회의 승인을 체결 건강한 기증자의 인간의 말초 혈액에서 분리 하였다. 실험은 헬싱키 선언 표현 원리에 따라 수행되었다. 모든 데이터를 수집하고 익명으로 분석 하였다.

말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMNCs)

  1. PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은.
    1. 시트르산 나트륨으로 정맥 말초 혈액 8ml의 수집은 RT (25 ° C)에서 플라스틱 튜브, 저장 버퍼링. 수집 후 12 시간 이내에 처리 혈액입니다.
    2. 스위칭 오프 원심 브레이크, 스윙 버킷 회에서 4 ° C에서 15 분 동안 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
    3. 흐린 버피 코트 (플라즈마 상부 상과 하부 층 사이에 모아서위상 cryovial 튜브에 PBMNC 농축 분획 (500 μL)를 포함) 적혈구의 대부분을 함유.
    4. 10 % DMSO의 농도는 1 ml의 총 부피를 얻기 위해 90 % FBS와 20 % DMSO를 함유하는 2 × 동결 배지 500 μL와 버피 코트 500 μl를 재현 탁.
    5. -80 ° C로 제어 된 레이트 냉동 컨테이너 바이알 동결. 더 긴 기간 동안 액체 질소에 보관 세포.
  2. PBMNCs는 밀도 구배 분리 후에 얻어진
    1. 시트르산 나트륨으로 정맥 말초 혈액 12 ml를 수집 실온에서 플라스틱 관 및 스토어 버퍼. 수집 후 12 시간 이내에 처리 혈액입니다.
    2. 35 ㎖의 최종 부피로 멸균 PBS와 혈액 희석.
    3. 조심스럽게 천천히, 층 50 ㎖ 원뿔형 튜브 (밀도 구배 분리에 사용) polysucrose 용액 (p = 1.077)에 15 ml의 희석 된 혈액을 35 ㎖ (비율 3 : 1).
    4. 실온에서 30 분에 800 XG에 튜브를 원심 분리기스윙 버킷 회 전자, 스위칭 오프 원심 브레이크를.
    5. 상단 노란색의 위상 포함 플라즈마를 대기음 및 폐기. 조심스럽게 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 PBMNCs 함유 불투명 한 백색 계면 층을 옮긴다.
    6. 멸균 PBS 30 ml의 총 부피를 가져오고 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
    7. 뜨는을 취소하고 PBS의 30 ml의 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 배제 (25)에 기초하여 생존 세포의 수를 카운트.
    8. 원심 분리기 PBMNCs 실온에서 10 분 동안 300 XG에, 뜨는을 대기음 및 폐기.
    9. 5 × 106 세포 / ml의 농도를 얻기 위해, 90 % FBS와 10 % DMSO를 함유하는 동결 배지 적당량 세포 펠렛을 재현 탁.
    10. 나누어지는 1 ml의 당 유리 병 (약 5 × 10 6 세포 / ㎖)에 컨테이너를 고정하는 제어 속도의 병을 동결 - 80 ° C. 더 긴 기간 동안 액체 질소에 보관 세포.

2. 해동 및 PBMNCs의 도금 (0 일)

