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방법 논문

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52889

⸱

2015년 6월 19일

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 식품에서 클래스 1 인테그론 및 관련 유전자 카세트의 검출을 설명합니다.

초록

항생제 내성은 21세기의 건강을 위협하는 가장 큰 요인 중 하나입니다. 측면 유전자 전달을 통한 내성 유전자의 획득은 다양한 내성 기전을 확산시키는 주요 요인입니다. 측면 전달을 촉진하는 DNA 요소 중 1등급 인테그론은 그람 음성 병원체에 항생제 내성 결정 요인을 퍼뜨리는 데 크게 기여했습니다. 이러한 인테그론은 총 130개 이상의 다양한 항생제 내성 유전자를 획득하고 전파했습니다. 지속적인 항생제 사용으로 1등급 인테그론은 인간과 가축화된 동물의 공생체와 병원체에서 유비쿼터스가 되었습니다. 그 결과, 그들은 이제 모든 인간 배설물에서 발견될 수 있으며, 그곳에서 그들은 계속해서 새로운 유전자를 획득하고 먹이 사슬을 통해 인간에게 다시 순환할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 배양 및 PCR을 사용하여 식품에서 클래스 1 인테그론 및 관련 저항성 유전자 카세트를 검출하기 위한 간소화된 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 연구자는 다음을 수행할 수 있어야 합니다.농축 배양을 만들고 클래스 1 인테그론을 스크리닝하기 위해 샘플을 수집 및 준비합니다. integron 양성 분리물을 식별하기 위해 단일 박테리아 군집을 격리합니다. Class 1 Integron을 포함하는 박테리아 종을 식별합니다. 이러한 인테그론 및 관련 유전자 카세트를 특성화합니다.

서론

항생제의 발견은 20 세기의 가장 위대한 과학적 업적 중 하나였다. 그러나, 항생제의 사용 및 남용 항생제 내성균의 급속한 발전을 주도하고 있으며, 이들은 지금 21 세기 공중 보건에 심각한 위협. 대부분의 치료 옵션에 대한 내성 균주의 증가는 우리가 항균 약물이 더 이상 1,2 효과적 시대를 입력 할 수있는 가능성을 제기한다.

항생제 내성을 부여 유전 기계 년 3 수백만의 인간과 항생제 선택 압력을 낳은, 고대 시스템입니다. 이러한 플라스미드, 트랜스포존, 게놈 섬, 통합 공역 요소와 integrons 모바일 유전 적 요소, 내 세균 종 4 사이에 모두 항생제 내성 유전자 (ARG)를 배포 할 수 있습니다. 이들 중에서는 integrons 불구 ARG의 확산에 중요한 역할을 해왔다그들은 박테리아 게놈 5에 플라스미드 및 동원 및 삽입 트랜스포존에 의존한다는 사실. Integrons는 integron-인테그라를 이용한 유전자 카세트를 캡처하고 인코딩 integron -6,7- 프로모터 (도 1)를 이용하여 카세트를 표현한다. 유전자 Integron 카세트는 누구의 제품 항생제 나 소독제 (8)에 대한 내성을 부여 할 수 있습니다 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 구성된 소형 모바일 요소입니다. 클래스 1 integrons은 가장 일반적으로 그들이 집단적으로 (130) 다른 항생제 내성 유전자 카세트 (9)을 통해 획득 한 임상 분리 5에서 회복 integrons 있습니다.

