유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.
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방법 논문
비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성
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이 논문에서
요약
초록
체세포 네 개의 전사 인자 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, C-Myc와)의 발현을 강제력에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)으로 재 프로그램 될 수 있고, 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 표명 . 때문에 인간 배아 줄기 세포와의 유사성, iPSCs는 인간 배아 줄기 세포와 관련된 윤리적 문제를 방지, 잠재적 인 환자 맞춤형 재생 의학을위한 중요한 도구가되고있다. 임상 적용에 적합한 세포를 얻기 위해서, 트랜스 프리 iPSCs은 트랜스 활성화, 변화된 유전자 발현 및 분화 잘못을 피하기 위해 생성 될 필요가있다. 또한, 고효율 및 저가의 리 프로그래밍 방법은 치료 목적을 위해 충분한 iPSCs를 유도 할 필요가있다. 이러한 요구를 감안할 때, 효율적인 비 통합 에피 솜 플라스미드 방법은 IPSC 유도를위한 바람직한 선택이 될 것입니다. 현재 프로그래밍을 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이 섬유 아세포는, 분리가있는 난 조직 생검을 요구환자에 대한 nvasive 수술. 따라서, 인간 말초 혈액 IPSC 생성에 가장 접근하고 최소 침습 조직을 나타낸다.
이 연구에서, 비 통합 에피 솜 플라스미드를 이용하여 비용 효율적이고 바이러스가없는 프로토콜은 전혈을 원심 분리 한 후 밀도 구배 분리없이 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)로부터 iPSCs의 생성을 위해보고된다.
서론
2006 년 신야 야마나카 하나의 그룹은 성인 쥐와 인간에서 체세포 네 프로그래밍 요소 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, 이소성 발현하여 능성 상태로 전환 될 수 있음을 최초로 입증 C-Myc와), 소위 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 2를 생성하는 단계를 포함한다. 특정 환자 iPSCs 밀접 형태, 증식 및 세 생식 세포 유형 (중배엽, 내배엽 및 외배엽)로 분화 할 수있는 능력의 관점에서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 인간 배아 줄기 세포 및 바이 패싱의 용도에 관련된 윤리적 문제 부족한 반면 가능한 면역 거부 3. 따라서, iPSCs는 기초 연구, 약물 검사, 질병 모델링, 독성 평가, 재생 의학 목적으로 4 환자 맞춤형 세포의 가장 중요한 소스 중 하나로 나타납니다.
몇 가지 접근 방법은 IPSC 생성을 위해 사용되어왔다 : 바이러스 통합 벡터를(5 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 6), 바이러스의 비 - 통합 벡터 (아데노 7), 센다이 바이러스 8 BAC 트랜스포존 9, 에피 솜 벡터 (1....
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프로토콜
말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs)는 후 동의서와 남부 티롤 지방의 윤리위원회의 승인을 체결 건강한 기증자의 인간의 말초 혈액에서 분리 하였다. 실험은 헬싱키 선언 표현 원리에 따라 수행되었다. 모든 데이터를 수집하고 익명으로 분석 하였다.
말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMNCs)
- PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은.
- 시트르산 나트륨으로 정맥 말초 혈액 8ml의 수집은 RT (25 ° C)에서 플라스틱 튜브, 저장 버퍼링. 수집 후 12 시간 이내에 처리 혈액입니다.
- 스위칭 오프 원심 브레이크, 스윙 버킷 회에서 4 ° C에서 15 분 동안 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 흐린 버피 코트 (플라즈마 상부 상과 하부 층 사이에 모아서위상 cryovial 튜브에 PBMNC 농축 분획 (500 μL)를 포함) 적혈구의 대부분을 함유.
- 10 % DMSO의 농도는 1 ml의 총 부피를 얻기 위해 90 % FBS와 20 % DMSO를 함유하는 2 × 동결 배지 500 μL와 버피 코트 500 μl를 재현 탁.
- -80 ° C로 제어 된 레이트 냉동 컨테이너 바이알 동결. 더 ....
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결과
이 연구에서 전혈을 원심 분리 및 밀도 구배 분리가보고 후의 PBMNCs의 프로그래밍과 비교 후에 냉동 버피 코트로부터 분리 PBMNCs의 리 프로그래밍에 의해 바이러스가없는 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜.도 1a는의 개략도를 도시 자세한 프로토콜입니다. 해동 후, 통상 둥근 형상을 도시 절연 PBMNCs은, 14 일 동안 특정 혈액 배양 배지 (도 1b)에서 팽창 된 후 에피 솜 플라스미드로 형질. 10-15일 후 형질 전환, 정의 마진과 배아 줄기 세포와 유사한 형태를 가진 작은 둥근 밝은 식민지 후 (그림 1C)을 표시하기 시작. 약 20~30일 형질 전환 후, IPSC 식민지는, 날카로운 가장자리, 매우 컴팩트하게 자신의 크기를 늘리고 따기 및 확장 (그림 1D)에 대한 준비가되어 있습니다. 첫 번째 계대 단계 (2-3 유로) 한 후,IPSC 콜로니는 미분화 상태를 유지하고, 전형.......
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토론
과거에는 유일한 방법은 특정 유전자 돌연변이를 운반 인간 다 능성 줄기 세포를 수득하는 착상 전 유전자 진단을받은 부모 모집 및 그 폐기 31,32 포배에서 배아 줄기 세포를 생성하는 것이다. 프로그래밍 방식을 사용하여, 연구자들은 지금 거의 모든 유전자형을 들고 환자 iPSCs를 생성 할 수 있습니다. 가능성은 환자 맞춤형 세포 라인에서 시작하고 장애의 병태 생리 및 새로운 치료 방법의 후속 식별의 조사를 할 수 있기 때문에 쉽게 접근 할 수있는 소스는 매우 중요합니다.
본 연구에서, 우리는 이미 냉동 버피 코트 PBMNCs에서 이전에 밀도 구배 분리 22 후 냉동 PBMNCs에서 iPSCs 성공적으로 생성 된 바이러스 무료 iPSCs을 생산에 적용하는 방법으로 플라스미드 접근 (15) 결합. 대신에 밀도 구배 분리 PBMNCs 모든 버피 코트의 이용우리는 샘플을 처리하는 동안 운영 비용, 작업 시간 및 수동 단계를.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 보건부와 교육지원부, 볼차노 자치주 대학 및 연구, 남부 티롤 스파크스 재단의 지원을 받았습니다.
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재료
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참고문헌
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from f....
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