  1. PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은.
    1. 버피 코트로부터 냉동 PBMNCs를 사용하는 프로토콜을 시작하기 위해 37 ℃에서 수욕에서 셀 1 바이알을 해동하고 2 ml의 최종 부피로 멸균 PBS과 버피 코트를 희석.
    2. , 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 희석 된 버피 코트를 전송 적혈구 용해 완충액 10 ㎖를 추가하고 RT에서 10 분 동안 배양한다.
    3. , 적혈구 용해 완충액 500 mL로 제조 중탄산 칼륨 0.5 g, 염화 암모늄 4.145 g, 초순수 500 ㎖, pH가 7.2-7.4 0.5 M EDTA 용액 100 μL를 추가한다.
    4. 멸균 PBS와 50ml로 전체 볼륨을 가져와 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
    5. 뜨는을 취소하고 멸균 PBS의 50 mL로 펠렛을 씻고, 실온에서 10 분 동안 300 XG에 버피 코트를 원심 분리기.
    6. 에서 세포를 재현 탁IMDM과 햄 F-12 (비율 1 : 1), 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 - 에탄올 아민 (ITS-X) 화학적 1 % 1 % 정의 지질 농축 PBMNC 배지 1 ㎖로 이전에 이루어지는 22 바와 (CDL), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, L- 아스코르브 산 0.005 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 %, 1- 티오 글리세롤 (최종 농도 200 μM) 세포 인자 SCF (100 NG / ㎖) 줄기, 인터루킨 -3 IL-3 (10 NG / ㎖) 에리트로 포이 에틴 EPO (2 U / ㎖), 인슐린 유사 성장 인자 IGF-1 (40 NG / ㎖), 덱사메타손 (1 μM) 및 홀로 트랜스페린 (100 μg의 / ㎖ ).
    7. 2 × 106 세포 / ml의 농도로, 도포하지 않고, 표준 조직 배양 처리 된 표면을 갖는 12 웰 플레이트의 한 웰로 이동. 변화하는 중간 단계까지 (섹션 3 참조), 37 ° C, 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 세포를 부화.
  2. PBMNCs는 밀도 구배 분리 후에 얻어진
    1. 후 냉동 PBMNCs를 사용하여 프로토콜을 시작하려면밀도 구배 분리, 해동 37 ℃ 수욕 중에서 세포의 1 바이알, PBMNC 배지 5 ㎖에 세포를 옮긴다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
    2. PBMNC 배지 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 2 × 106 세포 / ml의 농도에서, 12 웰 플레이트의 한 웰에 전송할. 변화하는 중간 단계까지 (섹션 3 참조), 37 ° C, 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 세포를 부화.

3. 문화 PBMNCs의 확장 (하루 2-13)

  1. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에, 1 ml의 팁과 피펫을 사용하여, 현탁 배양에 PBMNCs를 수집합니다.
  2. 뜨는을 취소하고 신선한 PBMNC 매체의 1 ml의 세포를 재현 탁.
  3. 코팅하지 않고, 표준 조직 배양 표면 처리 12 웰 플레이트의 한 우물에 세포를 전송하고, 가습 배양기에서 37 ℃, 5 % CO 2에서 그들을 품어.
    4. 이틀이 단계를 반복 한 비율 1의 세포를 분리.

에피 솜 플라스미드와 PBMNCs 4. 형질 (14 일)

참고 : 네 상업적 intergation없는 에피 솜 플라스미드의 분리를 수행 플라스미드 정제를위한 상업용 키트를 사용하여 다 능성 유전자를 운반하고 아가 로스 겔 분석을 사용하여 정제 된 플라스미드의 품질을 평가, 제조업체의 지시에 따라.

  1. 15ml의 원뿔형 튜브 PBMNCs 모아서 25 (트립 판 블루 배제 기준) 생존 세포 수를 계산.
  2. 원심 RT에서 10 분 동안 300 XG에 2 × 106 세포.
  3. 재현 탁 버퍼 T 100 ㎕의 각각의 플라스미드 DNA의 1 μg의 함유 형질 믹스 재현 탁 2 × 106 세포 (p53에 대해 OCT3 / 4 shRNA를 운반 한 플라스미드 한 플라스미드와 실시 SOX2 KLF4 번플라스미드는 L-MYC 및 LIN28을 들고, 한 플라스미드) 형질 전환 효율을 확인하기 위해, EGFP를 들고.
  4. 제조업체의 지시에 따라, 100 μL의 선단에 세포를 포함하는 형질 믹스 대기음 전기 기계의 피펫 스테이션에 배치 전해 버퍼 E2 3ml를 충전 튜브에 수직으로 샘플과 피펫을 삽입한다.
  5. 다음과 같은 프로그램을 사용하여 효율적으로 electroporate 세포 : 1,650 V, 10 밀리 초, 3 펄스.
  6. 0.25 mM의 나트륨 낙산 NAB ()을 첨가하고, 미리 예열 PBMNC 배지 2 ㎖로 일렉트로 세포 (2 × 106 세포)을 재현 탁하고 25 (트립 판 블루 배제 기준) 일렉트로 프로토콜 후 생존 세포의 수를 계산.
  7. 코팅없이 6- 웰 플레이트의 한 웰에 세포를 부드럽게 이동 판을 흔들고 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다.
  8. 전기, coun에 다음날형질 전환 효율을 평가하기 위해, 8-10 랜덤 필드에서 형광 현미경 하에서 GFP 양성 세포의 개수를 t.
  9. MEFs에 (제 6 장 참조)을 도금 할 때까지, 3 일간 분할하지 않고 형질 감염된 세포를 유지한다.
  10. 신선한 PBMNCs 매체 2 ㎖, 플러스 0.25 mM의의 NaB 이틀를 교체합니다.