인간 관련된 공생과 병원성 세균에 클래스 1 integrons의 확산은 이러한 유전 적 요소 (10)의 큰 숫자를 포함하는 인간의 폐기물을 생성합니다. 클래스 1 integrons를 포함 약 10 (19) 박테리아는 하수 슬러지 매년 전을 통해 출시n은 영국 (11). 그것은 항생제 저항을 부여 클래스 1 integrons 지금은 야생 조류, 물고기, 그리고 다른 나라의 야생 동물 12-14의 미생물 검출되고 있다는 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 새로운 유전자 카세트 및 기타 모바일 요소와 복잡한 재 배열의 인수는 특히 하수 처리장 및 기타 수역 15-18에서 계속 발생 이후 다시 환경으로 integrons을 떼면, 중요한 공중 보건 위협. 자연 환경은 새로운 저항의 결정 요인과 기회 병원균 (19, 20)를위한 비옥 한 모집 땅이된다. 소설 integron 함유 세균과 새로운 인수는 오염 된 물과 음식 (21, 22)을 통해 인간 사회에 다시 동그라미를 할 수 있습니다. 환경 감시 인수의 이해와 미래 23 항생제 내성을 관리하는 키 전략이다. 특히,주의 원 먹거나되는 식품에 지불해야한다이러한 새로운 모바일 요소와 병원체의 전송을위한 가장 큰 위협이 있기 때문에 가볍게 요리.

이 프로토콜, 1 integrons 및 식품에 연관된 유전자 카세트, 탐지 식별하고 클래스의 특성에 대한 효율적인 접근 방법 (그림 2) 설명되어 있습니다. 배양 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 조합을 사용하여, 신속 integrons 복잡한 세균 공동체 및 개별 분리 물에서 검출 될 수있다. 박테리아와 integron 관련 유전자 카세트의 형태와 정체성의 종류를 식별하기위한 방법이 제공됩니다. 방법은 식물과 동물 식품 광범위한 적합하고, 통상적 인 작업 흐름의 예는 이들 식품 유형마다 주어진다.

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프로토콜

원시 먹거나 가볍게 조리 식품은 인간의 건강에 가장 관심사이다. 예를 들면 샐러드 야채, 과일, 어패류와 갑각류를 포함한다.

1. 샘플 컬렉션

  1. 오염을 최소화 조건에서 샘플을 수집 및 전송시 별도의 청소 가방에 저장된다. 수집되면, 샘플은 4 ℃에서 보관하고 24 시간 이내에 처리해야한다.

2. 농축 문화 준비

  1. 과일과 야채 :
    1. 튼튼한 비닐 봉지에 재료의 약 10g을 놓습니다. 큰 재료를 처리하는 경우, 청과물의 피부에 집중한다. 30 초 동안 패들 블렌더에 90 ml의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 및 프로세스를 추가한다. 패들 믹서를 사용할 수없는 경우, 대안 적으로, 재료는 수동으로 교반 할 수있다.
    2. 이 50 ㎖ 팔콘 튜브에 액체를 수집합니다. 펠렛 박테리아에 7 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 튜브.
    3. 조심스럽게 멸균 루리아 베르 타니 (LB) 배지 30 ml의 펠렛 박테리아를 뜨는을 제거하고 일시 중지합니다.
    4. 37 ° C에서 다른 25 ° C에서 하나의 튜브를 잡고, 통 O / N에 품어. 문화는 분당 200 진동 (OPM)에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다.
  2. 해산물 :
    1. 멸균 된 핀셋 및 핀셋을 사용하여 위장 (굴) 또는 소화관 (새우)를 해부하고 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0의 200 μl를 함유하는 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 균질를 만들 수있는 샘플을 담가서 부드럽게.
    2. 이 멸균을 5 ml 튜브에 LB 배지 5 mL를 분배하고, 해산물 균질 각각 접종.
    3. 25 ° C와 다른 37 ° C에서 하나의 튜브를 들고, 셰이커 O / N에 품어. 문화는 200 OPM에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다.

Integrons 3. 선별 문화

주 : 표준 PCR 프로토콜 효소가 공급 버퍼를 이용하여,이 방법론에 걸쳐 사용하고, 2.5 mm의 최종 농도의 MgCl 2. 필요한 경우, 로렌스 (2011) (24)는이 저널의 이전 문제에 PCR 최적화 및 문제 해결 방법을 설명하고있다.

  1. 삶은 DNA 준비 :
    1. 멸균 0.5 ㎖의 PCR 튜브에 풍부한 문화의 100 μl를 분배. 수욕 또는 열차 단을 사용하여, 10 분간 99 ° C로 샘플을 가열한다. 2 분 동안 얼음에 진정을 스냅.
    2. 5 분 14,000 XG에 마이크로 원심은 세포 파편 펠렛합니다. 얼음으로 돌아갑니다. DNA 샘플은 요구 될 때까지 -20 ℃에서 냉동 될 수 있지만, 얼음 위에서 해동되어야한다.
  2. PCR을 사용하여 클래스 1 integrons 선별 :
    참고 : O / N 배양에서 혼합 문화가 HS463a / HS464 PCR 프로토콜 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integrons 상영된다.
    1. 잠재적 SOU에서 멀리, 얼음에 모든 PCR 시약을 녹여DNA를 오염의 경우 RCEs. 음성 대조군 (표 2)를 포함하여, 샘플 당 48 μL의 PCR mastermix을 확인합니다. 배리어 팁을 사용하여, 각각의 튜브에 PCR 마스터 믹스의 48 μl를 분배.
    2. 장벽 팁을 사용하여 개별 PCR 튜브에 해동 DNA의 2 μl를 추가합니다. PCR의 열 순환기에 적절한 프로그램을 실행합니다.
    3. 증폭의 결과를 평가하기 붓고 TBE 완충액 (90 mM 트리스 - 보레이트, 2 mM의 EDTA)에서 실행되는 2 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물 7 μl를 electrophorese. 100 bp의 사다리 같은 분자량 마커를 포함한다.
    4. 포스트 DNA 얼룩 겔을 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 음성 대조군에서 더 증폭이 없었다 있는지 확인합니다. 특정 샘플에 대한 약 470 BP에 강한 밴드가 혼합 된 문화 클래스 1 integron을 가지고 박테리아가 포함되어 있음을 나타냅니다. 순수한 식민지 이제 긍정적 인 PCR을 반환 된 혼합 된 문화에서 고립 될 것이다.

4. 클래스 1 Integrons을위한 단일 콜로니의 심사

  1. 직렬 희석 및 확산 판 :
    주 : PCR 양성 혼합 배양 물로부터 단일 콜로니를 분리는, 혼합 배양 직렬 인산 나트륨 완충액에서 10 배 희석 한 후 단일 콜로니를 복구하기 위해 도금된다.
    1. 0.1M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 9 ml의 혼합 문화의 한 ML을 추가하고 반전에 의해 혼합. 10-8의 일련의 희석 될 때까지 인산염 버퍼의 또 9 ml의 희석 1 mL를 넣어 반복하는 것은 도달한다.
    2. 중복, LB 한천 상 10-4 -8 10 희석액 100 ㎕를 확산. 초기의 혼합 배양에 사용 된 동일 온도에서 플레이트 O / N을 부화. 플레이트는 그러나 그것은 매우 신속하게 단일 콜로니를 처리하는 것이 가장 좋습니다, 필요한 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 단일 콜로니 선택과 삶은 DNA 준비 :
    1. 자체 직렬 희석 판에서 하나의 식민지를 선택이러한 콜로니의 크기, 모양, 색 등의 기준을 사용하여 가능한 한 많은 다른 유형의 콜로니 lecting. 확산 판에서 하나의 식민지를 선택 멸균 이쑤시개를 사용합니다.
    2. 식민지에 이쑤시개를 터치 한 다음 멸균 물 100 μl를 포함하는 PCR 튜브에 전송할 수 있습니다. 콜로니 다수가 상영되어야하는 경우, 콜로니에서 마이크로 타이 터 트레이를 제조 할 수있다. 물에 일부 셀을 제거하는 손가락 사이 이쑤시개 스핀.
    3. 동일한 이쑤시개를 이용하여 콜로니의 연속로 LB 플레이트에 접종. 각 연속 약 1cm 길면 큰 콜로니 번호 표지 플레이트 상에 저장 될 수있다. 당신이 분리의 적절한 수를 선택할 때까지 3 단계 1을 반복합니다.
    4. 초기의 농축 된 배양에 사용 된 것과 동일 온도에서, LB 플레이트 O / N을 부화. 필요한까지 배양 후 4 ℃에서 저장 될 수있다.
    5. 세균 현탁액에서 DNA를 제조, OU 등의 단계를 따릅니다3.1 절에 tlined. 3.2 절에 설명 된대로 순수 배양 용 해물의 심사를 들어, HS463a / HS464 PCR을 수행합니다. 즉 양성 PCR은 게놈 DNA (5 장)의 제조에 사용하고, 또한 분석을 위해 복귀한다 분리합니다.