5. 공동 문화의 피더 세포와 요리를 준비 (DAY 16)

  1. 코트 15 분간 기저막 매트릭스의 1 mL를 6- 웰 플레이트의 웰을 37 ° C에서와 FBS가 포함 된 2 ㎖의 10 %로 / 웰로 2 × 105 세포의 밀도로 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에)을 도금 DMEM (MEF 매체) MEF 피더 세포에 전기 천공 PBMNCs를 계대 전에 일일.

MEFs에 상 6. 도금 트랜의 PBMNCs (하루 17 ~ 19)

  1. 10 분 동안 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 형질 PBMNCs에, 1 ml의 팁과 피펫을 사용하여, 현탁 배양에 PBMNCs를 수집실온에서.
  2. mM의의 NaB을 뜨는을 취소하고 신선한 PBMNC 매체의 2 ml의 펠렛을 재현 탁 플러스 0.25.
  3. MEF 피복 6 웰 - 플레이트 상에 세포를 플레이트 및 가습 된 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다.
  4. 이틀, 배지를 흡인하고 DMEM (KO-DMEM), 20 %의 KO-세럼 교체 (KOSR), 1 mM의 NEAAs, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 mM의 녹아웃 이루어지는 IPSC 배지 2 ㎖로 대체 L- 글루타민, 0.1 MM의 β - 머 캅토 에탄올, 10 NG / ㎖ FGF (기본의 bFGF) 및 0.25 mM의의 NaB.
  5. 신선한 IPSC 매체의 2ml를 매일 교체하고 매일 세포를 확인합니다.
    참고 : 약 22 ~ 25 일에, iPSCs의 첫 번째 식민지 볼 수 있어야합니다.

7. 따기와 유도 만능 줄기 세포의 확장 (iPSCs) 클론 (하루 30 ~ 35)를

참고 : 형질 전환 후 30-35 일째, IPSC의 식민지 따기와 replating에 대한 준비를해야합니다. 프로그래밍 효율은 ESTI해야이전 26보고, IPSC 식민지 / electroporation하여 세포의 총 수의 수의 비율로 결합.

  1. IPSC 식민지를 계대 전날, 12 웰 플레이트 (1.25 × 10 5 세포 / 웰)에서 MEF 공급 장치를 준비합니다.
  2. 대기음은 MEF 매체는 10 NG / ㎖의 bFGF와 10 μm의 Y-27632와 IPSC 매체의 1 mL로 변경합니다. 수동, 그리드를 획득하기 위해 피킹 후드에서 해부 현미경 매번 바늘 한 콜로니와 해부 피펫 팅하여 작은 덩어​​리를 수집하고 MEFs에 코팅 12 웰 플레이트의 한 웰에 개별적으로 전송할.
  3. 더 전파를위한 4 : 1 비율로 다음이 각 6 웰 플레이트를 : 항로는 비율 1 6 웰 플레이트에 각 12 웰 플레이트를 확장. 해부 한 후 효소 분해 과정을 사용하여, (철저 단계 7.2에서 설명)는 제 2-3 구절에 대해 수동으로 iPSCs를 확장 (단계 7.4에서 시작).
  4. 효소 분해 프로토콜의 깨끗한 IPSC의 coloni따기 후드의 해부 현미경으로, 차별화 된 부분을 흡입하여 말이지.
  5. 37 ° C에서 10 분 동안 콜라게나 제 IV 중 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖)와 iPSCs 부화.
  6. 효소 솔루션을 대기음 KO-DMEM의 1 ml의 세포를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 식민지를 수집합니다. 실온에서 2 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
  7. 뜨는 대기음은 MEF 코팅 6 웰 플레이트에 10 NG / ㎖의 bFGF와 10 μm의 Y-27632 그들을 플레이트 IPSC 매체 2 ㎖의 식민지를 재현 탁 (비율 1 : 4).