구슬이 25 잔 사용 (5)의 게놈 DNA를 추출 Integron 양성 단일 콜로니

  1. 4.2 절에 고립 된 순수 문화의 샘플 LB 배지 5 mL를 접종한다. 초기 농축 배양에 사용 된 동일한 온도에서 떨고, O / N을 품어.
  2. 펠렛 세포는 7 분 동안 4,000 XG에서, 다음 상층 액을 제거합니다. 용균 매트릭스 E 빨리 준비 튜브에서 1 mL의 CLS-TC 용액 중에 펠렛 세포를 재현 탁. 비드 박동 기계를 사용하여, 30 초 동안 5.5 m / sec의 샘플을 처리합니다.
  3. 원심 분리기 5 분 14,000 XG에 튜브 및 멸균 1.5 ML 튜브에 뜨는 70​​0 μl를 복구 할 수 있습니다.
  4. 6 M의 구안과 5 : 1로 희석 결합 매트릭스의 700 μl를 추가idinium 티오 시아 네이트는 5 분 동안 실온에서 혼합한다. 1 분, 폐기 뜨는 14,000 XG에 원심 분리기.
  5. 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 800 ㎕의 염수 세척 에탄올 (70 % 에탄올, 0.1 M 아세트산 나트륨) 및 소용돌이를 추가한다. 1 분 동안 14,000 XG에 실온에서 5 분, 원심 분리기에 대한 세척하고 상층 액을 버린다. 다음 5 분 동안 공기 건조하도록 허용 필요한 경우 마이크로 피펫을 사용하여, 모든 상층 액이 제거 된 확인합니다.
  6. 로 pipetting 아래 200 ㎕의 TE (10 mM 트리스 - 염산, 1mM의 EDTA, pH를 7.6)의 펠렛 행렬을 재현 탁. 3 분 동안 실온에서 품어. 3 분 및 멸균 튜브에 전송 용출 된 DNA의 160 μl를 14,000 XG에 원심 분리기. DNA 추출 수율 및 무결성을 확인하는 2 % w / v를 아가 로스 겔에서 게놈 DNA 추출의 분취 량을 실행. 정제 된 게놈 DNA는 -20 ° C에서 저장 및 PCR 시험을 위해 필요할 때 얼음에 해동된다.

6. 진단의 PCR 및 DNA 시퀀싱

참고 :섹션 5에서 제조 게놈 DNA는 모든 진단의 PCR에 사용되며, 클래스 1 integrons에 대한 양성 반응을 확인합니다.

  1. 간단히 20 초 동안 14,000 XG에서 DNA 샘플 및 펄스 스핀 와동, 얼음에 게놈 DNA를 녹여. 분리가 471 bp의 증폭 물 (3.2 절)에 대한 긍정적 인 것을 확인한 HS463a / HS464 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integron - 인테그라 유전자에 대한 PCR을 반복합니다.
  2. 종 양성 문화 수준의 식별 작은 소단위 rRNA 유전자 (16S rDNA 염기)를 분석함으로써 달성된다. 프라이머 F27 / r1492 (표 1)를 사용하여 유전자를 증폭 16S. 전기를 사용하여 PCR 제품을 확인합니다. 모든 박테리아 타겟은 약 1,450 BP의 16S 증폭 물을 생성한다.
  3. 시퀀스 16S rRNA 유전자 증폭 물은 종의 신분을 확인하는,하지만 같은 종의 박테리아 수 있습니다 단계 6.2에서 여러 긍정적 인 PCR들을 될 가능성, 이러한 긍정적 많은 있기 때문에, 우리는 먼저저기서 다른 종을 구별한다16S PCR 생성물 g 제한 소화.
    1. 제한 효소 Hinf 1 16S PCR의 분취 다이제스트. 상관 4 BP 절단 부위는 인식 할 것이다 효소하지만 Hinf 1 16S 타겟으로부터 양호한 다이버 시티를 생성하고, 신뢰성, 저렴 효소이다.
  4. 30 μL 제한은 멸균 튜브에 mastermix (표 2) 소화되지 않은 purfied 16S PCR 산물 20 μL를 추가 설정합니다. 37 ° C의 물을 욕조의 O / N에 품어. 2 % 아가 로스 겔에 다이제스트를 확인합니다.
  5. Hinf 일 소화에 의해 생성 된 패턴 점수. 동일한 16S 제한 프로파일과 균주 같은 종 될 가능성이 높다. 오히려 각 Hinf 1 제한 패턴의 가장 세 대표에 모든 16S PCR 제품, 순서를 시퀀싱보다.
  6. 상업용 키트를 사용하여 PCR (16S)의 제품을 정제. 단일 가닥 엑소 뉴 클레아 키트를 사용할 수 있지만, 열 기반 또는 석출 방법도 uninc 제거 잘 작동orporated 프라이머 및 단일 가닥 DNA를. 서열 프라이머 R910 (표 1)를 이용하여 시퀀싱 기능에 의해 지정된대로 반응을 설정 16S 증폭.
  7. BLASTN 기능 (함께 NCBI의 DNA 데이터베이스를 심문 얻어진 DNA 서열을 사용 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). 보다 큰 97 %의 염기 ID는 보통 종의 신분으로한다.

7. 매핑 및 Integrons 및 카세트 배열의 특성

참고 : 인간이 지배하는 생태계에서 나오는 1 급 integrons은 모든 시료에서 가장 흔한 integrons 될 가능성이 있습니다. 이러한 integrons 모든 최근 단일 기점을 가지며, 따라서 고도로 보존 된 DNA 서열 (5)를 갖는다.

  1. 클래스 사이에 한 사람의 소스에서 나오는 integrons과를 수행하여 환경 시료에서 자연적으로 발생하는 것과 차별화프라이머와 PCR을 intI1F165 / intI1R476 10 (표 1)을 설정합니다.
    참고 : 환경 클래스 1 integrons이 제품을 생성하지 않습니다 동안 임상 또는 공생 박테리아에서 1 등급 integrons는 ~ 300 bp의 제품을 생성합니다.
  2. 프라이머 세트 HS458 / HS459와 카세트 배열을 증폭하여 임상 integrons을 특성화. 이 PCR은 가장 카세트 배열 intI1 말단과 3 '보존 된 세그먼트 사이의 영역을 증폭한다. 카세트의 번호 및 ID가 가변이기 때문에, PCR 산물의 크기도 달라진다.
  3. 증폭 산물을 정제하고 증폭 프라이머를 이용하여 각 DNA 시퀀싱. BLASTN 기능 (사용의 DNA 데이터베이스 심문 시퀀스를 사용 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi을 ).
  4. integron 유전자 카세트에 대한 많은 데이터 침착하기 때문에, 표준화 된 명칭 (9)에 따라 카세트의 이름을 확인합니다S는 일관성이 없거나 모호한 이름을 사용합니다. 이러한 전달률, 병원성 또는 독성 8,21 증가하는 유전자를 포함, 새로운 표현형을 인코딩 할 수 있기 때문에, 새로운 유전자 카세트에 특히주의를주십시오.
    참고 : 클래스 1 integron의 전임상 형태는 여전히 자연 환경에 순환. 특히, 활성 테네시 (402) 트랜스포존에 링크 된 것을 가장 관심 (26)의이다. 이러한 integrons의 카세트 배열 프라이머 세트 HS458 / HS459으로 증폭되지 않지만 카세트 콘텐츠에 종속 변수 크기의 증폭 물을 생성 MRG284 / MRG285 프라이머 세트 (표 1)로 증폭 될 수있다. PCR 제품은 정제 및 7.2에 설명 된대로 DNA는 염기 서열을해야합니다.