iPSCs 8. 특성 (5-15 구절 사이)

  1. 알카라인 포스파타제 염색
    1. 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 3 ~ 5 일 동안 IPSC 식민지.
    2. 알칼리 포스 파타 아제 염색 프로토콜을 시작, PBS로 한 번 iPSCs를 씻어 후 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 1 ㎖로 고정합니다.
    3. 잔류 PFA을 제거하기 위해, PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
    4. 사용 얼룩 고정 세포제조업체의 지시에 따라 상용 알칼리성 포스파타제 염색 키트.
  2. 면역 형광
    1. 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 3 ~ 5 일 동안 IPSC 식민지.
    2. 면역 형광 분석을 시작하려면, PBS로 한 번 iPSCs를 세척 한 다음 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 1 ㎖로 고정합니다.
    3. 잔류 PFA을 제거하기 위해, PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
    4. RT에서 1 시간 동안 4 % 염소 혈청, 0.1 % BSA, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.05 % 아 지드 화 나트륨을 함유하는 용액을 차단 투과성으로 1 ㎖ / 비수 (NaN 3) 고정 iPSCs 치료.
    5. 차단 솔루션을 기음과 4 ° C에서 기본 3 % BSA의 항체와 0.05 % NaN의 3 솔루션 O / N로 고정 된 세포를 배양 (차 항체리스트의 재료 테이블을 확인하고 항체 희석 배수 제안).
    6. 다음 날, 그 다음 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스와 알렉사 플로리다와 세포를 품어, PBS로 iPSCs 세 번 씻어37 ° C에서 1 시간 동안, 3 % BSA 및 0.05 % NaN3가 용액에 1000 : 555 UOR 염소 항 - 토끼 항체, 1 희석.
    7. PBS로 세 번 세척 한 다음 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 DAPI (1μg / mL)로 핵을 얼룩.
  3. 배아 기관에서 iPSCs의 차별화 (사채)
    1. 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 5-6 일 동안 IPSC 식민지.
    2. 따기 후드의 해부 현미경, 흡입에 의해 IPSC 식민지에서 차별화 된 부분을 제거합니다.
    3. 37 ° C에서 10 분 동안 콜라게나 제 IV 중 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖)와 iPSCs 부화.
    4. 효소 솔루션을 대기음 KO-DMEM의 1 ml의 세포를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 식민지를 수집합니다. 실온에서 2 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
    5. 대기음 상등액과 2 KO-DMEM 이루어지는 EB 배지 ㎖, 20 %는 정의 된 소 태아 혈청 (FBS), 1 mM의 NEAAs, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 mM의 L 글루타민, 0.1 mm 단위 콜로니를 재현 탁46, 메르 캅토 에탄올.
    6. 구상 입체 배아 체 (사채)의 형성을 허용하기 위해, 매우 낮은 부착 6 웰 플레이트에 육일위한 현탁액 IPSC 식민지를 접시. 신선한 EB 배지 2 ㎖ 이틀을 변경합니다.
    7. 7 일에, 사채를 수집하고 EB 매체의 2 ㎖에 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 그들을 판 20 일 동안 분화 EBS을 (를) 유지.
    8. 신선한 EB 배지 2 ㎖ 이틀을 변경합니다.
  4. 유전자 발현 분석을위한 QRT-PCR
    1. 문화 10 NG / ㎖의 bFGF와 IPSC 매체 5-6 일 동안 IPSC 식민지.
    2. 제조업체의 지침에 따라 상업 시약 1 ㎖를 사용 PBMNCs, iPSCs 또는 사채로부터 전체 RNA를 추출합니다.
    3. 이러한 27 (260 / 280, 260 / 230 비율> 1.8 고품질의 RNA) 분광 광도계의 사용과 같은 적절한 방법에 의해 RNA 농도 및 순도를 평가합니다.
    4. 확인제조자의 프로토콜 (고품질 RNA의 RQI> 9.5) (28)에 따른 상업용 키트를 사용하여 RNA 무결성.
    5. 제조업체의 지시에 따라 상용 역전사 키트를 사용하여 전체 RNA 1 μg의에 역전사 반응을 수행한다.
    6. cDNA를 템플릿의 5 NG, 7.5 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스, 5 μm의 프라이머 2 μL 포함 qPCR에 혼합물 준비 (정 : 1 μL 및 역 : 1 μL) 및 각 반응 29의 RNase / DNase의없는 물 6 μl를.
    7. 45 ~ 60 ° C에서 10 분 동안 95 ° C에서 초기 변성 단계, 15 초 및 프라이머 어닐링 및 신장 단계에 대한 95 ℃에서 변성 단계로 나누어 40주기 다음에 다음 프로그램을 사용 QRT-PCR을 수행 초 29.
    8. 하우스 키핑 유전자 GAPDH (28)을 사용하는 다른 유전자의 발현을 정규화 (표 1 프라이머 참조).
  5. qPCR에형질 전환 유전자 제외에 대한
    1. 50 mM 트리스, 100 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨을 함유하는 용해 완충액 1 ㎖를 사용 PBMNCs 또는 iPSCs로부터 DNA 추출을 1 % 나트륨 도데 실 황산염 (SDS), 20 μg의 / ㎖ 프로 테 K.
    2. RT에서 5 분 동안 10,000 XG에서 DNA 침전 및 원심 분리를 허용하기 위해 세 번, 100 % 이소프로판올 동량 (1 ml)에 추가 반전 섞는다.
    3. , 상층 액을 버린다 실온에서 5 분 동안 10,000 XG에 70 % 에탄올과 원심 분리기 1 ml의 DNA 펠렛을 씻는다. 대기음은 상층 액을 버리고의 RNase / DNase를 무료 물에 재현 탁.
    4. 이러한 27 (260 / 280, 260 / 230 비율> 1.8 고품질의 RNA) 분광 광도계의 사용과 같은 적절한 방법에 의한 DNA 농도 및 순도를 평가합니다.
    5. (1 μL 및 역 : 1 μL 감기)과 6 DNA 주형의 5 NG, 7.5 μL SYBR 녹색 수퍼 믹스, 5 μm의 프라이머의 2 μl를 포함하는 qPCR에 혼합물을 준비# 181; 각 반응 29의 RNase / DNase의 무료 물 리터.
    6. (표 1 프라이머 참조) 하우스 키핑 유전자 (29) FBX-15를 사용하여 특정 에피 솜 플라스미드 EBNA-1 유전자의 발현을 정규화한다.
  6. 핵형 분석
    1. 문화 제조업체의 지침에 따라 iPSCs위한 상업 정의, 피더 무료 유지 보수 매체와 공급이없는 기저막 매트릭스 코팅 된 판에 5~6일에 대한 IPSC 식민지.
    2. 핵형 분석 프로토콜을 시작하기 위해, 단일 셀 분해를 획득 할 때까지 37 ° C에서 5 분 동안 세포 분리 용액 1 ㎖로 IPSC 콜로니를 분리.
    3. 실온에서 5 분 동안 400 XG에 세포와 원심 분리기를 수집합니다.
    4. 배지 2 ㎖로 재현 탁 iPSCs 구체적 산전 진단 기법을위한 세포를 배양하기 위해 개발. 기저막 매트릭스 코팅 유리 접시 상 접시 단세포 iPSCs하고, 37 ° C에서 그들을 부화 5 % CO 2 </ 서브> 인큐베이터.
    5. 2-4일 후, 배양 물에 직접적으로 10 μL / mL의 콜히친을 추가하고, 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 배양한다.
    6. 매체 대기음 RT에서 10 분 동안 저장성 용액 (0.6 % 나트륨 시트 레이트 및 0.13 % 염화칼륨) 1 ㎖에 iPSCs 배양한다.
    7. 5 % 아세트산 용액 1 ml의 세포를 씻어 메탄올 / 아세트산 용액과 iPSCs를 해결 (비율 3 : 1) 제어 온도 및 습도와 기계 (28 ° C, 42 % RH).
    8. 담그고 어둠 속에서 실온에서 15 ~ 20 분 퀴나 크린 솔루션으로 얼룩 고정 셀 (30) (Q-밴딩을 얻었다).
    9. 100X 배율 29, 형광 현미경으로 세포의 중기 획득.