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결과

혼합 문화와 intI1에 대한 박테리아 균주의 선별

프라이머 세트 HS463a / HS464 PCR은 클래스 1 integron-인테그라 유전자 intI1 (도 1)의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프라이머 세트는 혼합 된 문화에서 intI1을 검출 잘 작동하고, 또한 확산 판 (그림 2)에서 수확 박테리아 콜로니를 선별하는 데 사용됩니다. 긍정적 인 균주는이 프라이머 세트 (그림 3A)를 사용하여 471 BP에 하나의 강한 밴드를 생성해야합니다. 긍정적 인 균주의 대부분은 인간 또는 농업과 가축에서 유래했다 intI1을 수행한다. 이 균주는 311 bp의 증폭 물 (그림 1)를 생성한다 PCR을 이용하여 프라이머 F165 / R476, 긍정적 인 것입니다. intI1의 환경 소스는 일반적으...

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토론

integrons과 연관된 유전자 카세트의 식별은 잠재적으로 새로운 기회 병원체의 출현을 예측 인간 먹이 사슬에 병원체에 대한 경로를 추적 및 식별하는 새로운 저항에 중요한 단계이며 독성이 8,21,26를 결정. 이 논문의 목적은, 클래스 1 integrons에 대한 샘플을 선별 자신의 카세트 배열을 특성화하고 상주하는 세균의 종을 식별하기위한 효율적인 방법을 설명했다. 프로토콜의 중요한 단계는 좋은 미생물 연습을 포함하고, PCR 오염을 방지하는 오탐 (false positive)을 생성 할 것이라고.

여기에 설명 된 프로토콜을 용이하게 또한 인간 병원체에서 발견되는 클래스 2 및 클래스 3 integrons 포함한 다른 임상 적 integrons을 검출하도록 변경 될 수있다. 또한 물, 바이오 필름, 토양, 퇴적물에서 미생물 군집에 integrons을 감지 수정할 수 있습니다. 일부 limitatio이 있습니다박테리아 세포의 배양에 의존에서 발생이 기술...

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공개 사항

저자는 공개 관련 아무것도 없다.

감사의 글

미카엘라 홀, 라리사 스포 및 기술 지원에 대한 구스타보 타바레스에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GoTaq 무색 MastermixPromegaM7132모든 PCR에 사용
RNAse (소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A)SigmaR6513-10MG모든 PCR에 사용
HinFI 제한 효소PromegaR620116S rDNA PCR poducts를 소화하는 데 사용됩니다. 효소는 최적의 완충액과 BSA
100 bp 사다리GE Healthcare27400701모든 아가로 스 젤의 크기 표준으로 사용됩니다
GelRed DNA 염색Biotium41003주의 : 이 물질을 취급 할 때는 개인 보호구를 착용해야합니다
Guanidinium thiocyanateLife TechnologiesAM9422주의 :이 물질을 취급 할 때는 개인 보호구를 착용해야합니다
CLS-TC 솔루션MP Biomedicals6540409게놈 DNA 추출 시작 부분에 사용되는 재현탁 솔루션
Lysing Matrix E, FastPrep 튜브MP Biomedicals116914500Tube, 박테리아 세포벽의 기계적 파괴에 필요. 이 코드는 500개의 튜브 팩에 사용되며 더 적은 수량을 사용할 수 있습니다.
결합 매트릭스MP Biomedicals1165404086M 구아니디늄 티오시아네이트로 1:5로 희석하여 게놈 DNA 추출 방법에 사용됩니다.
패스트 프렙 기계MP Biomedicals사용 가능한 옵션 수MP Biomedicals에는 여러 FastPrep 기계를 구입할 수 있습니다. 자세한 내용은 http://www.mpbio.com를 참조하십시오
와 함께 제공됩니다 : , , , .

참고문헌

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