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결과

이 연구에서 전혈을 원심 분리 및 밀도 구배 분리가보고 후의 PBMNCs의 프로그래밍과 비교 후에 냉동 버피 코트로부터 분리 PBMNCs의 리 프로그래밍에 의해 바이러스가없는 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜.도 1a는의 개략도를 도시 자세한 프로토콜입니다. 해동 후, 통상 둥근 형상을 도시 절연 PBMNCs은, 14 일 동안 특정 혈액 배양 배지 (도 1b)에서 팽창 된 후 에피 솜 플라스미드로 형질. 10-15일 후 형질 전환, 정의 마진과 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 가진 작은 둥근 밝은 식민지 후 (그림 1C)을 표시하기 시작. 약 20~30일 형질 전환 후, IPSC 식민지는, 날카로운 가장자리, 매우 컴팩트하게 자신의 크기를 늘리고 따기 및 확장 (그림 1D)에 대한 준비가되어 있습니다. 첫 번째 계대 단계 (2-3 유로) 한 후,IPSC 콜로니는 미분화 상태를 유지하고, 전형...

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토론

과거에는 유일한 방법은 특정 유전자 돌연변이를 운반 인간 다 능성 줄기 세포를 수득하는 착상 전 유전자 진단을받은 부모 모집 및 그 폐기 31,32 포배에서 배아 줄기 세포를 생성하는 것이다. 프로그래밍 방식을 사용하여, 연구자들은 지금 거의 모든 유전자형을 들고 환자 iPSCs를 생성 할 수 있습니다. 가능성은 환자 맞춤형 세포 라인에서 시작하고 장애의 병태 생리 및 새로운 치료 방법의 후속 식별의 조사를 할 수 있기 때문에 쉽게 접근 할 수있는 소스는 매우 중요합니다.

본 연구에서, 우리는 이미 냉동 버피 코트 PBMNCs에서 이전에 밀도 구배 분리 22 후 냉동 PBMNCs에서 iPSCs 성공적으로 생성 된 바이러스 무료 iPSCs을 생산에 적용하는 방법으로 플라스미드 접근 (15) 결합. 대신에 밀도 구배 분리 PBMNCs 모든 버피 코트의 이용우리는 샘플을 처리하는 동안 운영 비용, 작업 시간 및 수동 단계를...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 보건부와 교육지원부, 볼차노 자치주 대학 및 연구, 남부 티롤 스파크스 재단의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시트르산 나트륨 완충 Venosafe 플라스틱 튜브TerumoVF-054SBCS07
암모듐 클로라이드Sigma-AldrichA9434
중탄산 칼륨Sigma-Aldrich60339
EDTA 디소듐 분말Sigma-AldrichE51340.5 M 용액
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02밀도 구배 원심분리를 위한 폴리수크로오스 용액
Iscove의 변형된 Dulbecco's medium(IMDM) Gibco21056-023페놀이 없음
레드 햄의 F-12Mediatech10-080-CV
인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 (ITS -X)Gibco51500-056 1X (재고 : 100X)
화학적으로 정의 된 지질 농축액Gibco11905031 1X (재고 : 100X)
소 혈청 알부민 (BSA)시그마 - 알드리치A9418
L- 아스코르브 산 2- 인산 세스키 마그네슘 염 수화물시그마 - 알드리치A8960
1- 티오 글리세롤시그마 - 알드리치M6145200 µ에서의 최종 농도; M
재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (재고 : 100 µ g/ml) 
재조합 인간 인터루킨-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (재고: 10 µ g/ml)
재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (재고: 40 &마이크로; g/ml)
재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO)R& D 시스템 287-TC-5002 U/ml (재고: 50 U/ml)
덱사메타손 시그마-알드리치D29151 μ M (재고 : 1mM)
인간 홀로 트랜스 페린R & D 시스템 2914-HT100 &뮤; g/ml (재고: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016세포유전학 분석을 위한
배지 mTeSR1StemCell Technologies5850배지 iPSC 피더 프리 배양을 위한
Knockout DMEMGibco10829-018
Knockout Serum ReplacementGibco10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
L-글루타민 (200 mM)Gibco25030-024
MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)Gibco11140-050
2-메르캅토에탄올 Gibco31350-0100.1 mM (재고: 50 mM)
나트륨 부티레이트Sigma-AldrichB58870.25 mM (재고: 0.5 M)
재조합 인간 FGF 기본, 145 aa R& D 시스템 4114-TC10 ng/ml (재고: 10 &마이크로; g/ml)
Y-27632 디하이드로클로라이드시그마-알드리치Y0503 10 & 마이크로; M (재고 : 10 mM)
태아 정의 소 혈청HycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0.1 % 젤라틴 용액Merck-MilliporeES-006-B
Matrigel 기저 막 매트릭스 성장 인자 감소BD Biosciences354230
콜라겐 분해 효소, 유형 IVGibco17104-0191 mg / ml (재고 : 10 mg / ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007세포 분리 솔루션
마우스 배아 섬유아세포(CF1)글로벌 스템GSC-6201G1*106 cells/6 웰 플레이트
플라스미드 pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 &마이크로; g (재고 : 1 µ g/&마이크로; l)
플라스미드 pCXLE-hSKAddgene 270781 &마이크로; g (재고 : 1 µ g/&마이크로; l)
플라스미드 pCXLE-hULAddgene 270801 &마이크로; g (재고 : 1 µ g/&마이크로; l)
플라스미드 pCXLE-EGFPAddgene 270821 &마이크로; g (재고 : 1 µ g/&마이크로; l)
알칼리성 인산가수분해효소 염색 키트Stemgent00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) 항체Merck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 항체Merck-MilliporeMAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 항체Merck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4 항체Santa Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anti-Nanog 항체Santa Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anti-Troponin I 항체Santa Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) 항체Sigma-AldrichA77321/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) 항체Covance 리서치 프로덕츠 Inc MMS-435P-1001/500
안티-티로신 하이드록실라제 (TH) 항체Calbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 분자 프로브A-110291/1000
Alexa Fluor 555 염소 안티-토끼분자 프로브A-214291/1000
초저 부착 세포 배양 6-웰 플레이트Corning3471
Trizol 시약Ambion15596-018 RNA 추출용 시약
SuperScript VILO cDNA 합성 키트Invitrogen11754050역전사 효소 키트
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 Real-Time PCR 검출 시스템Bio-Rad185-5195
Experion 자동 전기영동 시스템Bio-Rad700-7000RNA 무결성 검사를 위한 기기
Experion RNA Highsense 분석 키트Bio-Rad7007105RNA 무결성을 확인하기 위한 시약 키트
해부 현미경(SteREO Discovery V12)Zeiss495007
NeonTransfection System 100 µ l 키트InvitrogenMPK10025electroporation 용 시약 키트
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000Instrument for electroporation
NanoDrop UV/Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-2000Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Plasmid purification kit
배지

참고문헌

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